中国动物药材DNA条形码数据库

课题组联合相关研究者开展动物药材DNA条形码分子鉴定研究,并结合分析GenBank序列,采用BLAST分析防错、系统树分析防错和Barcoding Gap检验防错等方法核验序列的可靠性,构建了中国动物药材DNA条形码数据库。该库由样品数据库、序列数据库和文献数据库组成,包含800余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物种。中国动物药材DNA条形码数据库可以通过中药材DNA条形码鉴定系统（www.tcmbarcode.cn）进行网络访问并实现未知动物样本的DNA条形码鉴定。该研究首次构建统一的中国动物药材DNA条形码数据库,对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义。     

黄芩ITS2条形码数据库构建及其种子的DNA条形码鉴定方法建立

目的:通过构建黄芩核糖体DNA内转录间隔区2(ITS2)条形码数据库,建立黄芩种子DNA条形码鉴定新方法,保障黄芩种子基原准确。方法:收集黄芩对照药材、基原植物、生药材、公共数据库及其常见代用品的ITS2序列,构建黄芩DNA条形码数据库;收集62份市售黄芩种子样品,每份种子获取3~4条ITS2序列,基于BLAST方法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:共获得101条黄芩及其代用品的ITS2序列。黄芩的种内序列变异小于种间序列变异,黄芩、甘肃黄芩和粘毛黄芩在NJ系统发育树上分别聚为独立的支,可相互区分。共获得195条黄芩种子的ITS2序列,DNA条形码鉴定结果表明193条为黄芩序列,2条为真菌序列。结论:黄芩ITS2条形码数据库稳定可靠,可满足黄芩种子DNA条形码鉴定的需求。DNA条形码技术可用于黄芩种子的物种鉴定。     

用DNA条形码技术对市售花胶进行基原鉴定

目的:运用DNA条形码技术确定广州市售花胶的物种来源。方法:用自行设计的COⅠ引物对11份市售花胶样品进行PCR扩增、测序,将所得序列构建UPGMA系统发育树,进行聚类分析;用BOLD(The Barcode of Life Data Systems)系统的物种鉴定引擎,与数据库中已有鱼类序列进行比对,鉴定出各样品的基原。结果:11份市售花胶样品用自行设计的引物均可实现扩增,条带清晰、稳定,扩增和测序成功率均为100%;BOLD鉴定结果显示,11份样品来源于3科5种鱼类,UPGMA聚类分析对结果进行了确证。结论:DNA条形码技术与BOLD鉴定系统相结合,可对市售花胶进行准确的基原鉴定。     

基于DNA条形码—产地—形态分析联用的巴西马钱属植物药QUINA基原鉴定研究

目的通过DNA条形码—产地—形态分析联用的方法对巴西马钱属植物药QUINA进行基原鉴定研究,为这种药材的开发利用提供依据。方法通过提取样品DNA、PCR扩增及双向测序,获得样品的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列,利用NCBI数据库中的BLAST功能计算相似度,对其基原进行DNA条形码鉴定;根据其产地信息对DNA条形码鉴定结果进行筛选和分析;依据其形态特征验证鉴定结果。结果本次收集的植物类药材QUINA来源于马钱科马钱属植物Strychnos pseudo quina A.St.-Hil.的根皮。结论 DNA条形码—产地—形态三者联用的方法可弥补单一鉴定方法的不足,能够快速、准确的对未知样品进行基原鉴定。     

DNA条形码技术在新疆进口民族民间药材基原考证中的应用

目的:采用DNA条形码技术,研究探索新疆进口民族民间药材基原考证。方法:使用试剂盒法提取药材总DNA,采用ITS2序列、psbA-trnH序列对30份进口维吾尔药材样品进行PCR扩增并双向测序,利用MEGA7.0等软件分析序列信息,将序列在DNA条形码基原植物鉴定数据库及GenBank数据库中进行比对,搜索相似性最高的植物,判定药材可能的基原。结果:综合ITS2及psbA-trnH实验结果,30份药材中有28份样品测序成功并得到有效的鉴定序列,相似性对比结果显示有15种药材与文献记载基原植物一致,7份与基原植物为近缘种,6种药材与文献记载基原植物不同属。结论:进口维吾尔药材的基原调查与考证工作迫在眉睫。     

药用多孔菌DNA条形码鉴定研究

目的:筛选采用DNA条形码技术鉴定药用多孔菌的有效条形码及该方法的可行性。方法:对29种药用多孔菌的69份样品进行DNA提取,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增ITS序列并进行双向测序,去除低质量区和引物区,得到ITS序列,通过BLAST比对及基于K2P遗传距离构建系统聚类NJ树开展ITS鉴定效率评价。结果:经过优化的DNA提取方法,可对所有样品成功提取到足量DNA,PCR扩增产物测序并经过序列拼接剪切后均能得到高质量ITS序列;物种内ITS最大遗传距离均远小于物种种间最小遗传距离;基于Gen Bank数据库进行BLAST比对,鉴定效率达到100%;基于K2P遗传距离构建NJ树,结果显示相同物种均聚为一支。结论:DNA条形码技术可以对多孔菌进行快速准确鉴定,ITS序列可作为药用多孔菌有效候选DNA条形码。     

基于显微—DNA条形码—产地分析联用的巴西柑橘属植物药FARINHA DE LARANJA(枳壳)基原鉴定研究

目的利用显微-DNA条形码-产地分析联用的方法对巴西柑橘属植物药FARINHA DE LARANJA粉末进行基原鉴定研究。方法应用显微鉴定的方法对药材粉末的基原进行初步判定;再提取样品DNA,扩增ITS序列,利用NCBI数据库中的BLAST功能分析相似度,对样品品种进行DNA条形码鉴定;最后结合产地信息对数据库中的序列进行筛选。结果显微-DNA条形码-产地综合分析结果表明,该样品为芸香科柑橘属Citrus L.植物酸橙Citrus aurantium的干燥未成熟果实粉末。结论巴西植物药FARINHA DE LARANJA的鉴定可为扩大枳实、枳壳等中药材的药用资源提供依据。     

建立对生药进行准确鉴定和全面质量评价的二元条形码系统

由于很多常用生药来源繁多,导致市场上品种混乱,药材质量参差,需要准确、快速、可靠的鉴定与质量评价体系。本文提出建立生药鉴定与质量评价的二元条形码系统的解决方法,即基于小片段基因序列的DNA条形码和基于代谢谱的化学条形码数据库：分子条形码可准确鉴定物种基原,化学条形码可弥补其在质量评价方面的欠缺;待检测生药分别提取分子条形码和化学条形码,输入数据库进行数据处理,即可获得其准确的基原、产地、质量等全面信息。按DNA条形码技术规程采集植物标本和生药样品;测定matK、trnH-psbA、ITS等序列,确定适合作为条形码的区域,在BOLD平台建立DNA条形码数据库;以UPLC-MS检测样品的代谢谱,建立可用MZmine或CASE等程序进行分析的化学条形码数据库。二元条形码系统可望为生药的准确鉴定与全面质量评价提供新途径,并可用于探讨植物间的亲缘关系及系统发育。     

基于DNA条形码技术的知母种子基原鉴定

目的:建立基于中药材DNA条形码技术的知母种子基原鉴定方法,保障知母种子基原的真实性。方法:收集知母的30份基原植物样品和9份生药材样品,获取其参考DNA条形码序列,采用克隆测序方法验证参考序列的准确性。收集51份待检测知母种子样品,获取其DNA条形码序列,基于BLAST法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:对于基原植物和生药材样品,由于基因组内存在异质性,核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)序列无法稳定获得,但可成功获得psbA-trnH序列。知母psbA-trnH序列分为6个单倍型,有3个变异位点,2处插入/缺失,种内变异最大值0.003 5,种间变异最小值0.1,在NJ系统发育树上聚为独立的支。共获得153条知母种子的psbA-trnH序列,经BLAST法、遗传距离法和NJ系统发育树法鉴定均为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides。结论:psbA-trnH是知母种子鉴定的适合条形码序列,可用于知母种子的真实性鉴定。所收集51份知母种子样品的基原均符合2015年版《中国药典》(一部)相关项下规定,未发现伪品。     

濒危兰科药用植物DNA条形码鉴定

兰科药用植物形态分类困难,此研究采用DNA条形码分子鉴定法从分子水平验证兰科药用植物的传统形态分类。以matK,psbA-trnH和ITS2序列作为DNA条形码对已进行了形态鉴定的49属135种163份兰科药用植物样品进行分子鉴定,经DNA提取,PCR扩增、双向测序及校对拼接后,将得到的序列在GenBank中进行BLAST比对,然后运用MEGA 7.0软件中的Neighbor-joining(NJ)法构建物种系统进化树。结果表明,163份样品均能成功提取DNA;matK,psbA-trnH和ITS2序列的PCR扩增效率分别为100%,100%,98.77%;共获得487条序列,其中345条序列在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列,142条为新增序列;运用NJ法构建的兰科药用植物系统进化树中,基于matK序列所构建的物种系统进化树要优于基于psbA-trnH和ITS2序列所构建的系统进化树。matK,psbA-trnH和ITS2序列在鉴定兰科药用植物过程中互为补充,DNA条形码分子鉴定法可用于辅助兰科药用植物的分类鉴定。     

基于DNA条形码的甘草属植物的分子鉴别

目的:评价不同DNA条形码序列对甘草属的鉴定能力。方法:应用5条常用DNA条形码序列ITS、ITS2、psbA-trnH、matK与rbcL对甘草属进行PCR扩增与序列测序,结合在GenBank数据库下载的序列数据,通过分析各序列种内与种间变异与遗传距离,构建系统发育树,并基于相似性搜索算法和最近距离法计算各序列鉴定成功率,以分析比较各序列对甘草属的鉴定效率。结果:matk序列因扩增与测序成功率均较低,没有加入后续的数据分析。各个序列的鉴定成功率由高到低的顺序为psbA-trnH、ITS、ITS2、rbcL。ITS和ITS2序列种间最小变异均大于种内最大变异,且种内变异最小。Barcoding gap检验结果显示,ITS、ITS2的重叠区较小。NJ树结果显示,只有psbA-trnH序列能把甘草属不同物种分开。结论:利用DNA条形码序列可准确鉴别甘草属植物,psbA-trnH和ITS组合序列可作为鉴定甘草属植物的较优序列组合。本研究为甘草属植物的分子鉴别提供科学依据。     

基于DNA条形码技术的北柴胡种子分子鉴定

目的:建立基于核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列的北柴胡种子分子鉴定方法,保障北柴胡栽培种子的物种准确。方法:收集北柴胡及主要栽培柴胡属物种种子、市售北柴胡种子样品共59份,探究不同取样量和不同水浴条件对种子DNA提取质量的影响,建立柴胡属种子DNA提取方法;通过聚合酶链式反应(PCR)和双向测序得ITS条形码序列。从GenBank下载34条北柴胡、红柴胡、黑柴胡等主要栽培柴胡属物种ITS序列,丰富北柴胡种子鉴定数据库;利用MEGA-X10. 0. 5进行变异位点分析并构建邻接(NJ)系统发育树,考察ITS序列对北柴胡种子的物种鉴定能力;基于BLAST方法和NJ系统发育树法对市售北柴胡种子进行DNA条形码鉴定。结果:共获得59条北柴胡、红柴胡、三岛柴胡及市售北柴胡种子的ITS序列,北柴胡ITS序列可分为6个单倍型,包含7个变异位点,NJ系统发育树表明北柴胡所有单倍型可形成独立的枝,与所收集样品中其他柴胡属栽培物种可相互区分,具备北柴胡种子物种鉴定能力。基于ITS条形码序列鉴定发现19份市售北柴胡种子中有3份为三岛柴胡,伪品率15. 8%。结论:基于ITS序列的DNA条形码技术可以准确可靠地鉴定北柴胡种子及其易混品,可为我国中药材种子规范化建设提供参考。     

芡实及其近缘种药材ITS2条形码鉴定研究

目的:应用ITS2条形码鉴定芡实及其近缘种药材。方法:提取20份芡实及其近缘种药材样品基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并双向测序,测序后用Sequin 12.3提交至GenBank;从GenBank上下载所有芡实及其近缘种30种102条ITS2序列;对提交与下载的122条序列,应用MEGA5.1软件进行序列比对,计算种内和种间距离,采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建NJ系统进化树直观反映鉴定结果。结果:芡实药材ITS2序列长度均为214 bp,为1个单倍型,与其近缘种之间遗传距离较远,NJ树结果显示芡实及其近缘种药材可明显区分开,表现出良好的单系性。结论:ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确地鉴别芡实药材,为保障临床安全用药提供了新的技术手段,为拓宽DNA条形码技术在中药鉴定中的应用进行了新的探索。     

基于DNA条形码技术的中药材木通种子鉴定研究

目的:利用核糖体内部转录间隔区2(ITS2)及叶绿体psbA-trnH序列对中药材木通种子进行鉴定,建立其种子DNA条形码鉴定方法,保障中药材木通种子的准确性。方法:收集木通种子样品15份,通过提取DNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增、双向测序,获取其ITS2及psbA-trnH序列。基于BLAST分析、邻接(NJ)系统发育树构建进行物种鉴定分析。结果:共获得4种类型ITS2序列,2种类型psbA-trnH序列。ITS2及psbA-trnH均可区分木通与川木通、关木通,但ITS2序列可以区分木通与三叶木通、白木通,psbA-trnH序列无法区分木通与三叶木通、白木通。结论:DNA条形码技术可用于木通种子及其易混伪品的鉴定。     

ITS2和psbA-trnH序列鉴别马鞭草科药用植物

目的:评价几条热点DNA条形码候选序列对马鞭草科药用植物的鉴别能力。方法:选择psbA-trnH,rbcL,matK,ITS2和ITS序列进行评价,使用各序列的通用引物进行扩增和测序,用扩增及测序成功率,种内种间差异,barcod-ing gap,基于BLAST 1和Nearest Distance方法的鉴定成功率等指标来评价各序列的鉴定能力。结果:对马鞭草科32个种55个样本的序列分析发现,matK的扩增成功率太低,未纳入后续分析;ITS,ITS2,psbA-trnH以及rbcL的扩增及测序成功率分别为83.6%,83.6%,96.4%,98.2%,其鉴定成功率除rbcL为77.8%,75.9%外都为100%,但ITS2序列的种间,种内差异,barcoding gap较psbA-trnH,ITS有明显优势。ITS2序列进一步纳入网上163个样品的数据后其鉴定成功率依然可以达到89.5%,87.6%。结论:考虑到psbA-trnH较高的测序成功率,ITS2和psbA-trnH是适合马鞭草科植物鉴别的一个较好DNA条形码序列组合。     

Identification of Common Edible and Medicinal Mushrooms by DNA Barcoding

Objective:To identify common edible and medicinal mushrooms using the internal transcribed spacer(ITS) region.Method:A total of eighty-five samples belonging to forty-three species were used in this study.ITS regions were amplified and sequenced.All ITS regions were analyzed using BLAST and MEGA 5.10 methods.Results:Forty species were identified correctly via BLAST method whereas forty-one species were distinguished via Neighbor joining(NJ)tree.All the species could be distinguished by BLAST combined with NJ tree and ITS sequence characteristics.Conclusion:Forty-three common species of edible and medicinal mushrooms were effectively identified using DNA barcoding technology based on ITS region.     

应用ITS2条形码及种子形态鉴定柴胡属种子

目的:采用传统形态鉴定方法结合DNA条形码分子检测技术准确鉴定柴胡属种子。方法:收集41份市售柴胡属种子和GenBank数据库中下载15个品种75条核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列。利用体视显微镜和游标卡尺进行种子外观形态特征的观察和记录,测定千粒重。提取种子的基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序得ITS2序列。基于BLAST法,邻接(NJ)系统进化树法,Kimura双参数模型(K2P)遗传距离法和ITS2序列二级结构进行物种鉴定。结果:不同基原的柴胡属种子在长、宽、横切面及千粒重等方面存在细微的差别;柴胡种子的ITS2序列有2个种内变异位点,3种单倍型,种内最大遗传距离0.009小于种间最小遗传距离0.032;NJ系统进化树中柴胡和狭叶柴胡分别聚为独立一支,具有良好的单系性;ITS2序列二级结构可以弥补NJ树在变种鉴定方面的不足。41份柴胡属种子样品中有30份柴胡,3份狭叶柴胡,5份三岛柴胡,2份藏柴胡及1份小叶黑柴胡。结论:市售柴胡种子存在来源多样、基原混乱的问题。基于ITS2条形码和种子形态鉴定相结合的方法可以准确鉴定柴胡属种子,为制定柴胡种子质量标准,规范柴胡种植,从源头解决柴胡药材质量问题提供科学依据,并为其他药用植物种子或者种子类药材的准确鉴定提供参考。