阿萨希毛孢子菌致小鼠播散性毛孢子菌病的实验和治疗研究

目的 研究阿萨希毛孢子菌致小鼠播散性毛孢子菌病的感染条件及脏器播散情况。方法 于接种阿萨希毛孢子菌前3d及接种后第7天腹腔注射环磷酰胺进行免疫抑制;根据接种阿萨希毛孢子菌的途径将75只昆明鼠随机分为免疫抑制+静脉接种组(n=15)、免疫抑制+皮内接种组(n=7)、免疫抑制+胃肠灌注组(n=8)、免疫抑制+静脉接种+治疗组(n=15),对照组为非免疫抑制的健康小鼠,分别进行上述接种。治疗组给予脂质体两性霉素B及氟康唑治疗。对死亡小鼠的主要脏器进行组织真菌培养及病理检查。结果 免疫抑制+静脉接种组12只小鼠中有10只至少有1个脏器分离出阿萨希毛孢子菌;而非免疫抑制+静脉接种组14只小鼠中有2只分离出该菌。免疫抑制+皮内接种组7只小鼠中有2只仅于接种部位出现皮损,而无其他脏器感染。其余3组非静脉接种小鼠均未出现脏器感染。治疗组小鼠的死亡只数、系统感染及受累脏器数均显著低于非治疗组(P<0.01〉。感染小鼠的各脏器组织病理改变主要为急性化脓性炎症及肉芽肿性炎症,组织中可见关节孢子及菌丝。结论 阿萨希毛孢子菌为一种机会致病菌,可致免疫低下或免疫缺陷宿主的皮肤或脏器感染,但对健康宿主并非绝对不致病。主要受累脏器依次为肝、肺、肾、脾、心。脂质体两性霉素B联合氟康唑可有效抑制该菌的感染和扩散。     

系统性尖端赛多孢子菌感染小鼠白细胞介素10表达的研究

目的:了解白细胞介素10(IL-10)在系统性尖端赛多孢子菌感染中的表达情况。方法:建立小鼠系统性尖端赛多孢子菌感染模型,包括致死量感染组(健康鼠5×106孢子尾静脉接种)、亚致死量感染组(健康鼠5×105孢子尾静脉接种)及免疫抑制组(地塞米松诱导免疫抑制鼠给予5×105孢子尾静脉接种),用逆转录—聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测脾内白细胞介素10(IL-10)mRNA水平,用平皿系列稀释法检测肾内菌落形成单位(CFU),并记录平均生存时间(MST)。结果:致死量组中小鼠脾内IL-10表达明显上升(3 d,P<0.01;7 d,P<0.01),小鼠肾内大量菌生长,且7 d高于3 d(P<0.01),小鼠平均13.6 d均死亡;亚致死量感染组中,IL-10表达基本正常,肾内菌量少,且7 d低于3 d(P<0.01),小鼠生存时间均超过45d;与正常对照组相比,免疫抑制组小鼠脾内IL-10表达明显上升(3 d,P<0.01;7 d,P<0.01),小鼠肾内大量菌生长,且7 d高于3 d(P<0.01),小鼠平均14.2 d死亡,此外,免疫抑制组小鼠脾内IL-10及肾内菌量均高于相应时间亚致死量组(3 dP<0.01,7 dP<0.01:CFUs:3 dP<0.01,7 dP<0.01)。结论:IL-10在小鼠系统性尖端赛多孢子菌感染中表达增高,可能起着促进疾病发展的作用。     

林生地霉皮损分离株和血液分离株致病性的实验研究

目的研究林生地霉皮损分离株和血液分离株的致病性。方法制备林生地霉细胞悬液,通过尾静脉注入不同免疫状态的昆明小鼠体内,观察各组小鼠21天内的平均存活天数和10日内的肾脏组织载菌量,进行统计学分析。结果林生地霉感染后免疫抑制小鼠从感染后第2天开始出现死亡,而免疫正常小鼠在21天内均无自然死亡。在同一免疫状态下,皮损分离株组和血液分离株组比较,小鼠平均存活天数和肾脏组织载菌量均无显著性差异(P>0.01);无论是皮损分离株还是血液分离株,免疫抑制小鼠的平均存活天数明显短于免疫正常小鼠(P<0.01),同时免疫抑制小鼠的肾脏组织载菌量亦明显高于免疫正常小鼠(P<0.01)。结论不同来源的林生地霉菌株在相同免疫状态下致病性无显著差异;而不同的免疫状态其致病性不同。     

Foxp3~+调节性T细胞在播散性毛孢子菌病小鼠模型的表达研究

目的观察调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)在播散性阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)病小鼠模型中的表达,初步探讨Foxp3~+调节性T细胞在播散性毛孢子菌病发病机制中可能发挥的作用。方法 50只雄性BALB/c小鼠随机分为试验组和对照组,每组25只,分别于尾静脉接种阿萨希毛孢子菌悬液和生理盐水。接种后第3,7,14,21及28天,流式细胞仪检测两组小鼠脾脏单个核细胞悬液中CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞比率;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测两组小鼠脾脏Foxp3 mRNA水平表达情况。结果试验组小鼠脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞比率及Foxp3 mRNA表达随着感染进程先增高后下降至正常水平。接种后第3、28天,试验组小鼠脾脏单个核细胞中CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞的比例与对照组差异无统计学意义(P0.05);接种后第7、14及21天调节性T细胞的比例较对照组明显上升,差异有统计学意义(P0.05)。接种后第3、28天,试验组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平与正常对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);接种后第7、14、21天与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论阿萨希毛孢子菌可以诱导小鼠体内CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞在感染中后期表达增高,调节性T细胞可能参与调节播散性毛孢子菌病的免疫应答。     

无绿藻感染小鼠皮肤模型的构建

目的 构建无绿藻感染小鼠皮肤模型。方法 BALB/c小鼠分为4组,高浓度接种免疫抑制组为免疫抑制小鼠,腹部皮下接种1 × 109孢子/ml中型无绿藻波多黎各变种悬液组;低浓度接种免疫抑制组为免疫抑制小鼠,腹部皮下接种1 × 106孢子/ml悬液组;高浓度接种健康组为健康小鼠,腹部皮下接种1 × 109孢子/ml悬液组;对照组为健康小鼠腹部皮下接种生理盐水溶液,每个部位接种量均为200 μl。接种后第7、14、28天时观察各组小鼠腹部皮损变化,并进行腹部皮肤病理及真菌检查。结果 实验组小鼠接种处均出现丘疹、脓肿,部分出现溃疡、结痂,感染率均为100％。3组小鼠的腹部皮损直径,组内各时间点比较差异均有统计学意义（均P < 0.05）,均在第7天时最大,分别为（6.75 ± 1.09） mm、（5.88 ± 1.17） mm和（5.96 ± 0.99） mm;组间相比,在接种后第7、14天时差异无统计学意义（P > 0.05）,在第28天时差异有统计学意义（F = 8.91,P < 0.05）,高浓度接种免疫抑制组最大为（4.38 ± 0.86） mm。3个实验组基本病理改变为坏死、脓肿、肉芽肿形成,HE染色和过碘酸雪夫（PAS）染色均可见孢子,皮损直接镜检可见孢子,培养为无绿藻生长。对照组未感染无绿藻。结论 腹部皮下接种免疫抑制和健康小鼠均可构建无绿藻病皮肤感染模型。     

裂褶菌致病性的动物实验研究

目的:构建小鼠裂褶菌系统性感染的动物模型并探讨裂褶菌的致病性.方法:将裂褶菌接种于不同免疫状态的清洁级昆明小鼠皮下、腹腔及静脉.观察不同免疫状态、不同接种途径小鼠28 d内的死亡率,对分期处死的小鼠进行解剖、组织逆培养、组织病理学等检查,通过组织菌载量测定方法比较不同免疫状态下小鼠心、肝、脾、肺和肾等主要脏器的感染程度.结果:免疫抑制静脉组与免疫抑制腹腔组小鼠的平均存活天数比较,有统计学差异,其余各组均无自然死亡.无论免疫正常还是免疫抑制状态下,腹腔注射组肝脏感染程度较其他脏器重;静脉注射组肝脏、脾脏感染程度较重.苏木精-伊红染色显示急性炎性细胞浸润,可见组织细胞变性坏死;过碘酸-雪夫(PAS)染色可见炎症组织中有紫红色分枝菌丝.结论:免疫抑制状态小鼠更易引起裂褶菌感染,感染的程度也更重.当进入体内的菌量较多时也可引起免疫正常的小鼠系统性感染,说明裂褶菌的致病力与机体免疫状态密切相关.     

茄病镰刀菌小鼠皮下组织接种致病性实验研究

目的观察不同免疫状态下小鼠皮下组织感染茄病镰刀菌的致病过程,探讨皮肤镰刀菌病发病机制.方法试验动物随机分为4组A组皮下接种(1×106cfu/animal);B组皮下接种(1×108cfu/animal);C组免疫抑制 皮下接种(1×106cfu/animal);D组免疫抑制 皮下接种(1×108cfu/animal).观察小鼠的系统症状(食欲,精神状况,体重)和皮损变化.在不同天数处死小鼠并解剖,皮肤和各脏器行真菌培养和组织病理检查.取小鼠血液行真菌培养.结果四组均见局限性感染,未见播散性感染.相同免疫状态下,感染程度B组》A组,D组》C组;相同接种菌量下C组》A组,D组》B组.皮肤组织病理可以见到茄病镰刀菌较强的血管侵袭性.结论小鼠免疫状况和致病菌接种量是茄病镰刀菌致病的关键因素.茄病镰刀菌有其自身的致病特点.     

系统性尖端赛多孢子菌感染小鼠IL-12表达的研究

建立小鼠系统性尖端赛多孢子菌感染模型,用酶联免疫吸附试验(ELISA)及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测脾内IL-12蛋白质及mRNA水平,用平皿系列稀释法检测肾内菌落形成单位(CFU),并记录平均生存时间(MST)。结果,脾内IL-12蛋白质含量:致死量组均低于正常组;亚致死量组均高于正常组,且第7天显著高于第3天;地塞米松免疫抑制组均高于正常组。此外,免疫抑制组均低于相应时间亚致死量组。脾中IL-12mRNA表达水平与蛋白质水平基本一致。致死量组及免疫抑制组肾内均有大量菌生长,亚致死量组肾内菌量少。致死量感染组平均生存时间为13.6天,免疫抑制组为14.2天,对照组和亚致死量组均超过45天。结果示健康鼠大量菌感染及免疫抑制鼠小量菌感染均可引起致死性感染,而IL-12在小鼠系统性尖端赛多孢子菌感染中可能具有保护作用。     

抑制阿萨希毛孢子菌脂筏形成后对其致病性的影响研究

目的观察阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)脂筏形成被抑制后对其致病性的影响。方法建立小鼠免疫抑制模型,将50只小鼠随机分为5组,每组10只。实验组分别接种经0.2、0.5、1.0、2.0μg/ml两性霉素B处理的菌悬液,对照组接种正常生长的菌悬液。连续观察3周,统计不同组别小鼠致死率,同时将内脏进行组织真菌培养及组织病理检查,计算感染率。结果对照组致死率为80%,内脏感染率为90%。接种经浓度为1.0μg/ml、2.0μg/ml两性霉素B处理而破坏T.asahii脂筏的菌悬液后,致死率和感染率分别为37.5%、20%以及50%、40%,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05);接种经浓度为0.2μg/ml、0.5μg/ml两性霉素B破坏脂筏的菌悬液后,其致死率和感染率亦有不同程度的降低,但与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。感染小鼠的各脏器组织病理改变主要为急性化脓性炎症及肉芽肿性炎症,组织中可见关节孢子和菌丝。结论 T.asahii脂筏形成受到两性霉素B抑制后,其致死率和感染率明显降低,并随着药物浓度的增加而梯度减弱,即致病性相应降低。提示脂筏有可能成为抗真菌药物研究的新的靶位。     

链格孢对ICR小鼠致病性的研究

目的 探讨链格孢对ICR小鼠的致病性.方法 将链格孢的菌悬液分别接种于正常和免疫抑制ICR小鼠的睾丸和足垫,于接种后的第5、7、10、14、21、28、35和42天处死动物,取接种部位的组织和各脏器进行组织病理学检查和逆培养.结果 正常组和免疫抑制组小鼠的接种部位均出现脓肿,免疫抑制组较正常组组织损害程度重,且持续时间长;足垫接种小鼠在正常组脓肿14d自行消退,在免疫抑制组28～35d消退.正常组和免疫抑制组小鼠的接种部位组织逆培养均阳性,组织病理观察见脓肿、粗大菌丝、肉芽肿.实验小鼠均未出现系统播散.结论 链格孢对ICR小鼠是致病性很弱的机会致病菌.     

Cutaneous abscess by Trichosporon asahii developing on a steroid injection site in a healthy adult

We report a rare case of cutaneous abscess by Trichosporon asahii in an immunocompetent adult. A 31-year-old Korean woman presented to our hospital with a cutaneous abscess. She had received an intralesional steroid injection 4 months earlier on the site of a hypertrophic scar. Direct sequencing of the intergenic spacer regions of the rRNA genes identified T. asahii. The decreased local immunity after the steroid injection might have triggered the infection by T. asahii. A cutaneous abscess formation by T. asahii in an immunocompetent patient is an unusual cutaneous finding that to our knowledge has not been reported previously. The local immune reaction of the skin is important for the prevention of Trichosporon infection.     

Ras1、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异

目的 研究Ras1、Rac1和Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异,探讨其在菌丝生长过程中的作用.方法 分别培养阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相,提取两组的总RNA,采用荧光定量PCR方法测定两组中Ras1、Rac1和Rho1 mRNA的相对表达量.结果 酵母相菌丝生成率(0.40％±0.53％)显著低于菌丝相(99.33％ ± 0.57％,t=13.93,P＜0.05).实时荧光定量PCR显示,以酵母相为对照组,将其Ras1、Rac1、Rho1基因表达量均设为1,则菌丝相的Ras1、Rac1、Rho1基因mRNA相对表达量分别为25.17±10.99、16.81±7.80、42.61±18.50,与酵母相比较,差异有统计学意义(t值分别为3.81、3.51、3.90,均P＜0.05).结论 Ras1、Rac1、Rho1基因可能参与了阿萨希毛孢子菌菌丝的生长过程.     

正常人表皮 真皮结合珠蛋白mRNA表达研究

目的　检测正常人表皮及真皮内结合珠蛋白mRNA的表达。方法　采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法。结果　在 12例正常人表皮及真皮总RNART PCR产物中均扩增出结合珠蛋白片段。结论　在正常人表皮及真皮内均有结合珠蛋白mRNA的表达。     

结合珠蛋白在正常人表皮细胞及HaCaT细胞中的表达

目的 检测正常人表皮细胞及HaCaT细胞中结合珠蛋白(Hp)mRNA及蛋白的表达。方法 用原位杂交及RT-PCR法检测正常人表皮细胞及HacaT细胞中Hp mRNA的表达，用免疫组化法检测正常人表皮中Hp的表达；用免疫组化法及蛋白质免疫印迹法检测HaCaT细胞中Hp的表达。结果 在正常人表皮角质形成细胞(KC)及HaCaT细胞中Hp mRNA表达阳性；正常人表皮朗格汉斯细胞(LC)中Hp mRNA表达阴性；正常人表皮内可见Hp阳性的树突状细胞。用免疫组化法在每个HaCaT细胞胞质中未见明显Hp染色，但用蛋白质免疫印迹法在HacaT细胞中检测到Hp蛋白。结论 正常人KC及HaCaT细胞有合成Hp能力，正常人表皮LC无合成Hp的能力，在HaCaT细胞中有少量Hp表达。     

地塞米松及甲氨蝶呤上调HaCaT细胞结合珠蛋白的表达

目的:探讨地塞米松及甲氨蝶呤对人角质形成细胞系HaCaT细胞合成结合珠蛋白(Hp)的影响。方法:采用RT-PCR方法检测Hp mRNA表达水平,ELISA方法检测Hp浓度。结果:地塞米松或甲氨蝶呤刺激HaCaT24h后,HaCaT细胞表达Hp增加;但较短刺激时间或较低刺激浓度时,HaCaT细胞表达Hp水平无明显变化。结论:地塞米松及甲氨蝶呤能够上调HaCaT细胞Hp的合成,这种作用具有时间依赖性及剂量依赖性的趋势。     

阿萨希丝孢酵母五种培养基培养观察

目的：观察阿萨希丝孢酵母在五种不同培养基中的形态。方法：分别接种在沙堡弱培养基（SDA）、马铃薯培养基（PDA）、麦芽浸膏琼脂培养基（MEA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）、察氏培养基（CDA），25℃培养。结果：SDA和PDA培养基菌落土黄色、颗粒状、表面明显皱折。镜下见分支隔透明菌丝，矩形、圆形、椭圆形或不规则形节孢子。孢子一边或多边出芽，可形成多个芽管，并有间生或顶生厚壁孢子。其他培养基则生长较差。结论：SDA及PDA较适合阿萨希丝孢酵母生长。     

氟康唑诱导耐药的阿萨希毛孢子菌ERG11基因表达研究

目的 探讨ERG11基因在阿萨希毛孢子菌耐药的作用以及基因表达量与药物浓度间的关系.方法 通过氟康唑体外诱导获得阿萨希毛孢子菌耐药菌株,将敏感株与耐药株同时置于含0~64μg/ml浓度氟康唑的培养基中培养,用实时PCR检测ERG11基因的表达情况.结果 在无药情况下,阿萨希毛孢子菌耐药株组ERG11基因表达(7.542±5.311)高于敏感株组(1.014±0.012),两组比较t=3.002,P=0.03.在不同浓度氟康唑作用下,耐药株组ERG11 mRNA水平分别为9.183±3.226,13.657±5.428,15.292±7.007,13.720±8.550,13.949±2.960,13.123±6.429,亦高于敏感株组3.281±2.068,3.459±1.923,3.242±2.530,3.651±0.728,3.969±1.924,3.824±1.875,均P<0.05.但ERG11表达量与氟康唑浓度之间差异无相关性(耐药株rs=0.229,P=0.096;敏感株rs=0.166,P=0.357).结论 阿萨希毛孢子菌ERG11基因过表达与氟康唑耐药有关.ERG11基因mRNA表达与氟康唑浓度之间无相关性.     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对人THP-1单核细胞抗阿萨希毛孢子菌活性增强作用的研究

目的研究重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rh GM-CSF)对单核细胞吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)功能的影响。方法不同浓度的rh GM-CSF(100 U/ml、200 U/ml及400U/ml)与人THP-1单核细胞预孵育48 h后,加入T.asahii临床株共培养1 h,应用瑞氏-姬姆萨染色,倒置显微镜下观察人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬情况;菌落计数法评估人THP-1单核细胞对T.asahii的杀伤情况。结果 rh GM-CSF预孵育可使人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬率从20%提高到84%左右。人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬率随rh GM-CSF浓度增高而升高,具有浓度依赖性。200 U/ml及400 U/ml的rh GM-CSF预孵育组,每毫升T.asahii菌落形成单位较对照组明显减少(P0.05)。结论 rh GM-CSF可明显增强人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬、杀伤活性。