儿童急性淋巴细胞白血病免疫球蛋白重链和T细胞受体δ基因分析

目的　研究儿童急性淋巴细胞白血病 (ALL)中免疫球蛋白重链 (IgH)基因、T细胞受体δ(TCRδ)基因重排的发生率及其临床特征。方法　 88例儿童ALL采用套式聚合酶链反应 (PCR)技术检测IgH、TCRδ 重排 ,结合流式细胞仪 (FCM )检测免疫表型和细胞形态学FAB分型。结果　IgH基因重排 2 8例 ,阳性率 31 81% ;TCRδ 基因重排 31例 ,阳性率 35 2 3%。两者均表达者 10例 ,阳性率 11 36 %。在 73例B系ALL中IgH基因重排 2 8例 ,阳性率 38 36 % ,TCRδ 表达 2 5例 ,阳性率 34 2 5 % ,两者均表达者 10例 ,阳性率 5 6 8%。在 15例T系ALL中未检出IgH基因重排 ,仅 5例为单纯表达TCRδ 基因重排 ,阳性率 33 33%。在B系ALL中IgH表达高水平与T系ALL中IgH未表达相比 ,( χ2 =13 74 ,P <0 0 0 5 ) ,有显著性差异。 88例儿童ALL中的 85例获完全缓解 (CR) ,缓解率 96 6 % ,对其中 5例患儿IgH基因重排PCR动态观察 ,结果分别在完全缓解 (CR) 15个月、18个月、2 0个月、2 4个月时转阴。结论　 ( 1)TCRδ 基因重排在儿童ALL中为高表达 ,在B系与T系ALL中表达相比 ,( χ2 =1 0 7,P >0 0 5 ) ,无显著性差异。 ( 2 )IgH、TCRδ 基因重排是儿童急性淋巴细胞白血病的特异性基因重排 ,该项检测有助于ALL克隆性诊断和基因分型。 ( 3)监     

聚合酶链反应检测急性淋巴细胞白血病T细胞受体基因重排分析

应用聚合酶链反应（PCR)扩增T细胞受体(TCR）δ基因重排，检测3例急性淋巴细胞白血病(ALL)骨髓与骨髓涂片标本．其中1例初发和1例未完全缓解的标本检测出基因重排，1例完全缓解的标本未检测出基因重排。对照标本均未检测出基因重排。     

非霍奇金淋巴瘤基因重排的检测及其临床意义

目的 探讨免疫球蛋白重链（IgH）及T细胞受体γ（TCRγ）基因重排在非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin＇s lymphoma,NHL）临床诊断中的应用.方法 用聚合酶链反应（PCR）技术对58例B细胞淋巴瘤（B-NHL）、15例T细胞淋巴瘤（T-NHL）、不能确诊为NHL的标本5例及10例良性淋巴组织增生标本进行IgH及TCRγ基因重排的检测.结果 58例B细胞淋巴瘤标本中有IgH基因重排为47例,有3例TCRγ基因重排.15例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为11例,未见有IgH基因重排.5例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排.10例良性淋巴组织反应性增生病例中,IgH及TCRγ基因重排均为阴性.IgH及TCRγ基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间,差异有显著意义（P＜0.05）.结论 用PCR方法检测IgH及TCRγ基因重排对NHL及其疑难病例有重要的诊断价值.     

免疫球蛋白重链和T细胞受体(γ)基因重排与慢性粒细胞白血病预后相关性探讨

目的探讨IgH和TCRγ基因重排与慢性粒细胞白血病(CML)预后的相关性。方法采用PCR法对53例不同时期CML患者免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体(TCR)γ基因重排进行研究。结果检出IgH基因重排阳性27例,TCRγ基因重排阳性3例,其中IgH Fr3A克隆性重排在CML慢性期(42.3％)远较加速期为少(76.6％),二者差异有显著意义(P<0.05)。结论CML各期出现免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体(TCR)γ基因重排与预后有一定相关性。     

儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的流式细胞术检测分析

目的探讨流式细胞术检测微小残留病（MRD）在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗中的临床价值。方法用多种四色荧光抗体组合检测50例正常儿童骨髓,据此建立双参数点图分析模型,500例ALL初发患儿行流式细胞分析,选出异于正常骨髓细胞免疫表型组合来检测MRD,根据确定好的免疫表型组合对105例患儿诱导治疗结束及后续治疗中的骨髓标本行MRD监测,同步行细胞形态学检测和PCR检测。结果流式细胞术检出462例有效MRD免疫表型组合,PCR检出142例判断MRD的融合基因或IgH／T淋巴细胞受体基因重排;细胞形态学对诱导治疗后的患儿的MRD阳性检出率为66．67％,流式细胞术的MRD阳性检出率为91．43％。结论流式细胞术能对ALL患儿治疗期间的MRD作出准确评估,具有较好的覆盖面和敏感性,值得临床应用。     

辅助性T细胞9在类风湿关节炎发病中的作用探讨

目的 探讨Th9细胞及相关细胞因子在类风湿关节炎(RA)中表达的改变及可能的机制.方法 采集20例健康人(HC)和20例RA患者(RA组)的外周血,用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-9、IL-4、转化生长因子(TGF)-β和干扰素(IFN)-γ水平;流式细胞术检测Th9细胞数;实时定量PCR检测IL-9 mRNA、转录因子PU.1 mRNA,分析这些指标可能的相互关系.结果 RA组患者外周血中CD4+ IL-9+T细胞、CD4+ PU.1 +T细胞、CD4+ IL-9+ PU.1 +T细胞均缺如.细胞因子检测:IL-9水平在HC组为(1.24±0.44)×10-9 g/L,RA组为(1.33 ±0.53)×10-9 g/L(P =0.558);IL-4水平在HC组为(8.59±4.07) ×10-9 g/L,RA组为(5.95±5.73) ×10-9 g/L(P =0.101);TGF-β水平在HC组为(1238±329) μg/L,RA组(712±254) μg/L,(P=0.00);IFN-γ水平在HC组均低于检测水平,RA患者中5例IFN-γ水平升高.HC组IL-9 mRNA表达为(0.24±0.04),RA组为(0.24±0.02) (P =0.764);HC组PU.1 mRNA表达为(0.38 ±0.02),RA组(0.13±0.02) (P =0.000).结论 RA组患者外周血促Th9分化关键细胞因子水平降低.抑制其分化关键细胞因子平有所升高,导致PU.1 mRNA表达受抑,PU.1蛋白无法合成不能支持IL-9mRNA表达.RA患者外周血不存在Th9细胞分化条件,推测循环血Th9细胞可能不参与RA发病机制.     

定量检测WT-1基因在急性髓细胞白血病的表达水平及其临床意义

目的 通过采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测急性髓细胞白血病(AML)患者WT-1基因的表达情况,分析其表达水平与AML患者亚型关系,及其在AML临床疗效的作用.方法 采用实时荧光定量PCR方法分别检测10例正常人及48例初诊急性髓细胞白血病患者骨髓细胞WT-1基因mRNA的表达水平(拷贝数),将ABL基因作为内参照基因,比较AML组与对照组WT-1基因表达水平的差异性,以WT-1基因表达水平的中位数作为界值,将48例初诊AML分为WT-1基因高表达组和低表达组,并通过高表达组和低表达组间CR1率(初次诱导化疗缓解率)的差异,从而分析WT-1基因表达水平与急性髓细胞白血病预后的关系.结果 对照组WT-1基因表达水平中位数为0.008(0～0.019),AML组WT-1基因表达水平中位数为0.679(0～1.680),WT-1基因在AML骨髓细胞表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.001).WT-1表达对AML患者治疗效果的影响:AML各亚型高表达组与低表达组初次诱导后完全缓解率(CR1率)差异有统计学意义(P＜0.05),WT-1高表达组缓解率低于低表达组,AML患者WT-1基因高表达组疗效比低表达组疗效差.结论 WT-1基因可作为AML微小残留病(MRD)的分子标志,也可作为AML预后分层的分子学指标.     

ITP中IFN-γ和IL-4 mRNA表达与其甲基化水平的相关性研究

目的:检测免疫性血小板减少症(ITP)患者的干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-4的mRNA表达水平及其各自基因启动子区DNA甲基化的水平.方法:取36例ITP患者(ITP组)和36例正常对照(对照组)外周血,采用实时定量PCR方法检测IFN-γ和IL-4的mRNA水平;随机抽取2组中的各10例,采用DNA甲基化修饰后测序的方法检测IFN-γ和IL-4基因启动子区的甲基化水平,并计算IFN-γ和IL-4基因的mRNA水平与其基因启动子区DNA甲基化水平的相关性.结果:与对照组相比,ITP组IFN-γ的mRNA水平增高(1.86±0.29 vs 0.83±0.14,P＜0.05),而IL-4的mRNA水平降低(0.78±0.22 vs 1.45±0.40,P＜0.05),Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)比值升高(7.11±0.60vs 3.12±1.88,P＜0.01).2组IFN-γ和IL-4基因CpG岛的位点甲基化水平和整体甲基化水平差异均无统计学意义(P＞0.05).ITP组中IFN-γ和IL-4的mRNA表达水平与基因启动子区甲基化水平不存在相关性(均P＞0.05).结论:ITP患者处于Th1极化状态,IFN-γ和IL-4的基因启动子区的甲基化水平对各自基因mRNA水平的表达不起调控作用.     

CCLG-ALL2008方案治疗儿童急性淋巴细胞性白血病的临床疗效

目的 分析CCLG-ALL2008方案分型治疗儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)的临床疗效.方法 198例ALL患儿按CCLG-ALL2008方案分型治疗.其中,标危型(SR)组85例,中危型(MR)组66例,高危型(HR)组47例.首次化疗结束(第33天)用流式细胞术监测微小残留病(MRD).结果 三组第33天总完全缓解(CR)率为94.4％;其中,SR、MR组为100％,HR组为76.6％;缓解所需时间分别为(19.2±7.7)d、(23.7±9.1)d和(29.3±10.5)d(P＜0.05).197例中,20例(10.2％)复发,10例(5.1％)死亡.无病存活187例(94.9％).三组平均生存时间为(19.2±0.6)个月.CR时,HR组、MR组MRD阳性率及CR率均高于SR组(P＜0.05).结论 CCLGALL2008方案治疗儿童ALL CR率高,早期复发率低.     

B细胞非霍奇金淋巴瘤患者IgH基因重排检测分析及意义

目的探讨外周血和骨髓免疫球蛋白重链(Immunoglobulin heavy chain,IgH)基因重排检测方法及其在监测B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)患者微小残留病(Minimal residual disease,MRD)中的临床意义。方法应用PCR-SSP方法对B-NHL患者进行IgH基因重排检测,回顾性分析39例B-NHL患者IgH基因重排动态检测结果来了解其与临床MRD的关系。结果 39例B-NHL初诊未经治疗患者IgH基因重排检测34例阳性,阳性率87.1%(34/39)。34例初诊阳性患者,治疗后19例达到临床完全缓解的患者中16例IgH基因重排转阴,3例持续阳性;15例临床部分缓解者,IgH基因重排持续阳性。分析发现13例患者骨髓和外周血标本IgH基因重排均呈阳性。结论 IgH基因重排检测可以作为B-NHL的辅助诊断及其微小残留病的监测。     

染色质免疫沉淀ChIP技术检测传代培养细胞Grb1O组蛋白乙酰化水平

目的 检测传代培养过程鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10中组蛋白乙酰化水平的改变.方法 应用染色质免疫沉淀ChIP技术和荧光定量PCR (Q-PCR)分析,检测传代培养细胞中印迹基因Grb10组蛋白乙酰化水平.结果 应用ChIP和Q-PCR检测出印迹基因Grb10组蛋白乙酰化水平上升.结论 ChIP技术与实时荧光定量PCR技术的结合,通过免疫共沉淀作用和后续PCR定量分析,可以有效地检测目的基因的组蛋白修饰水平;鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的乙酰化水平受体外传代培养的影响.     

实时荧光定量聚合酶链反应对结核性胸膜炎的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测胸腔积液结核分枝杆菌DNA对结核性胸膜炎的诊断价值。方法对88例结核性胸膜炎患者和32例恶性胸腔积液标本行实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA。结果88例患者胸腔积液实时荧光定量PCR检测阳性36例(40.91%),32例恶性胸腔积液实时荧光定量PCR检测阳性1例(3.13%)。2组阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论胸腔积液实时荧光PCR检测对结核性胸膜炎早期诊断有重要仍价值。     

儿童急性淋巴细胞白血病中期因子表达的临床研究

目的:检测儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中期因子(MK)的表达,探讨MK在儿童ALL发病中的意义.方法:应用实时定量PCR(real-time PCR),对124例进展期和缓解期ALL患者、15例正常儿童骨髓标本进行MK mRNA的检测.根据患者初治时外周血白细胞数、年龄、免疫分型及皮质激素预治疗反应等因素把进展期患者分为标危组、中危组和高危组.结果:进展期、缓解期及正常对照组之间MK水平比较差异有统计学意义(P < 0.01).MK mRNA在B-ALL亚型中表达显著高于T-ALL亚型及正常对照(均P < 0.01),而T-ALL与正常对照之间MK mRNA的表达差异无统计学意义(P > 0.05).在ALL危险度各分层中,标危组和中危组的MK表达水平明显高于高危组(P < 0.01 或P < 0.05),标危组与中危组之间差异无统计学意义(P = 0.32).MK表达水平与患儿年龄、性别、血浆乳酸脱氢酶等未显示出相关性(均P > 0.05).高白细胞组(WBC ≥ 25×10~9/L)MK的表达较白细胞不增高组(WBC < 25×10~9/L)明显降低(P < 0.05).结论:MK表达增高在儿童ALL中可能为预后良好的指标.     

己烯雌酚对HOSE细胞中HOXA10基因表达及DNA甲基化的影响

目的研究己烯雌酚对人正常卵巢上皮细胞株HOSE中HOXA10基因表达及基因启动子区CpG岛甲基化的影响。方法用不同浓度的己烯雌酚(5×10-6、5×10-7、5×10-8 mol/L)作用于体外培养的人正常卵巢上皮细胞株HOSE。培养5d后收集细胞,应用实时荧光定量PCR和Western blot检测HOXA10基因mRNA和蛋白的表达;运用甲基化特异性PCR检测HOXA10基因启动子区CpG岛的甲基化状态。结果己烯雌酚作用后,HOSE细胞中HOXA10基因mRNA和蛋白表达上调(P<0.05),并且HOXA10基因启动子区发生去甲基化改变。结论己烯雌酚可以上调人正常卵巢上皮细胞株HOSE中HOXA10基因的表达,与其对HOXA10基因启动子区CpG岛甲基化的影响有关。     

WT1基因在急性白血病患者中的表达及其临床意义

目的:探讨WT1基因在急性白血病(AL)患者中的表达情况及其临床意义.方法:采用实时定量RT-PCR方法动态检测60例初治AL患者WT1基因的表达,评估AL患者的缓解率、复发率及完全缓解后微小残留病(MRD)检测.结果:初治AML各亚型中M3基因表达阳性率最高,为82.4%,其WT1基因中位表达水平最高,达1579.6,显著高于其他亚型,差异有统计学意义(P<0.05);AL患者中,WT1基因表达阳性组CR率显著低于阴性组,阳性组缓解后半年内复发率显著高于阴性组,差异均有统计学意义(均P<0.05),初治组、复发组及未缓解组AL患者WT1基因中位表达水平明显高于完全缓解组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论:WT1基因在AL患者骨髓细胞中表达水平可作为临床评估疾病的发生、发展、判断预后及检测MRD的指标.     

老年急性淋巴细胞白血病大剂量甲氨蝶呤治疗患者β_2-MG、CyclinB2水平和IgH基因重排及其临床意义

目的探讨老年急性淋巴细胞白血病大剂量甲氨蝶呤治疗患者β_2-MG、CyclinB2水平和IgH基因重排及其与预后的关系。方法以老年急性淋巴细胞白血病患者36例为研究对象,均采用大剂量甲氨蝶呤[3g/(m~2·d)]治疗,并随访至少1年。采用放射免疫法检测其治疗前的外周血β_2-MG水平,实时定量RTPCR法检测外周血CyclinB2,并采用半巢式PCR方法检测外周血IgH基因重排,统计其随访1年生存率。结果 36例患者1年生存率为80.56%(29/36)。与其存活患者比较,其死亡患者治疗前外周血CyclinB2和β_2-MG水平较高,IGH基因重排阳性率亦较高(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,老年急性淋巴细胞白血病外周血β_2-MG、CyclinB2水平和IgH基因重排率与其1年生存率均呈负相关(r=-0.844,-0.818,-0.852,P<0.05)。结论老年急性淋巴细胞白血病大剂量甲氨蝶呤治疗患者β_2-MG、CyclinB2水平和IgH基因重排与其预后情况密切相关,且三者联合预测患者预后价值良好,可能作为老年急性淋巴细胞白血病大剂量甲氨蝶呤治疗预后评估参考指标。     

流式细胞术对急性白血病微小残留病的检测及意义

目的 探讨流式细胞术(FCM)检测追踪急性白血病(AL)患者骨髓微小残留病(MRD)变化的临床意义.方法 应用FCM以白血病细胞(LC)特异分化抗原为标志监测43例初治AL患者MRD,并与传统骨髓形态学结果进行比较.结果 预测各组患者复发的敏感性和特异性分别为:完全缓解(CR)1～5个月组为100%(13/13)和76.6%(23/30), CR 6～11个月组为100%(4/4)和87%(20/23), CR 12个月～组为100%(2/2)和100%(13/13),对所有第1次受检MRD为阳性随后确认为复发的患者,比骨髓像诊断复发平均提前4个月.43例初治AL患者CR时MRD定量检测结果显示:(1) MRD阴性25例,其中16例在追踪期内亦持续阴性;9例转阳性,经强化疗后再转阴,但6例复发,其中3例发生了中枢神经系统白血病(CNSL);(2) MRD阳性18例,其中10例CR时MRD平均值为2.20%,在缓解期MRD值逐渐减少,直至转阴;8例CR时MRD值较高或持续高值,此8例均复发;(3)骨髓复发组(19例)CR时MRD定量值平均为0.48%,未复发组(24例)为0.06%(P＜0.05).结论 采用FCM检测AL的MRD,具有简单、快速有效、敏感和创伤小的优点,可比传统骨髓形态学更早提示复发.尤其是采取连续性定期监测、动态观察的方式,会进一步增加检测结果的准确性,对提示复发、预测预后及指导个体化治疗有重要意义.     

内标实时荧光定量PCR技术在HCVRNA定量检测中的应用分析

目的比较内标实时荧光定量PCR技术及国产实时荧光定量PCR法检测HCV RNA载量的检测结果,研究两种检测方法的灵敏度。方法采集丙肝患者抗病毒治疗前28例、治疗4周29例及治疗结束时29例患者外周血标本,分别用内标实时荧光定量PCR技术(COMBAS Taqman全自动分析系统)及国产实时荧光定量PCR法检测同一血清其HCVRNA定量值。结果内标实时荧光定量PCR技术最低检出下限是15IU/mL,抗病毒治疗前28例患者两种方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05);抗病毒治疗4周时29例患者病毒载量经内标实时荧光定量PCR技术检测产生RVR的百分比是24.14%,而国产实时荧光定量PCR法产生RVR的百分比是检测79.31%,差异有统计学意义(χ2=16.39,P<0.01);抗病毒治疗结束时29例患者HCVRNA载量经内标实时荧光PCR法检测阳性率为20.69%,而国产实时荧光定量PCR法检测阳性率为3.45%。结论内标实时荧光定量PCR技术较国产实时荧光定量PCR法检测HCVRNA载量灵敏,能够提供更精确的数据。     

荧光定量PCR检测TRECs的标准品质粒和标准曲线的构建

目的 构建荧光定量PCR检测T细胞受体重排切除环(TRECs)的标准品质粒和标准曲线.方法 对TCRδ基因进行序列分析,设计一对引物和探针.提取正常人外周血单个核细胞中的DNA,经普通PCR扩增,产物纯化后与pUCM-T载体连接并转化入大肠杆菌DH5α,筛选得到重组成功的质粒.结果 重组质粒测序后显示目的片段序列正确,表明TRECs基因片段成功克隆.以103～107 copies/ml不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后,统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系(r=-0.998,P＜0.01).结论 所构建的TRECs标准品特异性和线性关系较好.     

多药耐药相关蛋白在乳腺癌患者外周血单个核细胞中的表达研究

目的检测健康人和乳腺癌患者外周血单个核细胞中多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)基因的表达水平,探讨MRP在乳腺癌患者中的可能作用。方法抽取20例健康人和50例乳腺癌患者外周血,运用ELISA法检测2组实验对象血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、白介素6(IL-6)细胞因子的含量;提取外周血中单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells,PBMCs),后用荧光实时定量PCR和Western blot技术检测BCRP和MRP2/3/4/5 mRNA和相应蛋白表达情况。结果 ELISA法检测乳腺癌患者外周血血清中TNF-α、IL-8、IL-6细胞因子的含量明显高于健康人对照组(P<0.05);荧光实时定量PCR检测BCRP和MRP5的mRNA表达水平高于健康人对照组(P<0.05),其余MRP没有显著性差别(P>0.05);Western blot检测蛋白表达与mRNA结果一致。结论乳腺癌患者外周血中的促炎因子含量的升高与BCRP和MRP5的表达调控有一定关系,具体相关机制有待进一步研究。