人口腔鳞癌耐药细胞株中药干预差异性蛋白表达

目的筛选中药成分干预人口腔鳞癌耐药细胞株KBV200前后差异性表达蛋白质。方法采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测5种中药对KBV200的细胞毒性,选择对细胞抑制率低于10%(IC10),即无细胞毒作用的浓度,联合200 ng/mL长春新碱(VCR)对KBV200细胞株进行干预;取干预前后的细胞总蛋白提取液,用表面加强激光解析电离-飞行时间质谱(SELD I-TOF-MS)和CM-10蛋白质芯片技术筛选差异性蛋白。结果质荷比2 000～50 000Da范围内,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)干预KBV200前后共捕获13个差异蛋白质峰(均P<0.05),对于3997、4941、4968、5971、6084 Da 5个蛋白质峰,人口腔鳞癌细胞株KB表达较低,而KBV200表达明显升高(P<0.05),EGCG干预后表达明显降低(P<0.05);大黄素干预KBV200前后共捕获到6个差异蛋白质峰(P<0.05),对于4968,5971,6084 Da 3个蛋白质峰,KB表达较低,KBV200表达明显升高(P<0.05),大黄素干预后表达明显降低(P<0.05);未检测到两面针碱、板蓝根粗提物和岩黄连粗提物干预...     

运用SELDI蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达

目的 运用SELDI（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization）蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达,从而为从蛋白质水平研究HSV-1感染的致病机制奠定基础.方法 常规培养Vero细胞,感染HSV-1,孵育12 h、24 h、48 h后用细胞裂解液裂解细胞.裂解上清经蛋白定量后应用IMAC3（固定金属亲和）和WCX2（弱阳离子交换）芯片,SELDI-TOF-MS技术检测细胞感染HSV-1前后蛋白质表达的差异.结果 感染24 h细胞出现明显细胞病变效应（CPE）,感染12 h质谱分析即可见蛋白的差异表达.共19个蛋白表达水平发生变化,其中IMAC3芯片发现差异峰9个, WCX2芯片发现差异峰10个.结论 SELDI蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达方法简便,敏感性高,从而为从蛋白质水平研究HSV-1感染的致病机制,HSV-1与宿主细胞的相互作用,及抗感染治疗靶位的寻找奠定了一定的基础.     

铜绿假单胞菌对左氧氟沙星耐药相关差异蛋白质组学研究

目的筛选铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1对左氧氟沙星耐药前后的差异蛋白质,探讨这些蛋白质与铜绿假单胞菌对左氧氟沙星耐药的关系。方法采用亚抑菌浓度梯度递增法体外诱导PAO1对左氧氟沙星耐药,并设置同步对照组,应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI)技术和CM10蛋白质芯片检测PAO1对左氧氟沙星耐药株和同步对照菌株的菌体蛋白,采用Biomarker Wizard软件进行分析。结果左氧氟沙星耐药株与同步对照菌株间有8个差异蛋白(P<0.05),5个差异蛋白高表达,分子量分别为1 004、1 007、1 918、5 175Da和5 454Da;有3个蛋白质低表达,分子量分别为1 012、1 629、2 004Da。结论用蛋白质芯片和SELDI技术对PAO1的左氧氟沙星耐药菌株与同步对照菌株进行蛋白质组学研究,可以筛选出与PAO1对左氧氟沙星耐药可能相关的差异蛋白质。     

铜绿假单胞菌对左氧氟沙星耐药相关差异蛋白质组学研究北大核心CSCD

目的筛选铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1对左氧氟沙星耐药前后的差异蛋白质,探讨这些蛋白质与铜绿假单胞菌对左氧氟沙星耐药的关系。方法采用亚抑菌浓度梯度递增法体外诱导PAO1对左氧氟沙星耐药,并设置同步对照组,应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI)技术和CM10蛋白质芯片检测PAO1对左氧氟沙星耐药株和同步对照菌株的菌体蛋白,采用Biomarker Wizard软件进行分析。结果左氧氟沙星耐药株与同步对照菌株间有8个差异蛋白(P<0.05),5个差异蛋白高表达,分子量分别为1 004、1 007、1 918、5 175Da和5 454Da;有3个蛋白质低表达,分子量分别为1 012、1 629、2 004Da。结论用蛋白质芯片和SELDI技术对PAO1的左氧氟沙星耐药菌株与同步对照菌株进行蛋白质组学研究,可以筛选出与PAO1对左氧氟沙星耐药可能相关的差异蛋白质。     

金黄色葡萄球菌的蛋白组学研究

目的 通过表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI)技术比较甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的蛋白质组学特点及差异.方法 首先采用K-B纸片扩散法进行药敏试验,然后SPA法分别鉴定出MSSA与MRSA同源性菌株,通过利用SELDI技术对其蛋白进行检测,并采用Biomarker Wizard软件分析其蛋白质谱特点.结果 菌株型为t030的同源性菌株17085及16982有3个蛋白质表达有差异,分子量分别为3057、5867、11 511Da;菌株型为t037的同源性菌株18565及68也仅有3个蛋白表达有差异,分子量分别为4304、7492、8354 Da;非同源性菌株18565、16982(均为MRSA)有6个蛋白质表达有差异,分子量分别为3057、5521、6416、7340、8877、11 459 Da;非同源性菌株17085、68(均为MSSA)有7个蛋白质表达有差异,分别为3100、5520、6416、6888、8079、8876、12 366Da.结论 同源性菌株SELDI蛋白质谱具有高度相似性,非同源的MRSA或MSSA蛋白质谱表达均有较大差异.     

多种芯片检测和多元分析法在肝纤维化患者血浆蛋白表达谱分析中的初步应用

[目的]运用多种表面增强激光解吸-离子化飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）蛋白质芯片及多元分析方法寻找由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染引起的肝纤维化病程相关的血浆生物标志物。[方法]选用多种SELDI化学表面芯片,比较分析肝纤维化病人和正常血浆样本,筛选和确定3种最佳芯片类型。用这3种芯片分析无肝纤维化、轻度肝纤维化、重度肝纤维化和肝硬化4组共110例患者的血浆样本。运用主成分分析（PCA）、偏最小二乘回归（PLSR）、软独立建模分类法（SIMCA）等数据分析技术寻找差异蛋白。用聚类分析法研究差异蛋白的表达相似性。[结果]3种最适芯片类型分别是弱阳离子交换芯片（WCX2）、强阴离子交换芯片（SAX2）、固定化镍金属螯合亲和层析芯片（IMAC-Ni）。这3种芯片吸附的蛋白质种类互不相同,所发现的差异蛋白质峰也不同。经t检验分析,3种芯片共发现了20个差异蛋白峰。运用PCA、PLSR、SIMCA等数据分析技术,分别发现了105、98、62个差异峰,并对差异峰的重要性的可信度进行衡量。运用聚类分析技术,将差异蛋白的表达模式分组。[结论]联用多种SELDI芯片检测,结合多元分析方法,使SELDI技术成为筛选疾病相关的生物学标志物的有力工具。     

乳腺癌细胞核差异蛋白筛选

目的 比较体外培养的正常乳腺细胞和乳腺癌细胞核蛋白指纹图谱,筛选差异蛋白,为乳腺癌亚细胞蛋白标志物的研究奠定基础.方法 提取正常乳腺细胞株HBL-100和乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231的核蛋白,表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测蛋白表达,重复试验30次,Biomaker Wizard Software分析软件统计结果并筛选差异蛋白.结果 分子量(Mr) 2～100 kD范围内MCF-7和MDA-MB-231与HBL-100相比差异蛋白点数目分别为78个和69个(P＜0.05),其中5.8 kD、8.3 kD和18.2 kD的蛋白在两株癌细胞中表达均降低,9.9 kD和15.7 kD的蛋白在两株癌细胞中表达均增高.结论 SELDI-TOF-MS能够快速灵敏地检测分析乳腺癌细胞核差异表达蛋白,为乳腺癌亚细胞蛋白标志物的研究提供了新思路.     

SeO2逆转人卵巢癌耐药细胞株耐药性的研究

[目的]探讨SeO2对体外培养的人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP细胞耐药性的影响及其可能的作用机制.[方法]用MTT法、流式细胞术、电镜检测体外培养的COC1/DDP细胞在单独SeO2及与DDP联合作用下的增殖抑制及凋亡程度,用间接免疫荧光标记法在流武细胞仪上检测Survivin蛋白的表达水平.[结果]SeO2对COC1/DDP细胞的增殖抑制作用随SeO2浓度升高而明显增强,其最适浓度约10μmol/L,SeO2与DDP同时作用时增殖抑制作用明显增高;应用流武细胞术,10μmoL/L的SeO2与DDP同时作用于COC1/DDP细胞72 h,凋亡率达(30.66±2.34)%,电镜术也可检测到凋亡细胞存在;应用间接免疫荧光标记法在流式细胞仪上检测,SeO2与DDP同时作用72 h COC1/DDP细胞的Survivin蛋白表达水平明显降低.[结论]在体外,SeO2可增强COC1/DDP细胞对DDP的敏感性,诱导其凋亡.其诱导凋亡机制可能与下调Survivin蛋白的表达水平有关.     

FAT10过表达对肝癌细胞HepG2侵袭及迁移能力的影响

目的 探讨FAT10过表达对肝癌细胞HepG2侵袭及迁移的影响.方法 采用脂质体转染法建立FAT10基因过表达的HepG2细胞株;采用蛋白质印迹法检测转染重组表达载体pcDNA3-FAT10后,HepG2细胞中FAT10蛋白的表达水平.体外侵袭实验及划痕实验检测FAT10基因过表达对HepG2细胞迁移及侵袭能力的改变,并采用芯片检测FAT10下游与细胞侵袭转移相关基因的差异表达.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,转染重组表达载体pcDNA3.1-FAT10的HepG2细胞中FAT10蛋白均过表达;FAT10过表达能明显提高HepG2细胞的侵袭及迁移能力.结论 FAT10基因在HepG2细胞中过表达能提高肝癌的侵袭及迁移能力,并促进肝癌的发生及发展.     

抑癌基因Deleted in Liver Cancer1在人胶质瘤细胞株中的作用及机制

目的探讨抑癌基因DLC1表达的isoform1及isoform2两个亚型在人胶质瘤细胞株中的表达、功能及机制。方法RT-PCR方法检测体外培养的胶质瘤细胞株U87-MG和SHG-44中DLC1isoform1,2的mRNA水平;10μM5-aza-2'-de-oxycytidine(5'-AZA)或者共含有500nMtrichostatinA(TSA)处理细胞36h,检测DLC1isoform1,2的表达;MTT方法检测转染DLC1isoform2及没有GAP活性的isoform2突变体DLC1-K714E表达质粒对胶质瘤细胞株U87-MG和SHG-44增殖的影响。结果在U87-MG细胞株中没有检测到DLC1isoform1;在SHG-44中检测到微量的DLC1isoform1,5'-AZA或者共含有TSA处理使其表达上调;DLC1isoform2在上述细胞株都能检测到,5'-AZA或者共含有TSA处理细胞未改变其表达水平;过表达DLC1isoform2及其突变体DCL1-K714E促进U87-MG和SHG-44细胞株增殖。结论DLC1isoform1在胶质瘤细胞株中不表达或低表达,可能原因是由于不转录或者启动子发生甲基化。DLC1isoform2有一定的表达水平,高表达的DLC1isoform2促进胶质瘤细胞增殖,且不依赖GAP活性。     

Germ cells and pluripotent stem cells in the mouse

For many years, attempts to achieve long-term culture of mouse primordial germ cells (PGCs) proved unsuccessful, even when feeder layers were used and individual growth factors were added to the medium. However, when three growth factors were added simultaneously to the medium, some of the cells continued to proliferate indefinitely. Similar to embryonic stem cell lines, these embryonic germ (EG) cell lines were capable of giving rise to embryoid bodies in vitro, and colonizing all cell lineages in chimeras, including the germline. Initially, EG cells were made from PGCs before migration, 8.5 days post coitum (dpc), and after entry into the genital ridge, 11.5 and 12.5 dpc. New EG cell lines from 9.5 dpc (migrating) and 11.5 dpc PGCs, carrying either a LacZ or GFP transgene, are described here. The developmental potential of the new EG cell lines in vitro, in vivo in chimeras, and in tissue aggregates in organ culture was studied. The EG cells were compared with PGCs at the stage from which the EG cells were derived. The two cell types show several similarities, but also some differences in gene expression and cell behaviour, which require further exploration.     

Comparison of neurosphere cells with cumulus cells after fusion with embryonic stem cells: reprogramming potential

Embryonic stem cells (ESCs) are the pluripotent cells that also have the capacity to induce the genomic reprogramming of differentiated somatic cells. The progressively restricted genomic potential of somatic cells observed during embryonic development can be reverted to a pluripotent state by the formation of cell hybrids with ESCs. To assess the reprogramming potential of ESCs, we investigated the reprogramming of one of two different somatic cell populations, neurosphere cells (NSCs) and cumulus cells (CCs), after fusion with ESCs. Specifically, hybrid cells were produced by cell fusion of E14 ESCs with either NSCs or CCs containing the neo/lacZ and Oct4-GFP transgenes. The first reprogramming event, observed by the presence of Oct4-GFP in the hybrid cells, could be identified on Day 2, at approximately 45 h after fusion in both ESC-NSC and ESC-CC hybrids. In addition, the two ESC-somatic cell hybrids exhibit a similar reprogramming rate and share characteristics with the E14 ESC line: (1) expression of pluripotent markers (Oct4, Rex-1 and nanog); (2) inactivation of differentiated tissue-specific gene expression; and (3) the capacity to differentiate into all three germ layers. Taken together, our results suggest that the ESC-somatic cell hybrids have fully acquired ESC characteristics and that somatic cells of different tissue origin have the same potential to be reprogrammed after fusion with ESCs.     

用彗星试验区别凋亡细胞与普通DNA链断裂损伤细胞

应用彗星试验对地塞米松诱导的小鼠胸腺凋亡细胞与重铬酸钾诱导的普通DNA链断裂损伤细胞进行了比较研究。结果发现 :在彗星形态上 ,凋亡细胞具有明显的特征 ;在相同电泳条件下 ,凋亡细胞的彗星出现时间早 ;在剂量 反应关系上 ,凋亡细胞表现为凋亡指数增加 ,而DNA链断裂损伤细胞为彗星尾长增加 ;在修复的时效关系上 ,凋亡继续发展 ,普通DNA链断裂损伤有明显修复。研究表明 ,彗星试验不仅能敏感地检测DNA链断裂 ,而且可以了解DNA链断裂损伤的性质 ,对于研究肿瘤的发生、发展和转归具有重要意义。     

Adult stem cells

One of the fields of medicine that has created the greatest expectations in recent years is cellular therapy with stem cells. The isolation of human embryo cells, the apparent and unexpected potential of adult stem cells, and the development of gene therapy lead us to imagine a hopeful future for a significant number of diseases that are at present incurable. In the following pages we offer a sketch of the panorama of research with stem cells, describing the main achievements in this field as well as some of the questions awaiting answers. In spite of the great expectations, it is essential that we maintain a critical and realistic spirit when it comes to analysing the scientific advances in this area.     

树突状细胞激活效应细胞作用的初步研究

目的探讨树突状细胞（DC）对肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和小鼠脾淋巴细胞（小鼠脾LC）的最佳激活作用比例.方法联合应用GM-CSF、IL-4和小鼠H22肝癌细胞全细胞性抗原致敏从荷瘤小鼠四肢长骨提取的DC,依据不同的激活比例用致敏DC体外激活TIL和小鼠脾LC,采用乳酸脱氢酶（LDH）4小时释放法测定、观察被不同程度激活的TIL和小鼠脾LC对小鼠H22肝癌细胞的杀伤活性.结果当E/T为1：400和1：200时,所激活的TIL或小鼠脾LC的杀伤活性较弱,线性关系不明显,P＞0.05;当E/T为1：100时,杀伤活性有较明显的提高,与前两者比较,P＜0.05;当E/T=1：50时,杀伤活性徒增,与前三者比较均有显著性差异;而当E/T=1：25,1：12.5和1：6.25时,杀伤活性与E/T=1：50时基本没变化,P＞0.05.结论当E/T=1：50时,DC能使小鼠脾LC和TIL充分激活,显著提高其对小鼠H22肝癌细胞的体外杀伤活性.     

肝实质细胞和肝非实质细胞及非肝细胞的共培养

生物人工肝有望成为肝衰竭患者有效的体外肝支持治疗手段,而建立生物人工肝的前提是要获得足够数量高活性和良好功能的肝细胞.大量研究发现,肝细胞共培养能明显增强肝细胞功能,保持肝细胞的表型.此文就近年来肝细胞和非实质细胞、非肝细胞共培养的效果、方法和可能的机制作了综述.     

Cancer stem cells

There are two hypotheses that explain tumor progression. The first one, the stochastic hypothesis, assumes that any cell within a tumor has the capacity to form and maintain the tumor mass. The second, the so-called hierarchical hypothesis, suggests the existence of a group of cells with a stem phenotype which, like in normal tissues, preserves tumors through a continuous production of progeny. These stem cells are in a particular niche, have a higher resistance to chemotherapy and radiotherapy, and are also capable of invading and migrating to other tissues. This review describes the cancer stem cells (CSCs), their function inside a tumor and the current knowledge about these cells.     

人子宫内膜细胞原代培养与间质细胞MTS比较

目的探究原代人子宫在位内膜细胞分离及培养的简易方法,比较分离培养单一间质细胞和混合培养间质细胞之间的差异。方法采用单纯胰蛋白酶,分段消化人子宫内膜组织,经过两次筛网过滤、离心纯化技术,分离、纯化人子宫内膜间质细胞(ESC)和腺上皮细胞(EEC),采用免疫荧光方法对细胞进行鉴定,采用Cell Titer96~ Aqueous One Solution Reagent(MTS)方法监测细胞之间增长速度。结果间质细胞多呈梭形或多角形,纯度可达97%以上。腺上皮细胞多似蝌蚪形或多角形,纯度可达93%以上。混合培养细胞比单一培养细胞增殖能力强。结论采用单纯胰蛋白酶分段消化法和二次筛网过滤法可成功分离子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,具有获得细胞成活率高、生长稳定的优点,混合培养间质细胞,保留细胞间整体性,可为进一步研究子宫内膜细胞提供一定的实验基础。