蛋白激酶C活性、亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药性的相关研究

目的探讨蛋白激酶C(PKC)活性、亚细胞分布与KBV200细胞株多药耐药(MDR)的关系。方法MTT法检测KB和KBV200细胞对细胞毒药物的耐药性,32P掺入法检测两株细胞的PKC活性。结果长春新碱(VCR)、阿霉素(ADR)对KBV200细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别是KB细胞的65.03和19.8倍;KBV200细胞的膜组分、胞质组分的PKC活性均高于KB细胞(P<0.01),KBV200细胞PKC总活性是KB细胞的2.12倍;佛波酯可升高KBV200细胞总或膜组分PKC活性,VCR、ADR的IC50值升高(P<0.01);十字孢碱可降低KBV200细胞两种组分PKC活性,VCR、ADR的IC50值降低(P<0.01),对VCR、ADR的逆转倍数分别是5.46和1.96倍。结论PKC与KBV200细胞株的MDR表型关系密切,PKC可能介导了KBV200细胞的MDR。     

蛋白激酶C活性、表达及亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药相关性的研究

目的研究多药耐药肿瘤细胞PKC活性、PKC亚型的表达和亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药的关系。方法MTT法检测敏感株KB和耐药株KBV200细胞的耐药性；印掺入法测定PKC的活性；Western blot法检测KBV200及其亲本KB细胞株PKC亚型的表达和亚细胞分布。结果长春新碱（VCK）和阿霉素（ADK）对KBV200细胞的IC50值分别高于KB细胞（P〈0．01）；耐药指数（RI）分别为65．03和19．8。KBV200细胞的膜组分、浆组分的PKC活性均较KB细胞高,KBV200细胞的总PKC活性是KB细胞的2．12倍。Western blot结果发现KBV200和KB细胞膜组分及浆组分均有PKCq的表达，且KBV200细胞的表达较KB明显增强。PMA可升高KBV200细胞的PKC总活性和膜组分PKC活性，降低浆组分PKC活性、表达（P〈0．01）；PMA可升高VCR、ADK对KBV200细胞的IC50值（P〈0．01）。SP可降低PKC活性；SP预孵育使PKCα膜组分和浆组分的表达均降低，可降低VCR、ADK对KBV200细胞的IC50值（P〈0．01）。结论KBV200细胞的PKC活性、表达、亚细胞分布与KB细胞有明显差别，这种差别可能与KBV200耐药性的变化密切相关，在PKC亚型中，PKCα的表达明显高于其他亚型，且高于亲本株，提示KBV200细胞中PKCα与多药耐药相关。     

LAK细胞对白血病多药耐药细胞的杀伤作用

目的:研究淋巴因子激活的杀伤(LAK) 细胞对白血病多药耐药细胞的杀伤效应。方法:采用改良的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测LAK细胞对白血病多药耐药细胞株K562/VCR的杀伤率,并与敏感株K562 相比较。结果:LAK 细胞对K562/VCR 细胞的杀伤率明显高于对K562 细胞的杀伤率,并且当效靶比为40∶1 时,这种杀伤率最高。结论:LAK细胞在体外对白血病多药耐药细胞株具有显著的杀伤作用,提示临床上用LAK细胞治疗多药耐药的白血病是可行的     

KBV200细胞多药耐药与蛋白激酶C亚型表达的关系

目的探讨蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药(multidrugresistance,MDR)的关系。方法(1)用Westernblotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布;(2)流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果(1)PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高,而PKCβ、ε无显著变化,PKCγ、ζ则未测出表达;(2)流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高,PKCβ、ε则无显著差别。结论PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中,PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

汉防已甲素、罗通定及川芎嗪对肿瘤细胞株KBV200多药耐药性逆转作用的研究

目的探讨中药汉防已甲素、罗通定及川芎嗪逆转肿瘤细胞株KBV200多药耐药性作用.方法用四唑盐比色法检测细胞株对药物敏感性,用逆转录多聚酶链反应检测耐药株用药前后肿瘤多药耐药基因的表达.结果在最适逆转浓度下,汉防已甲素(10-6mol/L),罗通定(10-5mol/L)对KBV200耐药性有明显逆转作用,川芎嗪(10-4mol/L)有一定作用,使长春新碱对耐药细胞株KBV200半数致死量由1 122nmol/L分别降至32 nmol/L、35.8nmol/L及541nmol/L.在上述浓度下,3种逆转剂分别与长春新碱(400nmol/L)合用,细胞存活率分别为0.32±0.1、0.29±0.05、0.56±0.1,较对照0.76±0.05有显著差异(P<0.001).在同样浓度下,3种逆转剂都能使耐药株肿瘤多药耐药基因mRNA表达降低,但与对照比,无显著性差异.结论汉防已甲素、罗通定逆转肿瘤多药耐药性效果好,川芎嗪有一定逆转作用,它们不良反应小,有良好临床应用前景.     

Bcl-2基因在口腔上皮癌多药耐药细胞的表达

[目的]通过检测Bcl-2基因在口腔上皮癌敏感细胞株（KB）与多药耐药细胞株（KBV）的表达差异,探讨Bcl-2基因在口腔上皮癌细胞多药耐药性发生中的作用。[方法]体外培养口腔上皮癌多药耐药株及敏感株,通过RT-PCR法及免疫荧光法检测Bcl-2基因在KB及KBV细胞中转录及翻译水平的差异,通过MTT法及流式细胞检测技术检测KB及KBV细胞对长春新碱（VCR）敏感度的差异。[结果]免疫荧光图像显示Bcl-2蛋白在KB细胞中弱表达,而在KBV细胞中强表达;RT-PCR检测结果显示,KB细胞Bcl-2/β-actin比值是25.0%,KBV组Bcl-2/β-actin比值为36.1%,两组细胞间差异具有统计学意义（P〈0.01）;MTT法检测结果显示KBV组细胞对长春新碱的耐药性为KB组的16.5倍,流式细胞仪检测结果显示KB细胞凋亡率达（98.8±1.2）%;KBV细胞凋亡率达（23.5±2.1）%,两组间差异具有统计学意义（P〈0.01）。[结论]Bcl-2基因与口腔上皮癌耐药性的发生密切相关。     

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylceramide synthase，GCS)基因在人口腔表皮样癌多药耐药细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法 采用RT-PCR分析KBV200及其亲本KB细胞株GCS基因表达的差异，运用MTT法分析KBV200经糖脂合成酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(DL-PPMP)及钙离子通道阻滞剂异搏定处理前后细胞MDR的变化，应用RT-PCR技术检测KBV200细胞耐药逆转后GCS及mdr1基因的表达。结果 KBV200细胞GCS和mdr1基因的表达明显强于KB细胞，而KB细胞mdr1基因表达为阴性。5～25umol／L DL-PPMP均可抑制KBV200 GCS mRNA表达，25umol／L时抑制强度最大；10umol／L异搏定即可抑制KBV200 GCS mRNA表达，15umol／L时抑制作用明显。DL-PPMP和异搏定均可抑制mdr1基因的表达，KBV200经25umol／L DL-PIMP作用48h后细胞内mdr1表达为阴性。结论 异搏定和DL-PPMP对GCS和mdr1基因表达的抑制调节呈浓度依赖性，它们可通过抑制GCS和mdr1基因表达，逆转KBV200对长春新碱的耐药。KBV200 GCS基因的表达与MDR存在正相关，GCS基因可能在肿瘤的多药耐药过程中起着重要作用。     

KBV2000细胞多药耐药蛋白激酶C亚型表达的关系

目的 探讨蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC）亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的关系。方法 （1）用Western blotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布；（2）流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果 （1）PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高，而PKCβ、ε无显著变化，PKCγ、ζ则未测出表达；（2）流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高，PKCβ、ε则无显著差别。结论 PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中，PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

肿瘤细胞不同程度表达HLA-G对NK细胞杀伤活性影响研究

目的 探讨肿瘤细胞不同程度表达HLA-G对NK细胞杀伤活性的影响.方法 基因克隆建立稳定表达HLA-G抗原的肿瘤细胞株,以及通过基于CD107a标记的流式细胞术检测肿瘤细胞表达HLA-G前后对NK细胞杀伤功能的影响.结果HLA-G抗原在细胞表面获得不同程度的表达且能显著抑制NK对肿瘤细胞的杀伤活性(P＜0.05).HLA-G特异性抗体87G阻断或其受体KIR2DL4特异性抗体#33阻断后,均能明显恢复NK细胞对转染HLA-G肿瘤细胞的杀伤功能.结论 肿瘤细胞HLA-G表达量不同,均能抑制NK细胞的杀伤活性,提示HLA-G分子表达在恶性肿瘤细胞的免疫逃逸中起重要作用.     

茯苓乙醇提取物的分离纯化及抗KBV200细胞多药耐药活性

目的 对茯苓的乙醇提取物进行分离纯化,并对所得的单体化合物进行抗KBV200细胞多药耐药活性的检测。方法 采用薄层色谱、柱色谱、葡聚糖凝胶分离、高效液相色谱等方法及波谱技术对茯苓的乙醇提取物进行分离纯化和结构鉴定;利用MTT法检测各化合物对KBV200细胞多药耐药性的逆转作用。结果 从茯苓乙醇提取物中分离并鉴定出8个三萜类化合物。在浓度为12.5 mg/L时,8个化合物对KBV200的多药耐药性均有一定的逆转作用,其中化合物3（去氢土莫酸）的逆转作用最强,其逆转倍数为12.6。结论 茯苓中的三萜类化合物具有逆转KBV200细胞多药耐药性的作用。     

NK／LAK细胞对人口腔癌耐细胞药株杀伤活性的观察

OBJECTIVE: To understand the relation between cytotoxic activity of immunologic effector cells and multidrug resistance of the tumor cells. METHODS: Continuous observation of the morphological changes and MTT colorimetry were employed to evaluate the cytotoxic activity of lymphokine-activated killer (LAK) cells and natural killer (NK) cells against multidrug-resistant (MDR) human oral carcinoma cell line-KBV200 (before and after reversal of MDR) and parental drug-sensitive cell line KB. The morphologic changes of LAK cells and the 3 target cell lines were observed continuously under inverted microscope 3 h after co-culture of LAK cells with one of three target cell lines respectively. The lysis rates of three tumor cell lines in response to co-culture with LAK or NK cells were determined using MTT colorimetry. RESULTS: In comparison with the parental drug-sensitive cell line KB, both KBV200 and its reserved cell line by verapamil (KBVV) showed earlier adherence and greater number of cells lysed by LAK. In MTT colorimetry assay, the cytotoxicity of both LAK and NK cells against the 3 cell lines was associated with the effector-to-target (E/T) cell ratio; the lysis rates of KBV200 and reversed KBV200 cells by verapamil in response to LAK and NK cells were higher than that of KB cells (P<0.05), but KBV200 and KBVV did not significantly differ (P>0.05). At the same E/T ratio, LAK cells possessed stronger cytotoxicity than NK cells against all the tumor cell lines (P<0.05). CONCLUSIONS: Immunologic effector cells possess strong cytotoxic activity against multidrug-resistant cell line KBV200. Modulation of MDR does not decrease the cytotoxic activity of the immunologic effector cells. The results of this study suggest that adoptive cell immunotherapy with immunologic effector cells may be of value in controlling the progress of MDR tumors.     

热疗促进HSP70表达对免疫效应细胞杀伤肿瘤的影响

目的: 探讨热疗通过促进乳腺癌药物敏感细胞株与多药耐药细胞株表达热休克蛋白(HSP)70,提高免疫效应细胞对靶细胞的杀伤活性.为开展基于热疗的细胞免疫治疗提供实验依据.方法: 采用IFNγ、CD3单抗、IL-1和IL-2等细胞因子诱导并扩增免疫效应细胞.分别给予乳腺癌药物敏感株MCF7和耐受株MCF7/ADR非致死温度热冲击42 ℃ 1 h,继续培养4 h,24 h,48 h后收获细胞,用流式细胞术检测靶细胞上HSP70的表达.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定靶细胞增殖活性以及免疫效应细胞对靶细胞的杀伤活性.结果: HSP70在两种靶细胞上的表达有差异,加热前MCF7/ADR细胞HSP70表达明显高于MCF7,加热后4 h,HSP70在MCF7/ADR表达提高了6倍,在MCF7表达提高了22倍,超过了耐药株.药物敏感株MCF7增殖的热抑制率低于耐药株MCF7/ADR.热冲击前免疫效应细胞对MCF7细胞的杀伤活性低于MCF7/ADR细胞.热冲击后免疫效应细胞对MCF7的杀伤活性提高了86.23%,超过了对MCF7/ADR的杀伤活性(提高了30.32%).结论: 热疗明显提高HSP70在乳腺癌药物敏感与耐受细胞系上的表达,增加了免疫效应细胞对这两种靶细胞的杀伤活性.HSP70在乳腺癌药物敏感与耐受细胞系上的差异性表达对免疫效应细胞的杀伤活性有影响.     

蛋白激酶C活性、亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药性的相关研究

OBJECTIVE: To investigate the relationship between protein kinase C (PKC) and multidrug resistance (MDR) in cancer cell line KBV200. METHODS: MTT assay was used to evaluate the IC50 of vincristine (VCR) and adriamycin (ADR) in KB cell line and its VCR-resistant derivative KBV200 cells. PKC activities in the 2 cell lines were assayed by measuring the incorporation of (32)P from [gamma-(32)P] ATP into the peptide substrates. RESULTS: The IC50 values of VCR and ADR in KBV200 cells was 64.03 and 18.8 folds greater than those in KB cells. PKC activities of the membrane and cytosol fraction in KBV200 cells were increased compared with that in KB cells, with the total PKC activity 1.12-fold higher. Phorbol-12-myristate-13 -acetate increased PKC activity of the membrane fraction and IC50 values of KBV200 cells, while staurosporine worked to the opposite effects. CONCLUSION: PKC may contribute to MDR mechanism in KBV200 cells.     

丁酸钠抑制淋巴因子激活杀伤细胞杀瘤活性的研究

目的：探讨低浓度丁酸钠(sodium butyrate)对人结肠腺癌细胞SW1116表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和癌胚抗原(CEA)表达的影响及其对淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞杀伤活性的改变。方法：噻唑蓝(MTT)比色法检测经不同浓度丁酸钠处理4天后SW1116在不同效／靶比下对LAK细胞杀伤敏感性的改变，流式细胞术和免疫荧光法定量和定性检测丁酸钠对ICAM-1和CEA表达的影响。结果：MTT显示，经0．5、1和2mmol／L丁酸钠处理后，细胞对LAK细胞杀伤敏感性从74．6％下降至15．9％(效／靶为20)，且在一定程度上有浓度依赖性，当效／靶为10时亦呈类似变化，与之对应的ICAM-1阳性细胞数从92．2％下降至7．6％，而CEA阳性细胞数从1．2％上升至16．6％，荧光显微镜下与流式细胞术的改变相一致。结论：丁酸钠减弱LAK细胞对人结肠癌细胞SW1116的杀伤，这种作用可能与其降低ICAM-1同时增加CEA的表达，从而改变效／靶细胞的结合有关。     

抗肿瘤多价转移因子对肿瘤患者NK及LAK活性的影响

目的：制备并观察抗肿瘤多价转移因子（M－TF）对肿瘤患者NK及LAK活性的影响。方法：分别用肝癌细胞悬液,胃癌细胞悬液免疫山羊,取其淋巴组织均匀浆透析法制备肝癌特异性转移因子（HCC－STF）和胃癌特异性转移因子（GC－STF）,用肝癌,胃癌及大肠癌混合细胞悬液免疫山羊,制备M－TF。比较其理化性质及对肿瘤患者NK及LAK活性的影响。结果：三种转移因子理化性质十分相似,肽类,核苷酸类物质及氨基酸俯含量相近。HCC－STF能明显增加肝癌患者NK,LAK活性及LAK细胞对肝癌7721细胞的特异细胞毒作用,GC－STF能明显增加胃癌和大肠癌患者NK,LAK活性及LAK细胞对胃癌7901细胞的特异细胞毒作用,M－TF能显著增加肝癌,胃癌及大肠癌的NK,LAK活性及LAK细胞对7721和7901细胞的细胞毒作用,其增加效果与HCC－STF及GC－STF比无明显差异。结论：M－TF具有免疫调节性强,抗肿瘤谱广的特性,值得推广应用。     

Determination of IL-2 and cytotoxicity of killer cells in MTT colorimetry

Summary The activity of interleukine 2 (IL-2) in culture supernatants of lymphokine-activated killer (LAK) cells and tumor infiltrating lymphocytes (TIL) as well as cytotoxicity of LAK cells on cultured leukemic cells were determined by MTT colorimetry. The results showed that higher activity of IL-2 in culture supernatant of LAK and TIL cells was found it could be used to support the culture of IL-2 dependent cell lines. The significant cytotoxicity of LAK cells on leukemic cell lines could be found in vitro, and it was consistent with the ratio of effector cells to target cells. The number of living leukemic cells is consistently related with the concentration of formazan metabolite of MTT. It suggested that the numbers of living cells and cytotoxicity of LAK cells could be estimated by determination of formazan metabolite OD value.     

多发性骨髓瘤患者自然杀伤细胞体外扩增及其抗自体骨髓瘤作用

目的探讨体外高效扩增多发性骨髓瘤(MM)患者自身自然杀伤细胞(NK细胞)的方法,研究扩增前和扩增后NK细胞对骨髓瘤细胞株U266和自体骨髓瘤细胞的杀伤作用。方法 10例MM患者的外周血单个核细胞与K562转基因细胞株在含不同浓度白细胞介素(IL)-2的培养液中共育14d,应用流式细胞仪,采用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法和铬51释放法等方法,研究NK细胞的扩增情况、增殖能力、免疫表型和抗骨髓瘤作用。结果 300U/mLIL-2共培养体系扩增NK细胞的扩增倍数为196.4±12.8,扩增后NK细胞存活率>95%,IL-2能增强共培养体系中NK细胞的增殖能力。在效靶比为10∶1时,扩增后NK细胞对自体骨髓瘤细胞的平均杀伤率为(38.1±6.2)%,显著高于扩增前的(3.9±1.7)%(P<0.01)。结论 K562转基因细胞株能特异性刺激骨髓瘤患者NK细胞扩增,扩增后NK细胞抗自体骨髓瘤的作用显著增强,扩增并活化的NK细胞将有望作为临床治疗MM的免疫治疗方法。