梅毒螺旋体寡核苷酸芯片探针的设计及筛选

【目的】设计梅毒螺旋体寡核苷酸探针,筛选出适合芯片检测的高敏感性和特异性寡核苷酸探针。【方法】根据梅毒螺旋体特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。提取梅毒螺旋体的DNA,采用通用引物联合标记法进行标记,标记样品与芯片杂交,用芯片扫描仪检测杂交结果。【结果】设计出23条50 mer梅毒螺旋体寡核苷酸探针。标记样品与芯片杂交部分探针有较强的杂交信号,并筛选出符合要求的9条梅毒螺旋体寡核苷酸探针。【结论】以上方法能设计和筛选出敏感性和特异性较高的梅毒螺旋体寡核苷酸探针,可用于制备梅毒螺旋体寡核苷酸芯片。     

胶体金标记/银染信号放大法在寡核苷酸芯片检测人HCM突变中的应用

目的　验证胶体金标记 /银染信号放大法在寡核苷酸芯片检测人肥厚型心肌病 (HCM )基因突变中对单碱基错配的灵敏性和特异性。方法　不对称PCR扩增、生物素标记待检测的人 β 肌凝蛋白重链基因片断 ,与构建的低密度HCM寡核苷酸芯片杂交 ,胶体金标记 /银染放大法检测 7种HCM恶性突变位点 ,观察胶体金标记 /银染信号放大法对单碱基错配形式的判别率。结果　胶体金标记 /银染信号放大法在寡核苷酸芯片中的单硝基突变的平均判别率为 16 2 ,可以鉴别所有的单碱基错配和三碱基缺失。结论　胶体金标记 /银染信号放大法代替荧光标记法用于寡核苷酸芯片靶标分子的标记和结果检测 ,可以区分所有的单碱基错配形式 ,实现了芯片杂交结果的普通光学显微镜检测 ,提高了DNA芯片的实用性。     

限制性显示技术作为一种高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法的初步研究

目的初步研究限制性显示技术（RD-PCR）作为一种高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法对芯片杂交信号的影响。方法收集3个健康人外周血单核细胞，提取RNA后分为两组，采用RD-PCR进行样本双色（Cy3／Cy5）荧光标记，与3张Agilent 60 mer高密度（22K）人1B寡核苷酸芯片进行杂交。排除阴性和阳性对照信号值、Cy3和（或）Cy5的前景与背景间无统计显著性差异点的信号值，进一步排除两种荧光标记间存在统计显著性差异点的信号值，将3张芯片的共同信号值用于分析。SPSS软件进行常规统计分析和作图，R语言环境下的VSN统计包排除芯片间和两种不同荧光标记间的系统误差。结果3张芯片的8744个共同点用于本研究。芯片间及两种荧光标记间存在明显的可校正的系统误差。芯片间杂交信号值相关显著。RD-PCR样本标记方法对较低表达基因信号值较为敏感。结论初步的统计分析结果表明，RD-PCR是一种潜在的有用的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。     

荧光标记法结合综合管理对医院环境清洁效果的影响

目的 评价荧光标记法结合综合管理对医院环境清洁效果的影响.方法 于2016年1~6月在十堰市太和医院神经内科、呼吸内科、神经外科、心胸外科和重症医学科5个科室各随机抽取5间病房,采用荧光标记法结合ATP荧光检测法监测医院临床科室高频接触频率的物体表面清洁质量,针对存在问题制定综合管理措施,并进行管理前后效果评价.结果 采取综合管理措施后,该医院环境物体表面清洁质量荧光标记清除率和ATP生物荧光法检测合格率分别由干预前的41.11%和38.89%提高至干预后的90.42%和83.33%;持续干预6个月物体表面的清洁质量荧光标记清除率,内科病房由26.04%持续提高至87.50%,外科病房由22.23%持续提高至86.25%,重症医学科由63.46%持续提高至97.50%,差异均有显著统计学意义(P<0.01).结论 荧光标记法结合综合管理能够改善医院环境物体表面的清洁效果,降低医院感染的风险.     

限制性显示技术作为一种高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法的初步研究

目的 初步研究限制性显示技术(RD-PCR)作为一种高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法对芯片杂交信号的影响。方法 收集3个健康人外周血单核细胞,提取RNA后分为两组,采用RD-PCR进行样本双色(Cy3/Cy5)荧光标记,与3张Agilent60mer高密度(22K)人1B寡核苷酸芯片进行杂交。排除阴性和阳性对照信号值、Cy3和(或)Cy5的前景与背景间无统计显著性差异点的信号值,进一步排除两种荧光标记间存在统计显著性差异点的信号值,将3张芯片的共同信号值用于分析。SPSS软件进行常规统计分析和作图,R语言环境下的VSN统计包排除芯片间和两种不同荧光标记间的系统误差。结果 3张芯片的8744个共同点用于本研究。芯片间及两种荧光标记间存在明显的可校正的系统误差。芯片间杂交信号值相关显著。RD-PCR样本标记方法对较低表达基因信号值较为敏感。结论 初步的统计分析结果表明,RD-PCR是一种潜在的有用的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。     

样品制备与扩增条件对寡核苷酸芯片杂交结果的影响

目的 以HLA-A小阵列检测芯片为平台，确定HLA-A寡核苷酸芯片检测中最优化实验条件。方法 观察了样品制备方法(传统酚-氯仿法、白细胞裂解液法、Fe2O3纳米磁珠)、不对称PCR制备ssDNA的参数、PCR产物纯化方法对杂交结果的影响。结果 3种不同的基因组提取方法均获得良好的特异性PCR扩增结果，纳米磁珠应用于样品提取和PCR扩增获得成功，实验条件需进一步完善；在不对称PCR最佳实验条件为反向引物与正向引物浓度比25：1，正向引物浓度为0．04μmol／L，PCR灵敏度可达ng(纳克)模板DNA，Qiagen纯化试剂盒效果略强于其它两种，但差异无显著性。结论 本研究初步探讨HLA-A生物芯片样品制备条件，并取得理想结果，为寡核苷酸生物芯片的实际操作提供一定的参考和指导。     

荧光交换标记法基因表达芯片的数据挖掘

目的 探讨荧光染料交换标记设计的基因芯片数据挖掘方法,并对低剂量电离辐射影响人成纤维细胞基因表达谱数据进行分析.方法 应用GencSifter在线软件和 Panther 生物学信息数据库,对下载于NCBI的GEO数据库的 8 个样品 GSM(包含4个时间点),选择正确的参数设置上载数据,运用ANOVA方法进行数据挖掘,并对差异表达基因进行功能归类分析.结果 获得203条差异表达基因,合并相同基因名后为176条基因.双向聚类和主成分分析发现,样品的24 h时间点基因表达谱与前3个时间点有显著差异,功能归类分析提示,多个生物通路如细胞周期、核酸代谢、DNA代谢等被显著激活.结论 应用这种方法可以挖掘荧光交换标记的微阵列数据,低剂量电离辐射对人成纤维细胞基因表达有时间累积效应,可能引起DNA损伤、细胞周期阻滞等变化,诱导细胞凋亡.     

随机引物法探针标记试剂盒的配制

随机引物法探针标记试剂盒的配制周建中王申五（南京市第一医院内科南京２１０００６）随机引物法标记探针具有标记核苷酸掺入率高，模板ＤＮＡ用量少，所标记探针具高比活性且未经纯化而可直接加入杂交液中变性后使用等优点，有取代缺口平移法的趋势，故其探针标记试剂盒...     

B19微小病毒70-mer寡核苷酸探针的设计

目的　设计B19微小病毒诊断基因芯片的寡核苷酸探针。方法　以微小病毒B19为例 ,利用BLAST软件对其序列进行比对并获得特异序列 ;利用软件Oligo 6设计特异性高、Tm值接近、长度均一的寡核苷酸探针。 结果　获得 12条 70 mer寡核苷酸探针 ,用于芯片打印及病毒检测。结论　利用BLAST系统和生物学软件Oligo 6可简便而有效地设计诊断芯片探针     

survivin反义寡核苷酸诱导人肝癌细胞凋亡的相关信号转导途径

目的 利用人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,探讨survivin基因诱导肝癌细胞凋亡的相关信号转导途径。方法 采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞。采用Western印迹及原位杂交检测细胞内survivin蛋白及mRNA的表达。采用流式细胞仪及TUNEL染色检测细胞凋亡的变化。采用western印迹,免疫沉淀,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及激酶活性检测方法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)及半胱氨蛋白水解酶3表达及活性的变化,观察p38MAPK与半胱氨蛋白水解酶3活性变化之间的关系。结果 脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸后,SMMC-7721肝癌细胞内survivin蛋白及mRNA表达可分别被下调84.6%及69.7%。凋亡细胞比率由转染前的0.70%增加至31.51%。转染后细胞内p38MAPK及半胱氨蛋白水解酶3表达无明显变化。但其活性显著升高,其中p38MAPK活性升高发生于半胱氨蛋白水解酶3活性升高之前。结论 转染survivin反义寡核苷酸可以有效诱导肝癌细胞发生凋亡,其诱导肝癌细胞凋亡的信号通过顺序激活p38MAPK-半胱氨蛋白水解酶3信号途径传导。     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究,为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA,采用限制性显示技术标记,标记样品与芯片杂交后,用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号,而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显,在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号,反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。     

利用基因芯片技术检测BRAF基因在胰腺癌组织中的表达

目的：研究BRAF基因在正常胰腺与胰腺癌组织中表达的情况。方法：收集正常胰腺组织3例以及胰腺癌手术切除标本6例。后者均经病理学检查证实;用TRizol法对组织进行总RNA抽提,采用无RNA酶的DNA酶I等方法进行纯化;通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳以及Lab-on—chip对总RNA进行质控;利用寡核苷酸芯片技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达,并且应用逆转录聚合酶链反应（RT‘PCR）技术加以验证。结果：总RNA的OD260nm／OD280nm之值在1．8～2．0之间;琼脂糖凝胶电泳18s和28s电泳条带清晰,且28s和18s亮度之比≥2;Lab—on—chip检测显示18s和28s双峰比例及位置均正常。无降解杂峰出现。芯片杂交扫描图像信号清晰,具有较低的整体背景和较高的信噪比;Ratio分析表明,BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调（Cy3／Cy5〉2．0）。RT—PCR验证了胰腺癌组织中BRAF mRNA表达上调。结论：BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调,其在胰腺癌发生发展过程中的作用机制还有待于进一步探讨。     

Genotype of ethanol metabolizing enzyme genes by oligonucleotide microarray in alcoholic liver disease in Chinese people

目的　利用基因芯片检测乙醇代谢相关酶的单核苷酸多态性 (SNPs) ,并阐明乙醇代谢相关酶基因多态性与酒精性肝病的关系。方法　参照“酒精性肝病的诊断依据及治愈、好转标准” ,并排除乙型肝炎表面抗原和丙型肝炎抗体阳性者 ,不典型者做肝穿刺活检 ,选择 16 5例嗜酒者 ,其中无肝脏损害的有 4 3例 ,酒精性肝病 12 2例 ;正常对照组 6 5例为研究对象。抽取 3ml外周血 ,分离外周血单核细胞 ,按常规提取DNA ,行 4重不对称PCR ,PCR产物与寡核苷酸探针微阵列芯片杂交 ,并扫描分析结果。结果　健康对照组、嗜酒者组、无肝脏损害的嗜酒者组和酒精性肝病组的ADH2 1等位基因频率分别为37 6 9% ,5 5 76 % ,4 6 5 1% ,5 9 0 2 % ;ADH2 2等位基因频率相应为 6 2 31% ,4 4 2 4 % ,5 3 4 9% ,4 0 98% ;未发现ADH2 3型等位基因。嗜酒者和酒精性肝病患者的ADH2 1频率明显高于健康对照 ,酒精性肝病患者高于无肝脏损害的嗜酒者 ;无肝脏损害的嗜酒者的ADH3 2频率高于健康对照 ;嗜酒者和酒精性肝病患者的ALDH2 2等位基因低于健康对照组 ,酒精性肝病患者ALDH2 2等位基因频率显著低于无肝脏损害的嗜酒者。嗜酒者组未发现ALDH2 2等位基因的纯合子。结论　ADH2 ,ADH3和ALDH2基因多态性将影响国人的饮酒倾向 ;ADH2 2 ,AD     

188Re标记Morpholino寡核苷酸体外稳定性及生物分布

目的 采用治疗性核素铼188(rhenium- 188,188Re)标记Morpholino寡核苷酸,探讨其作为治疗性药物的可能性.方法 以硫乙甘肽(Mercaptoacetyltriglycine,MAG3)作为双功能螯合剂,采用间接标记法,试验不同标记条件对标记率的影响.标记完成后检测生物活性、体外稳定性及正常小白鼠的体内分布.结果 在最佳标记条件下,Morpholino的标记率为65％±12％,纯化后放化纯度＞93％,比活度为(2.37±0.32)MBq/μg.稳定性检测发现,标记物在体外出现再氧化,导致188Re-Morpholino出现解离.加入抗氧化剂抗坏血酸(VitC)后可以显著提高体外稳定性.正常鼠生物分布显示,Morpholinos 主要通过肾脏排泄,甲状腺及胃的摄取明显高于其他器官.结论 以MAG3作螯合剂,188Re可以成功标记Morpholino寡核苷酸;188Re-Morpholino标记物体外稳定性较差,虽然加入抗氧化剂可以提高体外稳定性,但标记物在体内仍出现解离,因此,目前的标记方法可能不适合作为治疗药物.     

肝炎诊断芯片60-mer长链寡核苷酸探针的设计研究

目的:通过生物信息学软件对易引起慢性肝炎的三种肝炎病毒基因组结构进行分析,设计肝炎病毒诊断分型芯片的寡核苷酸(O ligo)探针。方法:利用BLAST软件对乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)、丙型肝炎病毒(HCV)6个亚型的DNA及cDNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;然后用生物信息学软件Array designer 3.0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的O ligo探针。结果:获得156条60-m er探针,用于打印成DNA芯片,进行HBV、HDV的联合检测和HCV的基因分型。结论:利用BLAST检索系统和生物学软件Array desig-ner 3.0设计肝炎病毒诊断分型芯片的探针,是一种简便可行、有效的方法。     

登革病毒cDNA的生物信息学分析及其Oligo探针设计

目的设计登革病毒诊断芯片的Oligo探针。方法利用BLAST软件对4型登革病毒的cDNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;然后用生物学软件Oligo6.0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针。结果获得48条70-mer Oligo探针,用于打印成DNA芯片,进行登革病毒的检测。结论利用BLAST系统和生物学软件Oligo6.0设计登革病毒诊断芯片的探针,是一种简便可行、有效的方法。     

合成寡核苷酸对病毒目标序列特异结合反应及其影响因素研究

目的 观察人工合成的反义寡核苷酸（ASON）、三螺旋结构寡核苷酸（TFO）分别对人甲肝病毒（HAV）5′非编码区一鸭乙肝病毒（DHBV）－DNA X／C区目标基因序列特异结合效应及受影响因素作用的变化。方法 在设定条件下，将人工合成的ASON和TFO与目标基因片断混合反应，采用电泳转移印迹技术观察特异结合产物及其产量。结果 所设计的ASON与TFO能与目标基因片段直接特异结合；在结合缓冲液中，ASON与目标片段的结合最佳比例是25－50：1，TFO与目标片段的结合最佳比例是600：1；在最适加入剂量比例下，结合反应60min即有大量TFO的复合物形成，复合物产量随作用时间延长而增加，180－240min时结合产物完全稳定形成。但ASON的结合复合物大量形成需要180－240min。结论 本试验所设计的ASON和TFO能与HAV和DHBV的目标基因序列发生特异的结合，ASON和TFO的加入剂量和反应作用时间对特异结合产物的形成有明显影响。     

Survivin ASODN诱导胃癌细胞凋亡并增强OPT化疗敏感性的研究

目的 探讨转染survivin反义寡核苷酸(ASODN)对BGC-823细胞survivin mRNA表达及细胞增殖,凋亡和对羟基喜树碱(OPT)化疗敏感性的影响.方法 脂质体转染survivin ASODN,MTT检测生长抑制率,流式细胞术(FCM)及电镜检测细胞凋亡,RT-PCR检测survivin mRNA表达.结果 Survivin ASODN能抑制BGC-823细胞生长,促进其凋亡,并呈剂量依赖性.电镜下见BCC-823细胞呈早期凋亡改变.OFT处理组survivin mRNA表达明显高于对照组和ASODN OPT组(P<0.05).结论 Survivin ASODN可以抑制BGC-823细胞Survivin表达,诱导癌细胞凋亡并抑制其增殖.Survivin ASODN对OPT化疗有增敏作用,即使是多次给予OFF者仍可增敏.