DDPH对HECCM促PASMC增殖后的逆转效应研究

利用低氧内皮细胞条件培养基（HECCM）建立猪肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的增殖模型；以四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、α平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin)为指标，用免疫细胞化学染色及透射电镜等方法观察不同浓度DDPH[1-(2,6-dimethylphenoxy)-2-(3,4-dimethoxy phenylethylamino)propane hydrochloride]对HECCM促PASMC增殖后的逆转效应。结果表明：HECCM促PASMC增殖后，PASMC的表型发生转化，由收缩表型转化为合成表型，PASMC胞质内的α-SM-actin含量下降；而DDPH能使HECCM促PASMC增殖后的表型逆转，即由合成表型逆转为具有执行正常收缩功能的收缩表型，PASMC胞质内的α-SM-actin含量回升；且DDPH的这种作用具有浓度相关性。透射电镜结果从形态学上也证明PASMC由合成表型逆转为收缩表型，由此推测，DDPH对HECCM促PASMC增殖具有逆转效应。     

DDPH对大鼠慢性低氧性肺动脉高压的阻抑和逆转效应

实验观察1-(2,6-二甲基苯氧基)-2-(3,4-二甲氧基乙胺基)丙烷盐酸盐(简称DDPH)对低氧大鼠肺动脉高压(HPHT)和腺泡内肺动脉(IAPA)构形重组的影响.结果表明,在缺氧后期和常氧恢复期使用DDPH的大鼠右心室收缩压(RVSP)分别比未用药组降低18.98%和17.85%;右心室肥大指数(RVHI)分别减小18.18%和12.50%;腺泡内环肌型动脉数量减少、中膜厚度变薄;无肌型动脉数量增多、管径明显扩大(P<0.05).肺动脉收缩压的改变与腺泡内血管构形的改变密切相关(R~2=0.9865,P<0.01).提示DDPH对HPHT的形成和IAPA构形重组具有阻抑和逆转效应.     

蛋白激酶及DDPH对HECCM促PASMC增殖的影响

应用猪肺血管的内皮细胞进行常氧/低氧培养，制备常氧/低氧内皮细胞条件培养基（Normoxic/Hypoxial en-dothelia cell conditional medium，NECCM/HECCM），分别观察蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和受体酪氨酸蛋白激酶/胞浆酪氨酸蛋白激酶(recepror tyrosine protein kinase/plasma tyrosine protein ki-nase，RTK/PTK)ey DDPH对HECCM促肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMC）增殖的影响。探讨这些蛋白激酶在促PASMC增殖中的作用，以及DDPH抑制这种促增殖的机理。结果提示：PKC是HECCM促PASMC增殖的关键性效应分子，但其被激活的上游信号转导分子除了RTK/PTK外，还有其它非RTK/PTK介导的信号转导方式：DDPH对HECCM促PASMC增殖的抑制点在PKC上游 ，可能直接作用于RTK/PTK，或者阻断Ca^2 通道。     

1-(2, 6-二甲基苯氧基)-2-(3, 4-二甲氧基苯乙氨基) 丙烷盐酸盐对培养的乳鼠心肌细胞[Ca2+]i的影响

采用 Fura- 2 / AM显微荧光测钙技术 ,检测培养新生大鼠单个心肌细胞内游离钙的浓度 ,并观察 1- (2 ,6 -二甲基苯氧基 ) - 2 - (3,4-二甲氧基苯乙氨基 )丙烷盐酸盐 (DDPH)对不同刺激〔去氧肾上腺素 ,高 K ,血管紧张素 (Ang II)〕所致心肌细胞钙超载的影响。结果表明 :1在含钙、无钙标准台氏液 ,DDPH 10 - 4 m ol· L- 1 对去氧肾上腺素(Phe) 10 - 4 mol· L- 1 所致钙增高有显著抑制作用。 2 DDPH 10 - 4 m ol· L- 1 对高 K 5 0 m mol· L- 1 引起的 [Ca2 ]i增高有一定抑制作用 ,对 Ang 10 - 4 mol· L- 1 引起的 [Ca2 ]i增高有部分拮抗作用。提示 :DDPH可拮抗 α1 受体调控的 Ca2 通道 ,对钙库钙释放也有抑制作用 ,对电压依赖性钙通道有一定调控作用     

DDPH逆转增生后PASMC的时间相关性研究

目的 研究DDPH对低氧内皮细胞条件培养液(HECCM)促肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增生后的逆转效应及时问相关性,探讨DDPH使增生后PASMC恢复为正常收缩表型的时间.方法 利用HECCM建立猪PASMC增生模型;采用细胞培养、改良的四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、免疫细胞化学染色测定α平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)等方法观察HECCM的促PASMC增生作用,及DDPH对PASMC增生后的逆转效应,并观察逆转效应与DDPH作用的时间相关性.结果 (1)HECCM促PASMC增生后,PASMC由收缩表型转化为合成表型,胞质内的α-SM-actin含量下降,具有一定时间相关性.(2)在HECCM促PASMC增生后,加入DDPH可使PASMC由合成表型逆转为收缩表型,α-SM-actin含量回升,具有一定时间相关性.结论 DDPH对HECCM促PASMC增生有逆转效应并呈一定时间相关性,DDPH作用一定时间后PASMC表型可基本逆转恢复至正常.     

DDPH和生长因子对肺动脉平滑肌细胞凋亡的作用

运用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）和流式细胞分析术（FCM）检测经1－（2，6－二甲基苯氧基）－2－（3，4－二甲氧基苯乙胺基）丙烯盐酸盐（DDPH）、血小板源性生长因子（PDGF）、碱性皮纤维细胞生长因子（b-FGF)、低氧内皮细胞条件培养液（HECCM）作用后，肺动脉平滑肌细胞（PASMC）凋亡的变化；结合FCM对各组PASMC生长周期的分析，比较不同因素对PASMC的影响差异。结果发现：DDPH组平滑肌细胞（SMC）凋亡指数显著高于对照组，PDGF、b-FGF、HECCM各组SMC凋亡指数显著低于对照组；PDGF、b-FGF、HECCM3组通过生长限制点G1／S（S＋G2／M期）细胞的比率均显著高于对照组，尤以PDGF组最高，而DDPH组低于对照组。提示：DDPH能够抑制PASMC增殖并诱导其凋亡，而PDGF、b-FGF等生长因子则起相反作用。     

舒缩血管物质对肺动脉平滑肌细胞膜电位、胞浆及线体Ca2+的作用效应

目的:观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和一氧化氮(NO)对肺动脉平滑肌细胞膜电位、胞浆钙离子浓度([Ca2+]i)和线粒体钙离子浓度([Ca2+] mit)的影响.方法:肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterysmooth muscle cells,PASMCs)分别负载相应的荧光探针:胞浆钙荧光指示剂(Fluo - 4/AM)、细胞膜荧光指示剂(Di -8 - ANEPPS)、细胞线粒体钙荧光指示剂(Rhod -5F),然后给予一定浓度的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和一氧化氮(NO),在激光共聚焦扫描显微镜下,测定[Ca2+]i荧光、细胞膜电位、[Ca2+] mit荧光.结果:AngⅡ基本不影响细胞膜电位,但可一过性引起[Ca2+]i升高,这种[Ca2+]i的升高可导致[Ca2+]mit小幅升高,进而启动线粒体钙离子的释放和[Ca2+] mit的大幅度降低;NO可迅速减弱PASMCs膜电位荧光强度,使细胞处于明显的超极化状态,同时,[Ca2+]i迅速下降,300s时达到最低,并维持在这一水平,[Ca2+]mit也迅速降低,形成低谷平台后迅速回升,并基本稳定于、稍低于初始值的水平.结论:AngⅡ收缩血管可能与线粒体钙释放和[Ca2+] mit的大幅降低有关;NO舒张血管可能与细胞超极化、[Ca2+]i、[Ca2+] mit降低有关.     

PDGF在低氧内皮细胞条件培养基促猪肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

为了探索低氧条件下猪肺动脉内皮细胞 (PAEC)对猪肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖调控关系 ,应用MTT比色法 ,DNA荧光测定法观察了外源性 PDGF促 PASMC增殖作用 ,以及 Suram in抑制 PDGF促增殖作用的效应 ,并在此基础上研究了猪肺动脉内皮细胞条件培养基 (HECCM)中 PDGF促 PASMC增殖的作用。结果表明 ,HECCM促 PASMC增殖作用的效应可被 Suramin部分抑制 ,由此证明 ,PDGF是低氧刺激 PAEC产生的一种促 PASMC增殖的重要因子。     

多胺在低氧内皮细胞条件培养基促猪肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

在低氧条件下，猪肺动脉内皮细胞（PAEC）对猪肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖调控，是研究低氧性肺动脉高压时肺动脉结构重组的重要内容。应用MTT比色法、DNA荧光测定法，观察了低氧PAEC条件培养基（HECCM）中多胺促PASMC增殖的作用。结果表明，在PAEC培养液中加入鸟氨酸脱梭酶抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO），可阻止HECCM促PASMC增殖的效应。故认为低氧刺激PAEC产生的多胺亦是HECCM中促PASMC增殖的一个重要因子。     

二甲双胍对尼古丁诱导肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及机制研究

目的 明确二甲双胍(metformin)对尼古丁(nicotine)诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖的影响,并探讨其机制.方法 组织贴块法原代培养SD大鼠PASMCs,不同浓度的尼古丁分别刺激PASMCs,采用CCK-8法检测细胞增殖变化,确定尼古丁促PASMCs增殖的最佳作用浓度,并观察二甲双胍对尼古丁诱导PASMCs增殖的影响.ELISA法观察二甲双胍对尼古丁暴露下PASMCs IL-6、TNF-α表达水平的影响;流式细胞术检测二甲双胍对尼古丁暴露下PASMCs产生ROS水平变化;采用Western blot检测AMPK表达和活性变化.结果 成功分离培养并鉴定PASMCs,α-actin蛋白在细胞质高表达并呈丝状分布.与对照组相比,0.1μmmol/L尼古丁处理48 h后可显著促进PASMCs增殖(P ＜0.05);2 mmol/L二甲双胍预处理后,尼古丁诱导的PASMCs增殖受到明显抑制.尼古丁处理组PASMCs细胞中IL-6、TNF-α和ROS水平明显升高(P＜0.05);而二甲双胍干预后抑制尼古丁暴露下PASMCs中IL-6、TNF-α.和ROS的产生(P＜0.05).尼古丁刺激PASMCs后可引起AMPK磷酸化水平(p-AMPK)表达一过性升高,而二甲双胍引起p-AMPK持续升高(P＜0.05).结论 尼古丁刺激PASMCs引起IL-6、TNF-α水平增加,及ROS过度生成,促进PASMCs增殖;二甲双胍抑制上述炎症反应和氧化应激状态,及尼古丁诱导的PASMCs增殖,其机制可能依赖于AMPK的持续活化.     

DDPH对缺氧内皮细胞条件培养液致肺动脉平滑肌细胞PDGF mRNA表达的影响

利用地高辛标记的ｃＤＮＡ探针，原位检测ＤＤＰＨ［１－（２，６－二甲基苯氧基）－２－（３，４－二甲氧基苯乙胺基）丙烷酸盐］对缺氧内皮细胞条件培养液致猪ＰＡＳＭＣＰＤＧＦ基因表达的影响。实验分６组：常氧、低氧无血清培养液组（Ｎ、Ｈ组），常氧、低氧内皮细胞条件培养液组（ＮＥＣＣＭ、ＨＥＣＣＭ组），ＮＥＣＣＭ＋ＤＤＰＨ、ＨＥＣＣＭ＋ＤＤＰＨ组。用自动图像分析仪检测各组细胞ＰＤＧＦ－Ａ和－Ｂ链杂交产物的平均光密度（ＯＤ）值。结果：ＨＥＣＣＭ组ＰＤＧＦ－Ａ和－Ｂ链ｍＲＮＡ表达量分别是ＮＥＣＣＭ组的１．４０、１．４９倍（Ｐ＜０．０１），分别是Ｎ组的１．８倍、１．７倍（Ｐ＜０．０１），ＨＥＣＣＭ＋ＤＤＰＨ组ＰＤＧＦ－Ａ、－Ｂ链ｍＲＮＡ表达量分别为ＨＥＣＣＭ的０．７３倍、０．６５倍（Ｐ＜０．０１），与ＮＥＣＣＭ组相比，均无显著差异。提示ＤＤＰＨ在ＰＤＧＦ基因转录水平抑制ＨＥＣＣＭ诱导的ＰＡＳＭＣ的增殖。     

Effects of DDPH on HECCM-induced Proliferation and Immunophenotypes of the Pulmonary Vascular Pericytes

Muscularization of non- muscular arterioles of in-tra- acinar pulmonary arteries is an important mor-phological feature of pulmonary vascular structuralremodeling ( PVSR ) during the development ofchronic hypoxic pulmonary hypertension[1] .In Chi-na,to explore the cell origin of muscularization ofnon- muscular arterioles,the cell culture of pul-monary vascular pericytes was firstestablished at ourlaboratory[2 ] .Resentstudiesin vitro[3] suggested thathypoxic endothelium cell conditioned medi…     

丹参酮Ⅱ-A硫酸钠对低氧诱导肺血管平滑肌细胞增殖的影响

应用免疫细胞化学、流式细胞术和核酸原位杂交技术观测丹参酮Ⅱ-A硫酸钠(DS201)对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的影响.结果发现DS201能明显地阻抑PASMC由G0/G1期进入S期(P<0.05);使PASMC增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及PDGF-A和B链mRNA的表达均显著降低(P<0.01).提示DS201可能通过下调PDGFmRNA基因表达而有效抑制HECCM诱导的PASMC增殖.     

Effects of Iptakalim on intracellular free calcium concentration of cultured rabbit pulmonary arterial smooth muscle cells

Objective:To explore the effects of Iptakalim on intracellular free calcium concentration and on the proliferation of cultured rabbit pulmonary arterial smooth muscle cells induced by endothelin-1(ET-1) in vitro. Methods:A cell culture model, [3H]-thymidine([3H]-TdR) incorporation test and confocal microscope were used to observe proliferation and intracellular free calcium concentration([Ca2 ]i) of rabbit PASMC induced by ET-1 in vitro. Results:The value of [3H]-TdR incorporation in ET-1 group was increased 1.468 times higher than that in control group. Iptakalim at the concentration of 10-7mol/L,10-6 mol/L,10-5 mol/L lowered [3H]-TdR incorporation by (19.8±4.6)%, (41.2±9.5)%, (54.7±10.1)%, respectively, compared with the value of the cells treated with ET-1(P＜0.01); The intracellular fluorescence intensity of PASMC in ET-1 group was increased from 73.70±10.12 to 143.84±28.23, significantly higher than that in control group(P＜0.01); whereas with Iptakalim,the fluorescence intensity(FI) was only increased from 74.30±10.20 to 86.03±9.82, significantly lower than that in ET-1 group(P＜0.01). Conclusion:Iptakalim inhibited proliferation of PASMC and decreased intracellular free calcium concentration of cultured rabbit PASMC induced by ET-1.     

Effects of lptakalim on intracellular free calcium concentration of cultured rabbit pulmonary arterial smooth muscle cells

Objective：To explore the effects of Iptakalim on intracellular free calcium concentration and on the proliferation of cultured rabbit pulmonary arterial smooth muscle cells induced by endothelin-1 （ET-1） in vitro. Methods：A cell culture model, [^3H]-thymidine（[^3H]-TdR） incorporation test and confocal microscope were used to observe proliferation and intracellular free calcium concentration（[Ca^2±]） of rabbit PASMC induced by ET-1 in vitro. Results：The value of [^3H]-TdR incorporation in ET-1 group was increased 1.468 times higher than that in control group. Iptakalim at the concentration of 10^-7mol/L, 10^-6mol/L ,10^-5 mol/L lowered [^3H]-TdR incorporation by （19.8 ± 4.6）%, （41.2 ± 9.5）%, （54.7 ± 10.1）%, respectively, compared with the value of the cells treated with ET-1（P〈 0.01）; The intracellular fluorescence intensity of PASMC in ET-1 group was increased from 73.70 ± 10.12 to 143.84 ± 28.23, significantly higher than that in control group（P 〈 0.01）; whereas with Iptakalim,the fluorescence intensity（FI） was only increased from 74.30 ± 10.20 to 86.03 ± 9.82, significantly lower than that in ET-1 group（P 〈 0.01）. Conclusion：Iptakalim inhibited proliferation of PASMC and decreased intracellular free calcium concentration of cultured rabbit PASMC induced by ET-1.     

Both Hypoxic Endothelial Cell Conditioned Medium and Hypoxia Elevate Intracellular Free Calcium in Pulmonary Artery Smooth Mu

ＢｏｔｈＨｙｐｏｘｉｃＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍａｎｄＨｙｐｏｘｉａＥｌｅｖａｔｅＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＦｒｅｅＣａｌｃｉｕｍｉｎＰｕｌｍｏｎａｒｙＡｒｔｅｒｙＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓＨＵＱｉｎｇ－...     

内皮素对肺动脉平滑肌细胞第二信使系统的影响

在培养的猪肺动脉平滑肌细胞上观察内皮素-1 对第二信使系统的影响。实验发现内皮素-1促进肺动脉平滑肌细胞内钙释放,继之以外钙内流;使三磷酸肌醇骤增后下降;对细胞内环腺苷酸和环鸟苷酸量无明显影响。