人羊膜间充质干细胞来源外泌体的提取与鉴定

目的探索人羊膜间充质干细胞来源外泌体(hAMSC-Exos)的分离、纯化与鉴定方法,为外泌体的生物学功能研究奠定基础。方法由废弃的羊膜提取间充质干细胞;采取改良超速离心法分离、纯化培养液上清中的hAMSC-Exos;透射电镜观察、纳米粒子跟踪分析技术(NTA)、Western blot和流式细胞术用于hAMSC-Exos的鉴定外泌体。结果成功用改良超速离心法分离出hAMSC-Exos,透射电镜(TEM)下观察呈中间凹陷的茶杯样结构;NTA结果显示样品直径符合外泌体直径大小;Western blot和流式细胞术证实外泌体表面特异性蛋白CD9、CD63、CD81表达阳性。结论建立了hAMSC-Exos的提取纯化及鉴定方法,为它后续的研究提供依据。     

大鼠腹膜源肥大细胞外泌体的分离、培养与鉴定

目的：分离、培养及鉴定大鼠腹膜源肥大细胞外泌体。方法：提取8～10周龄SPF级雌性SD大鼠腹腔灌洗液,使用Percoll密度梯度分离法分离灌洗液中的肥大细胞,通过甲苯胺蓝染色鉴定肥大细胞,在细胞培养板中加入白细胞介素3和干细胞生长因子诱导肥大细胞成熟,收集细胞上清液,采用超速离心法分离上清液中的外泌体,通过透射电镜,纳米流式细胞仪从外泌体形态、粒径和表面标志蛋白三个方面鉴定外泌体。结果：分离得到的肥大细胞被甲苯胺蓝染成蓝紫色,分离的肥大细胞外泌体呈典型盘状,粒径分布范围为30～150 nm,平均粒径为75.33 nm,外泌体表面标志蛋白CD9和CD81呈阳性表达。结论：Percoll密度梯度分离法联合超速离心法分离大鼠腹腔灌洗液中肥大细胞外泌体的方法是可行的。     

富血小板血浆来源外泌体治疗膝骨关节炎的机制与作用

背景：骨关节炎是一种常见的关节退行性疾病,再生疗法促进膝骨关节炎软骨修复一直是研究热点,其中富血小板血浆来源外泌体可能是一种新的再生治疗方式。目的：综述目前文献,总结富血小板血浆来源外泌体在膝骨关节炎中的应用、作用以及潜在机制。方法：以“platelet rich plasma,extracellular vesicles,exosomes,knee osteoarthritis”为英文关键词、以“富血小板血浆,细胞外囊泡,外泌体,膝骨关节炎”为中文关键词分别在Embase、Medline、Cochrane Central Register of Controlled Trials、PubMed、万方数据库及中国知网检索。初检得到1 007篇文献,按纳入、排除标准最终共入选65篇文献进行综述。结果与结论：（1）富血小板血浆来源外泌体的制备涉及富血小板血浆的制备、激活以及使用试剂盒或者超高速离心法获取外泌体,鉴定方法包括标志物表达检测、形态学观察、颗粒跟踪分析等;（2）富血小板血浆来源外泌体的作用包括抑制软骨细胞凋亡,促进软骨细胞增殖与迁徙,抑制炎症因子分泌,促进细胞外基质合成与分泌;（...     

试剂盒法与差速超速离心法所提血清外泌体的形态学比较

目的：比较常用的外泌体提取方法,获得可靠有效的血清外泌体提取方法。方法：电镜下观察鉴定差速超速离心法、试剂盒法及组合优化方法所提外泌体的形态;蛋白印迹法检测外泌体标志蛋白CD63的表达。结果：差速超速离心法提取的外泌体呈茶托样双层膜结构,直径100 nm左右;试剂盒法提取的外泌体颗粒多,大小50~200 nm之间,无明显的立体结构,经差速超速离心法纯化后形态与差速超速离心法类似,经试剂盒法纯化后与仅使用一次试剂盒提取的外泌体无明显形态差异;四种方法所提外泌体表达标志蛋白CD63。结论：差速超速离心法是更为可靠且有效的外泌体提取方法。     

三种不同来源卵巢颗粒细胞外泌体的提取及鉴定

背景：卵巢颗粒细胞作为卵泡内主要的功能细胞,通过复杂的缝隙连接与卵母细胞进行细胞间的信息物质交流,调控着卵母细胞的生长与成熟;随着外泌体研究的深入,发现其积极参与了细胞间的通讯,并携带多种遗传物质,可通过自分泌或旁分泌方式被细胞吸收,调节细胞增殖,参与疾病生理病理过程。由此可见,卵巢颗粒细胞的外泌体分泌能力及提取鉴定对于研究女性生殖具有重要的意义。目的：探讨人卵巢颗粒细胞分泌外泌体的能力及不同来源人卵巢颗粒细胞外泌体之间的差异。方法：体外培养SVOG细胞(人卵巢颗粒细胞系)、KGN细胞(人卵巢颗粒细胞瘤细胞)、人原代卵巢颗粒细胞;采用超高速离心法分别从3种不同来源卵巢颗粒细胞上清中分离提取外泌体,通过透射电子显微镜、纳米跟踪技术、蛋白质印迹法分别鉴定其形态结构、粒径大小、阳性相关特异性蛋白CD63、TSG101及阴性标记蛋白Calnexin的表达。结果与结论：(1)SVOG细胞、KGN细胞、人原代卵巢颗粒细胞的细胞核均为圆形或椭圆形,核大,核仁部分蓝染,细胞浆呈淡红色;SVOG细胞、KGN细胞呈长梭形或多边形,形态不规则,人原代卵巢颗粒细胞多呈突起或梭形,细胞伪足细长,相互紧密交织;(...     

外泌体及其在组织工程中的应用

间充质干细胞是一种具有自我更新能力的成体干细胞,广泛存在于骨髓、脂肪、外周血等组织中。间充质干细胞目前在临床上具有很多治疗作用,给多种疾病的治愈带来希望。最近的研究发现,间充质干细胞在治疗过程中通过释放一些小分子物质来发挥作用,其中外泌体携带着大量的生物活性因子在细胞间进行交流,并在生理和病理过程中发挥着作用。外泌体作为近年来无细胞组织工程的研究热点,可在一定程度上解决再生医学临床应用中遇到的问题,如种子细胞来源、数量及免疫排斥反应等,同时在疾病诊断以及治疗方面表现出极大的潜力。介绍外泌体提取、鉴定的方法及其在组织工程中的应用,并对其未来的发展进行讨论。     

差异超速离心法对不同种属间充质干细胞外泌体分离的可靠性研究

目的　分离培养大鼠及小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过差异超速离心法分离纯化外泌体并鉴定其形态及生物学性质,分析此方法对外泌体分离的可靠性。 方法 将培养3-5代的骨髓间充质干细胞进行成骨、成脂、成软骨诱导分化并进行染色,同时鉴定细胞表面标志物;通过透射电镜、纳米颗粒示踪分析及Western Blot鉴定分离纯化的外泌体。 结果 通过对成骨、成脂、成软骨分化后染色,大鼠及小鼠BMSCs具备干细胞特有的多向分化潜能。流式检测结果显示大鼠和小鼠BMSCs表达干细胞标志性表面抗原;透射电镜下,小鼠及大鼠BMSCs外泌体呈典型双层膜的杯托结构;平均粒径大小为107 nm和152 nm;Western Blot结果显示其表达外泌体标志性蛋白。 结论 我们能成功分离培养大鼠及小鼠的骨髓间充质干细胞;同时,差异超速离心法能够可靠地分离纯化出大鼠及小鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体。     

外泌体定量技术研究

正在上世纪80年代Trams等~([1])最早于培养的绵羊红细胞上清液中发现外泌体(exosomes,ES),并首先提出了ES概念。ES是由细胞主动分泌的直径在40~100 nm的囊泡结构~([2]),由磷脂双分子层包裹了细胞质组成,它包含亲代细胞的蛋白质、DNA、RNA、小分子等。近年来,研究人员陆续观察了不同类型细胞中ES的形成过程,并且能够从血浆、尿     

人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析

背景:现有的外泌体蛋白组学研究中,只有不同来源外泌体或者不同条件下分泌的外泌体之间的蛋白组学对比,没有外泌体和其母体细胞之间的对比分析。目的:对人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析。方法:培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体,通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。结果与结论:(1)提取的外泌体分散度较好且均一,多为杯状圆形或类圆形的膜性小囊泡,可见囊泡的双膜性结构,中央为低电子密度成分,分布较集中且边界清晰;(2)外泌体粒径分布峰值为(129.5±8.7) nm,膜表面带负电荷,浓度为8.375×1010粒子/mL,平均zeta电位为(-28.1±3.6) mV;(3)外泌体有特征性膜蛋白CD9、CD63的表达;(4)蛋白组学分析外泌体中高表达的蛋白质大多参与RNA剪接、mRNA加工、蛋白折叠等生物过程,参与RNA/DNA等遗传物质及蛋白质的合成、加工、降解过程,参与组成多种细胞器及亚细胞膜结构,参与多条信号通路、细胞黏附、细胞外基质受体相互作用,与多种疾病和病毒致癌也密切相关;(5)通过分析认为外泌体与其母...     

外泌体miRNAs在器官纤维化中作用的研究进展

外泌体是由多种细胞主动分泌产生的可携带蛋白质、脂质、miRNAs等生物分子的微小囊泡。外泌体微小RNAs(miRNAs)稳定的存在于体液循环中,参与器官多项病理过程。在器官纤维化疾病中,外泌体miRNAs的含量与正常组织相比呈现出明显的差异性表达,通过调控不同信号通路促进或抑制器官纤维化。外泌体miRNAs可作为临床诊断器官纤维化及判断其纤维化程度的最新生物指标和纤维化疾病新的治疗靶点。     

Assessment of soluble platelet CD40L and CD62P during the preparation process and the storage of apheresis platelet concentrates: Absence of factors related to donors and donations

Platelet transfusions may be associated with certain adverse effects in recipients, potentially caused by the presence of biological response modifiers contained in the platelet concentrates. The aim of this study is to identify the parameters that reflect platelet activation during both the preparation process and the storage of platelet concentrates. A total of 3,949 apheresis platelet concentrate samples were studied with regard to parameters related to the donor as well as to the preparation process and their storage. Key glycoproteins characteristic of platelet activation, i.e. soluble CD40L and CD62P, were quantified in platelet concentrate supernatants on completion of their processing and during storage, using Luminex technology. We observed an increase in soluble factors over time. However, the different parameters studied in connection either with the donors or with the donations, such as (i) donor gender, (ii) donor blood group, (iii) time of collection and (iv) type of apheresis separator, do not seem to have any effect on platelet activation or the release of soluble CD40L and CD62P.     

储存式单采自体红细胞在腹膜后肿瘤择期手术中的应用

目的 探讨普外科腹膜后肿瘤择期手术患者术后输注单采自体红细胞的疗效.方法 回顾性分析本院2014年1月1日至2014年11月30日20例腹膜后肿瘤择期手术患者自体输血对患者血液指标的影响及术后自体红细胞回输的疗效.结果 20例自体储血患者血常规指标单采后与单采前相比有所下降,但PLT、HCT、Hb均维持在较高水平(PLT＞ 150×109/L、HCT＞ 30％ 、Hb＞1 l0g/L),因此自体储血不会造成凝血功能障碍和组织缺氧.回输自体血后患者的血液指标与术后相比有所回升,防止了术后失血性贫血的发生.结论 普外科择期手术术后输注单采自体红细胞是一种安全有效的输血方案,不仅可以解决择期大手术的输血需求,而且能减少输血不良反应.     

γ射线辐照对单采血小板活化及输注效果的影响

目的：研究γ射线辐照对单采血小板活化及输注效果的影响。方法：单采血小板20袋分为对照组和辐照组,辐照组采用35Gyγ射线辐照。测定保存前及保存第1d、3d、5d时血小板活化标志物CD62P的表达。62例接受辐照和未辐照血小板输注的病例,检测其输注血小板前后活化血浆凝固时间（APCT）的变化。结果：保存前及保存第1d、3d、5d时CD62P的表达在对照组和辐照组之间无显著差异（P〉0.05）。输注血小板前后,患者APCT在对照组和辐照组之间比较亦无显著差异（P〉0.05）。结论：γ射线辐照对保存期内血小板活化及血小板输注效果均无明显影响。     

Identification and involvement of ferritin in the response to pathogen challenge in the abalone,Haliotis diversicolor

Accumulating data has demonstrated that ferritin plays an important role in host defense responses against infection by pathogens in many organisms. In this study, ultracentrifugation was used to isolate ferritin from abalone, Haliotis diversicolor, and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis revealed that this ferritin consisted of two subunits (designated as HdFer1 and HdFer2). There are no disulfide bonds between the HdFer1 and HdFer2 subunits; however, these subunits co-assemble to form heteropolymers. A novel ferritin subunit (HdFer2) was cloned from H. diversicolor by 5ʹ and 3ʹ RACE (rapid amplification of cDNA ends) approach. The full-length HdFer2 cDNA sequence consists of 878 bp with an open reading frame of 513 bp that encodes a protein that is 170 amino acids in length. Quantitative real-time PCR analysis revealed that HdFer1 and HdFer2 were transcribed in various tissues, such as the mantle, gill and hepatopancreas, with the highest levels of expression in the hepatopancreas. Following a challenge with the pathogen, Vibrio harveyi, the expression of HdFer1 and HdFer2 were markedly induced at different times. This study has identified a novel ferritin subunit in H. diversicolor which will contribute to further exploration of the role of ferritin in mollusk innate immune defense against invading pathogens.     

Platelet-derived growth factor and its receptors are related to the progression of human muscular dystrophy: an immunohistochemical study

This study has examined the immunological localization of platelet-derived growth factor (PDGF)-A, PDGF-B, and PDGF receptor (PDGFR) alpha and beta to clarify their role in the progression of muscular dystrophy. Biopsied frozen muscles from patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD), Becker muscular dystrophy (BMD), and congenital muscular dystrophy (CMD) were analysed immunohistochemically using antibodies raised against PDGF-A, PDGF-B, and PDGFR alpha and beta. Muscles from two dystrophic mouse models (dy and mdx mice) were also immunostained with antibodies raised against PDGFR alpha and beta. In normal human control muscle, neuromuscular junctions and vessels were positively stained with antibodies against PDGF-A, PDGF-B, PDGFR alpha and PDGFR beta. In human dystrophic muscles, PDGF-A, PDGF-B, PDGFR alpha and PDGFR beta were strongly immunolocalized in regenerating muscle fibres and infiltrating macrophages. PDGFR alpha was also immunolocalized to the muscle fibre sarcolemma and necrotic fibres. The most significant finding in this study was a remarkable overexpression of PDGFR beta and, to a lesser extent, PDGFR alpha in the endomysium of DMD and CMD muscles. PDGFR was also overexpressed in the interstitium of muscles from dystrophic mice, particularly dy mice. Double immunolabelling revealed that activated interstitial fibroblasts were clearly positive for PDGFR alpha and beta. However, DMD and CMD muscles with advanced fibrosis showed very poor reactivity against PDGF and PDGFR. Those findings were confirmed by immunoblotting with PDGFR beta. These findings indicate that PDGF and its receptors are significantly involved in the active stage of tissue destruction and are associated with the initiation or promotion of muscle fibrosis. They also have roles in muscle fibre regeneration and signalling at neuromuscular junctions in both normal and diseased muscle.     

人血清载脂蛋白H的纯化与鉴定

为了研究载脂蛋白H（apoH)与疾病的关系，分别用HClO4,(NH4)2SO4沉淀、DEAE－纤维素离子交换层析，从人血清中纯化了载脂蛋白Ho用测定分子量，分析氨基酸组成和N－端氨基酸测序三个方面进行鉴定。用SDS－PAGE测得其相对分子量对54000。用高效液相色谱测定其中15种氨基酸的相对含量（mol/10^3mol残基）如下：Asp119.8,Glu108,Thr94.8,Ser78.6,Phe64.9,Gly1008,Ala57.2,Val57.2,Met10.6,Ile50.3,Leu77.1,Tyr31.9,His15.2,L-ys81.4,Arg39.4;d PE-ABI公司生产的475A型气相蛋白质测序仪上测得其N端10个氨基酸残基顺序如下：NH2－Gly-Arg-Cys-Pro-Asp-Asp-Leu。纯化得到的apoH与肝素有高的亲和性，还能与乙肝表面抗原结合。纯化apoH的方法相对比较简单，能达到测序的要求。     

EMG信号的计算机自动识别与处理系统

目的 建立EMG信号的计算机自动识别与处理系统，探讨该系统对各种神经，肌肉疾病肌电图诊断的临床价值；方法 系统利用各种信号处理技术，通过计算机提取轻收缩运动电位，重收缩波形，给出各特征参数；结果 该系统可快速准确处理肌电信号数据，结合肌电图数值特征，给出诊断结果；结论 该系统设计科学，诊断快速，准确，从而提高了肌电图诊断的准确度。     

信息抽取技术在中医研究中的应用

中医文献是中医学的主要知识资源,实现文献的数字化是信息时代中医文献研究的必然要求。本文介绍了一种基于隐马尔可夫模型的信息抽取技术,探讨了把这种技术用于生成结构化的中医文献数据库的方法,旨在把智能信息处理技术和中医研究相结合,以辅助中医药研究发展。     

沙蜇毒素的提取及溶血活性分析

目的血栓形成是引发严重心脑血管疾病的病理基础,溶栓药物可消除血栓并减轻并发症。本研究从生物组织中提取分离的具有溶血活性的物质,有望成为有效的溶栓制剂,为血栓的治疗提供新方法。方法通过海水自溶、离心、低温研磨等方法从沙蜇触手的刺丝囊中提取沙蜇毒素,对沙蜇毒素提取液进行分离纯化,测定了毒素的溶血活性并绘制溶血曲线;深入研究了温度、介质的pH值对其溶血潘陛的影响。结果研究证实：沙蛰毒素具有很强的溶血活性,且对温度敏感,其活性受pH变化影响很大。粗毒素提取液分离出性能完全不同的2个组分,其中仅第一组分有溶血活性,第二组分未检测到溶血活性。结论研究结果提示沙蛰毒素有望用于改善生物材料的抗血栓性能。     

车前叶中总黄酮的微波提取及含量测定

目的 从车前叶中提取总黄酮,并测定其含量。方法 运用微波技术提取车前叶总黄酮,用比色法测定总黄酮含量。结果 测得车前叶中总黄酮含量3.83%,平均回收率为98.6%,RSD=1.72%(n=6)。结论 首次运用微波技术从车前叶中提取出总黄酮,反应速度加快,实验结果令人满意。