慢性牙周炎患者中牙龈卟啉单胞菌的检测及致病岛Rag基因的初步研究

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌及致病岛Rag基因与慢性牙周炎的关系.方法 收集慢性牙周炎患者的134个龈沟液样本,另选牙龈健康者的28个龈沟液样本作为对照组,采用PCR技术检测牙龈卟啉单胞菌及致病岛Rag基因,分析牙龈卟啉单胞菌及致病岛Rag基因在不同病变位点的分布.结果 经16S rDNA聚合酶链式反应(PCR)法检测,病变位点牙龈卟啉单胞菌检出率为73.13％,对照组阳性率为46.43％,牙周炎组明显高于对照组,两者之间比较差异有显著性(P＜0.01).经多重PCR检测,111个P.gingivalis阳性的龈沟液样本中,共扩增出Rag基因的有88例,阳性率为79.27％.结论 牙龈卟啉单胞菌及致病岛Rag基因与慢性牙周炎的发生、发展密切相关.     

牙龈卟啉单胞菌感染致患者慢性牙周炎发病的可能机制研究

目的:探讨牙龈卟啉单胞菌感染致患者慢性牙周炎发病的可能机制。方法:选取行慢性牙周炎拔牙治疗的患者128例作为观察组,以同期进行健康体检的牙周健康的128例健康人员作为对照组。采用实时荧光PCR对两组牙龈卟啉单胞菌进行检测,于无菌条件下刮取超过1/3的牙周膜组织,部分细胞采用牙龈卟啉单胞菌ACTT33277进行感染,部分不进行感染处理。采用Western Blot对NLRP3蛋白进行检测,采用酶联免疫吸附法对白细胞介素-1β(IL-1β)与IL-18的表达情况进行检测。结果:观察组牙龈卟啉单胞菌阳性率为82.0%,显著高于对照组牙龈卟啉单胞菌阳性率(18.0%),差异有统计学意义(P<0.01);在5 mm、6 mm、7 mm的探诊深度时,观察组牙龈卟啉单胞菌浓度均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);观察组进行人工牙龈卟啉单胞菌感染的牙周膜细胞的NLRP3、IL-1β与IL-18表达水平显著高于未进行人工牙龈卟啉单胞菌感染的牙周膜细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:牙龈卟啉单胞菌感染可能导致慢性牙周炎,NLRP3、IL-1β与IL-18的高表达可能参与其发病机制。     

牙周炎患者唾液和龈下菌斑3种厌氧微生物的检测

目的：分析不同类型牙周炎患者唾液和集合龈下菌斑中3种厌氧微生物（包括牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体）的检出率,并探讨唾液中3种微生物的存在状况与牙周临床指标的关系。方法：收集50例侵袭性牙周炎（aggressive periodontitis, AgP）、48例慢性牙周炎（chronic periodontitis, CP）患者和25例非牙周炎者的非刺激性唾液和集合龈下菌斑,应用PCR技术检测两种样本中的牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体。结果：3种微生物在AgP组、CP组唾液和龈下菌斑中的检出率均显著高于非牙周炎组（P<0.01）。牙龈卟啉单胞菌在龈下菌斑和唾液中的检出率分别为：AgP组100% vs 100%,CP组93.8% vs 93.8%,非牙周炎组为32% vs 48%。福赛坦氏菌在龈下菌斑和唾液中的检出率为：AgP组96% vs 88%,CP组97.9% vs 89.6%,非牙周炎组为32% vs 24%。齿垢密螺旋体在龈下菌斑和唾液中的检出率为：AgP组94% vs 86%,CP组89.6% vs 70.8%,非牙周炎组12% vs 16%。3种微生物在同一患者两种样本检测结果的一致性均较高。唾液中存在3种微生物均与牙龈出血指数密切相关,其中牙龈卟啉单胞菌的OR值高达13.5。结论：牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体广泛存在于AgP和CP患者的唾液和龈下菌斑中。唾液中牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体的检出状况与牙周临床指标密切相关,唾液样本可以用于口腔内牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体的检测。     

海军舰艇人员长航后龈下菌斑3种细菌分布

目的探讨3种细菌在长航后舰艇队员龈下菌斑中的分布及其致病机理。方法收集80例长航后舰艇人员龈下菌斑,按照牙龈指数（Gingival Index,GI）分为三组：1组GI=0,2组GI=1,3组GI=2或3。采用PCR方法分别检测三组牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体的分布。结果1组牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体的检出率分别为19.05%、52.38%、19.05%,2组分别为18.75%、65.63%、40.63%,3组分别为18.52%、81.48%、44.44%。牙龈卟啉单胞菌在三组间的检出率无统计学意义（P〉0.05）;其余两种细菌在2、3组的检出率均高于1组（P〈0.05）。结论福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体单独或联合感染与长航后舰艇官兵牙龈炎症密切相关。     

4种提取口腔产黑色素细菌DNA方法的比较

目的 比较4种提取口腔产黑色素细菌中间普氏菌DNA的方法,即酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取法、Chelex-100提取法及试剂盒.方法 分别记录OD260、OD230、OD280及OD340值;聚合酶链反应(PCR)电泳,检测提取DNA的浓度、纯度及对PCR反映体系的影响.结果 试剂盒及CTAB法去除黑色素比较差异无统计学意义(P＞0.05),两者与酚-氯仿及Chelex-100法比较差异有统计学意义(P＜0.05);CTAB法提取DNA的浓度及纯度的效果要优于试剂盒,差异有统计学意义(P＜0.05),PCR电泳条带清晰,无拖带.结论 CTAB法可有效去除黑色素及其他杂质,同时获得较高浓度的DNA样品;黑色素并不溶于氯仿/异戊醇混合液,对PCR反应体系有很大影响.     

有机酚法和Chelex-100法提取不同组织微量DNA效果比较

目的：比较有机酚法和Chelex-100法提取不同组织微量DNA的效果。方法：分别用有机酚法和chelex-100法从外周血、脐带血、绒毛、羊水、胎盘、血斑、口腔分泌物、发根毛囊中提取微量基因组DNA，进行D12S391、D5S818基因座扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。结果：外周血、脐带血、绒毛、胎盘、口腔分泌物、发根毛囊均适于用Chelex-100法提取DNA，效果与有机酚法相似。结论：Chelex法是一种高效而快速的微量DNA提取方法，适用于产前诊断和法医鉴定微量组织的检测。     

经典酚/氯仿抽提法和纯化试剂盒法提取全血基因组DNA的比较

目的 比较经典酚/氯仿法和纯化试剂盒法抽提全血基因组DNA的差异.方法 分别对两种方法抽提的全血DNA产物进行紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳和体外聚合酶链锁反应（PCR）扩增.结果 两种方法DNA的提取效率相似,TaKaBa试剂盒法提取的纯度[光密度（OD）260nm/280nm]较常规酚/氯仿法明显提高.结论 TaKaBa试剂盒法较传统酚/氯仿提取基因组DNA法快速、简便、经济,可用于PCR模板DNA的制备.     

Chelex-100法从颊粘膜拭子提取DNA 进行基因型分析的研究

目的：探讨采用Chelex-100法从颊粘膜拭子提取DNA这一方法的有效性和可靠性。方法：用棉签刮取130例个体口腔颊粘膜脱落细胞，采用Chelex-100法从颊粘膜拭子中提取DNA，采用SSP—PCR及PCR—PFL，P法对其进行检测，观察结果的有效性和可靠性。结果：所有样本中都获得成功。电泳结果显示，PCR扩增及酶切的靶带清晰，无非特异性杂带，扩增结果重复性好。结论：采用Chelex-100法从颊粘膜拭子提取DNA，方法稳定可靠，可以用于基因型检测。     

西帕依固龈液对牙龈卟啉单胞菌体外抑菌作用的研究

目的 比较西帕依固龈液、氢氧化钙和次氯酸钠在体外对牙龈卟啉单胞菌的抑菌杀菌作用,为临床推广使用西帕依固龈液提供实验依据.方法 ①采用液体稀释法药敏实验检测西帕依固龈液对牙龈卟啉单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC).②采用液体扩散法比较观察西帕依固龈液、氢氧化钙和次氯酸钠对牙龈卟啉单胞菌抑菌圈大小.结果 ①西帕依固龈液对牙龈卟啉单胞菌的MIC和MBC分别为5mg/mL和10 mg/mL.②比较5mg/mL和10 mg/mL西帕依固龈液与5mg/mL次氯酸钠对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用,差异有统计学意义(P＜0 05).5 mg/mL西帕依固龈液与3mg/mL氢氧化钙、20 mg/nL的西帕依固龈液与5 mg/mL次氯酸钠对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用,差异无统计学意义(P＞0.0)5).结论 在体外抑菌实验中,选择合适的浓度,西帕依固龈液对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用可以与氢氧化钙和次氯酸钠相当.     

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法.方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100 NP40、Chelex-100 TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度.结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100 NP40 法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度.结论:Chelex-100 NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR.     

河南汉族人群线粒体DNA(CA)n重复子的多态性及法医学应用

目的:探讨河南汉族人群线粒体(mt)DNA 514～523位置(CA)n重复子的遗传多态性及应用.方法:应用PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染技术,对河南汉族214例无关个体血样进行mtDNA(CA)n重复子分型.并对5例腐败肌肉及5例角化组织用Chelex-100、二硫苏糖醇(DTT)联合Chelex-100法和PCR缓冲液法分型技术效果进行比较.结果:河南汉族214例无关个体中检出4种等位基因,重复5～8次,基因差异度0.5013.腐败肌肉及角化组织用DTT联合Chelex-100法和PCR缓冲液法均分型成功.结论:mtDNA(CA)n重复子多态性在河南汉族人群具有一定的法医学应用价值,尤其对于腐败肌肉及角化组织.     

四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较

目的:探讨从微量福尔马林固定石蜡包埋组织(formalinfixation and paraffin embeddedtissues,FFPET)中提取DNA的简单而高效的方法。方法:采用Chelex-100提取法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、水煮法4种方法提取组织DNA;应用聚合酶链反应扩增100~500bp长度DNA片段,然后进行电泳分析,1年后重复PCR电泳分析。结果:小于200bp长度DNA片段扩增,Chelex-100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%,明显优于酚氯仿抽提法(15.0%)(P<0.01)及水煮法(21.3%)(P<0.01)。随着扩增长度的增加,PCR扩增效率逐渐降低,Chelex-100提取法PCR反应总阳性率为82.5%,单纯消化法为66.5%,水煮法为13.4%,酚氯仿抽提法为13.4%。1年后重复PCR总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。结论:Chelex-100提取法方便简单,适用于微量石蜡组织DNA扩增分析;单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。     

腐败及角化组织的DNA提取及mtDNA(CA)n重复子分型

目的建立腐败及角化组织的mtDNA（CA）n重复子分型方法。方法收集腐败肌肉、指（趾）甲及毛干各10份,采用Chelex-100法、含有DTT的Chelex-100处理法及PCR缓冲液处理法三种方法提取DNA。经PCR扩增,PAG电泳分离、银染技术进行mtDNA（CA）n重复子分型。结果10份腐败肌肉用3种方法提取DNA均获得分型成功;10份指（趾）甲及毛干,用Chelex-100法提取DNA,只有1份指甲分型成功,用含有DTT的Chelex—100处理法及PCR缓冲液处理法提取DNA均获得分型成功。结论用本文建立的方法提取DNA适用于腐败及角化组织的mtDNA（CA）n重复子分型检验,在法医学上具有一定的应用价值。     

汽车安全气囊上微量检材DNA检测方法的探讨

目的探讨汽车安全气囊上微量人体脱落上皮细胞DNA检测的有效方法.方法分别采用棉线载体直接扩增法、小体积Chelex-100法和磁珠法对汽车安全气囊上提取的微量人体脱落上皮细胞的DNA进行检测,并对检测结果进行分析比较,以获得有效方法.结果棉线载体直接扩增法和磁珠法均能得到满意的人体脱落上皮细胞核DNA STR基因座分型结果,小体积Chelex-100法不能获得STR基因座分型结果.结论棉线载体直接扩增法和磁珠法均能有效地检测微量人体DNA,获得STR基因座分型结果,提高DNA检出率,操作简单、节约时间和试剂成本,特点在法医物证学实际检案工作中具有较高的应用价值.     

Sequence polymorphism of human mitochondrial DNA control region inChinese Dongxiang unrelated individuals

Objective: To investigate the mitochondrial DNA sequence polymorphism in Chinese Dongxiang ethnic group and to provide basic data used in ethnic origin investigation and forensic purpose. Methods: Genomic DNA was extracted from the whole blood of 100 unrelated individuals of Chinese Dongxiang ethnic group by standard Chelex-100 method. The sequence polymorphism was determined by PCR amplification and direct sequencing. Results: Eighty-two polymorphic sites were identified in mtDNA D-loop region 16 091-16 418 np, and 88 haplotypes were found. The genetic diversity was calculated to be 0.996 9, and the genetic identity was 0.013 2. Conclusion: There are some particular polymorphic sites in Chinese Dongxiang ethnic group, and these sites provide an important basis to investigate the origin of Dongxiang and the relationship between Dongxiang and other ethnic groups. The result also suggested that sequence polymorphism from 16 091-16 418 np in human mitoehondrial DNA control region can be an useful tool for forensic identity.     

口腔粘膜脱落细胞DNA多态性分型检测在法医学应用的初步研究

目的研究各类口腔粘膜脱落细胞的微量生物性捡材中DNA提取和检验的方法,初步论证牙刷等载体作为法医物证检材的可能性。方法分别采用Chelex-100法、有机萃取法、联合抽提法三种方法提取口腔粘膜脱落细胞载体的样本DNA,进行CTTv四个STR位点单步复合扩增和两步级联扩增两种STR-PCR方式的扩增及各位点的等位基因检测。结果实验样本中,除了1例牙刷和2例牙签未能STR位点的正确分型外,其余各无关个体口腔粘膜脱落细胞载体均可以得到与标准血痕阳性相同的STR基因型。结论根据检材的PCR相对模板DNA量,选择适宜的DNA多态性检测分型方法,各类常见的含有口腔粘膜脱落细胞检材可以进行DNA检测分型,这类检材在法医检案中具有应用价值。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。     

西帕依固龈液对牙龈炎患者遗传敏感性的研究

目的 :探讨西帕依固龈液对不同基因型携带者牙龈炎患者的敏感性。方法 :提取 74例牙龈炎患者颊粘膜拭子 ,用 Chelex- 10 0法提取 DNA,采用序列特异引物聚合酶链反应 (SSP- PCR)和聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (PCR- RFL P)方法对牙龈炎患者 IL- 1A- 889位点进行基因型检测。结果:西帕依固龈液对 IL- 1A- 889等位基因 1携带者牙龈炎治疗效果优于等位基因 2携带者 ,但差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。相同的基因型携带者治疗前后龈沟出血指数 (SBI)差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。 结论:西帕依固龈液用于治疗牙龈炎安全、有效 ,值得临床推广使用。     

D13S317基因座“off—ladder”等位基因分析

目的：确证在DNA数据库构建过程中一样本D13S317基因座出现的稀有分型标准物外off-ladder（OL）等位基因。方法：AGCU17＋1STR荧光检测试剂盒进行STR分型时,D13S317基因座检出OL等位基因;利用Chelex-100法提取血样DNA进行荧光PCR,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和ABI3130电泳检测并由上海生工进行测序。结果：OL等位基因只含有6个[TATC]重复,不在D13S317基因座AllelicLadder范围之内,是一个新的等位基因。结论：新的等位基因的出现,对扩大DNA数据库的覆盖范围及全面性和提高基因座个体识别能力等具有重要的借鉴意义。