磷酸胆碱聚合物载AT1受体反义寡核苷酸对自发性高血压大鼠血压及心血管重构的影响

目的 探讨磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体反义寡核苷酸(AS-ODN)对自发性高血压大鼠(SHR)血压及心血管重构的影响.方法 将MPC30-DEA70(N)与FAM-AS-ODN(P)按不同N/P比值络合后经尾静脉注入SD大鼠体内,未经处理的SD大鼠为对照,3周后观察复合物在全身各组织器官的分布.再将MPC30-DEA70与AT1受体AS-ODN按不同N/P比值络合后经尾静脉注入8周龄SHR大鼠体内,未经处理的SHR大鼠为对照,3周后测量尾动脉压,对主动脉及心肌组织行天狼星红染色,并用Western blot法和RT-PCR法检测AT1受体蛋白及mRNA表达情况.结果 MPC30-DEA70/FAM-AS-ODN复合物能够进入肾脏组织;空白对照组和N/P=1∶0组的尾动脉压持续上升,缬沙坦组、N/P=10∶1组和N/P=1∶1组的尾动脉压较空白对照组明显下降;空白对照组和N/P=1∶0组心肌细胞肥大,主动脉壁增厚,胶原纤维大量沉积,而缬沙坦组、N/P=10∶1组和N/P=1∶1组上述情况较空白对照组明显改善;N/P=10∶1组和N/P=1∶1组AT1a蛋白和mRNA表达较空白对照组显著降低.结论 MPC30-DEA70能够安全有效地进入肾脏各组织,在体内运载AT1受体AS-ODN,下调AT1受体蛋白及其mRNA表达,抑制SHR大鼠血压进展及心血管重构,是一种创新性的非病毒类基因运输载体.     

新型双嵌段磷酸胆碱基共聚物作为siRNA基因运输载体研究

将载体MPC30-DEA70(N)与siRNA (P)在N/P比值不同的条件下复合,用DNA凝胶电泳法,倒置显微镜,MTT法表征复合物溶液;同时分析胎牛血清(FBS)对细胞转染的影响.结果 显示在无胎牛血清条件下siRNA能与载体MPC30-DEA70电性中和,N/P比值越大中和的越多,而有胎牛血清的条件下siRNA几乎不能与载体MPC30-DEA70电性中和;倒置显微镜观察到siRNA分子能进入细胞,转染效率随着N/P比值增大而增大;同时随着载体浓度增大,对细胞的增殖抑制性增强.以上结果显示,新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70可以有效负载和运输siRNA,是一种安全有效的非病毒类转基因载体.     

双嵌段磷酸胆碱基聚合物作为c-myc AS-ODN基因运输载体研究

目的 探讨双嵌段磷酸胆碱基聚合物MPC30-DEA70 作为反义寡核苷酸（AS-ODN）运输载体的安全性和有效性.方法 将载体MPC30-DEA70（N）与c-myc AS-ODN（P）在不同N/P比值的条件下复合,应用DNA凝胶电泳法、荧光显微镜、流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法对复合物溶液进行检测,观察复合物在HeLa细胞中的转染情况.结果 c-myc AS-ODN能与载体MPC30-DEA70电性中和,N/P比值越大复合物正电性越强;MPC30-DEA70/AS-ODN复合物能够进入细胞,转染效率随着N/P比值增大而增大;同时随着N/P比值增大复合物对细胞的增殖抑制作用显著增强.结论 MPC30-DEA70可以有效负载和运输c-myc AS-ODN,抑制HeLa细胞增殖,是一种新型的、安全有效的非病毒类转基因载体.     

磷酸胆碱聚合物载TGF—β1反义寡核苷酸转染血管外膜成纤维细胞对TGF—β1的影响

目的观察新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否有效地转染针对转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的反义寡核苷酸（AS—ODN）进入到血管外膜成纤维细胞中及转染后对血管外膜成纤维细胞内TGF-β1表达的影响,为MPC30-DEA70,聚合物作为药物基因治疗载体在心血管疾病中的运用奠定基础。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞;应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察MPC30-DEA70／TGF-β1AS-ODN（FAM标记）在细胞内的分布和定位;流式细胞仪（FCM）检测二者的细胞转染效率、荧光强度;免疫印迹实验（Western blot）检测TGF-β1细胞内表达。结果①原代培养的细胞呈纺锤形,多角形或者不规则形,细胞核较大,数量1～2个不等,轮廓清楚,核仁大而明显,呈椭圆形;②激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围;③流式结果显示转染效率及荧光强度随N／P比增加而明显增大;④Western blot结果显示随着N／P比值的增大,TGF-β1的蛋白表达明显下降（P〈0．05）。结论MPC30-DEA70,能够携带TGF-β1-AS—ODN进入离体培养的大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞,并能下调TGF—β1蛋白的表达。     

磷酸胆碱聚合物作为药物运输载体转染大鼠心肌细胞的体外研究

目的探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否安全有效地转染进入心肌细胞.方法应用原子转移自由基聚合法 (ATRP)合成具有高度生物相容性的双嵌段的MPC30-DEA70,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记,并对材料的溶液进行表征;采用MTT法检测MPC30-DEA70与心肌细胞的相容性;应用荧光显微镜(FM)、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)、透射电镜(TEM)观察MPC30-DEA70在细胞内的分布和定位;流式细胞术(FCM)检测MPC30-DEA70的细胞转染效率和荧光强度.结果 MPC30-DEA70与心肌细胞具有较好的细胞相容性,在较高浓度下才表现出一定的细胞毒性并呈现剂量依赖性;MPC30-DEA70可以进入到心肌细胞内部,大部分分布于核周围,少部分可以进入细胞核,对心肌细胞的超微结构无明显影响;MPC30-DEA70在心肌细胞内具有较高的转染效率和荧光强度,并呈剂量依赖性.结论 新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70可以安全有效转染心肌细胞,是一种理想的非病毒类药物或基因运输载体.     

新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70转染血管平滑肌细胞的体外研究

目的 探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70（PC聚合物）转染进入体外培养的血管平滑肌细胞（VSMCs）的安全性和有效性.方法 应用ATRP法合成具有高度生物相容性的PC聚合物MPC30-DEA70;植块贴壁法原代培养大鼠VSMCs;MTT法检测PC聚合物与VSMCs的细胞相容性;应用FM及CLSM观察PC聚合物在细胞内的分布和定位;FCM法检测PC聚合物在VSMCs中的转染效率和荧光强度.结果 PC聚合物与原代培养的VSMCs具有较好的细胞相容性,随浓度的增高表现出一定的细胞毒性;PC聚合物可以转染进入VSMCs,大部分分布于细胞质及核周围,少部分可以进入到细胞核内;PC聚合物在VSMCs中具有较高的转染效率和荧光强度,并呈剂量依赖性.结论 新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70可以转染进入血管平滑肌细胞,是一种安全有效的非病毒类药物运输载体.     

靶向血管紧张素Ⅱ受体基因的短发夹RNA的功能比较

目的:研究哺乳动物细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的有效性并探索有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系. 方法:设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体,转染大鼠神经胶质瘤C6细胞,并在不同时相收集转染的细胞,进行RT-PCR和Western blot检测. 结果:转染24 h之后,各处理组均未见AT1 mRNA水平有明显减少. 与对照组相比,Pb组在转染后48 h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到(55.7±7.6)%,72 h后达到最低点(43.7±8.2)%. 其它组AT1受体mRNA表达无明显抑制(P＞0.05). 抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似. 与对照组相比,Pb组血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24 h和48 h分别减少至(46.9±4.2)% 和(37.0±3.7)%,最大减少在转染后72 h (28.1±4.0)%. 结论:选择有效的shRNA序列时,除了一般的原则之外,靶位mRNA的环状结构及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用.     

RNA干扰沉默VDR基因对小鼠成骨细胞Dmp1?Cbfa1及BMP-2 mRNA 表达的影响

目的:利用RNA干扰技术,阻断VDR在小鼠成骨细胞株mc3t3-E1中的表达,观察VDR表达受抑后对小鼠成骨细胞Dmp1、Cbfa1及BMP-2基因mRNA表达的影响.方法:针对小鼠VDR mRNA 144、594、852、3 628位点设计、合成4对21核苷酸siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4);在阳离子脂质体介导下转染mc3t3-E1细胞,以空白及非特异性siRNA作为对照,各组于转染24 h及72 h后收集细胞分别抽提RNA及蛋白.采用RT-PCR法检测细胞中VDR mRNA表达水平的改变,Western blot法检测VDR蛋白表达的变化,从而筛选有效序列.进一步应用SYBR Green荧光实时PCR方法定量检测成骨细胞功能基因-Dmp1、cbfa1及BMP-2基因mRNA表达情况.结果:与空白对照组相比,转染siRNA3、siRNA4的mc3t3-E1细胞VDR mRNA和蛋白表达明显下调(P＜0.01).转染siRNA1、2及非特异性siRNA的mc3t3-E1细胞VDR的表达与对照组相比无显著差异(P＞0.05).荧光定量PCR结果显示,转染siRNA3、siRNA4的mc3t3-E1细胞Dmp1、cbfa1、BMP-2mRNA表达明显下调(P＜0.01).结论:针对小鼠VDR mRNA 852、3 628位点设计、合成的siRNA可有效抑制小鼠成骨细胞株VDR的转录和表达;VDR表达受抑可下调mc3t3-E1细胞功能基因Dmp1、Cbfa1、BMP-2mRNA的表达;VDR在维持成骨细胞功能中起着一定的作用.     

AT2受体基因敲除后对小鼠肾脏中TGFβ表达的作用

目的:探讨血管紧张素Ⅱ2型(AT2)受体基因敲除后对肾组织中转化生长因子β(TGFβ)的作用,揭示AT2受体基因缺失后导致肾脏损伤的机制。方法:检测了3～24月龄野生型(AT2 / )和AT2受体基因敲除(AT2-/-)两种小鼠血浆中血管紧张素Ⅱ活性,以及肾组织中血管紧张素Ⅱ1型(AT1)受体、TGFβ和纤维连接蛋白(FN)的基因表达,并观察了12～21月龄的AT2-/-小鼠经过AT1受体拮抗剂缬沙坦治疗(30mg/kg/日)3个月后肾组织中TGFβ和FN的mRNA表达改变。结果:(1)随着小鼠月龄的增长,在21和24月龄时,AT2-/-小鼠血浆中血管紧张素Ⅱ的活性显著高于同龄AT2 / 小鼠。(2)在15～24月龄时,AT2-/-小鼠肾组织中AT1受体、TGFβ和FN的mRNA表达明显增强,显著高于同龄的AT2 / 小鼠和3月龄的AT2-/-小鼠,而在AT2 / 小鼠各月龄组中,肾组织中AT1受体、TGFβ和FN的mRNA表达水平则未见明显改变。(3)12～21月龄的AT2-/-小鼠经AT1受体拮抗剂缬沙坦治疗后,肾组织中TGFβ和FN的mRNA表达水平与同龄未治疗的AT2-/-小鼠比较有显著降低。结论:AT2受体基因敲除后导致的肾脏损伤可能与AT1受体的功能增强,以及引起的TGFβ表达增强、细胞外基质产生增多有关。