骨髓基质细胞条件培养液调节神经干细胞分化有效成分的蛋白质微阵列分析

目的 检测骨髓基质细胞条件培养液(N-CM)中诱导神经干细胞(NSCs)向神经元方向分化的细胞因子,探讨骨髓基质细胞(BMSCs)调节NSCs分化的机制. 方法 将收集到的N-CM混匀后经超滤浓缩分为大于5kD和小于5kD两部分,用这两部分培养液分别培养NSCs,确定其中能促进NSCs分化为高比例神经元的部分并进行大鼠蛋白质微阵列检测. 结果 N-CM分子量大于5kD的部分可以促进NSCs分化为高比例神经元,并通过蛋白质微阵列检测,与单纯骨髓基质培养液相比,有7种细胞因子的表达量卜调了1.5倍,分别是CINC-3、CNTF、IFN-γ、IL-1α、MCP-1、TIMP-1和VEGF. 结论 BMSCs分泌的可溶性分子对NSCs分化为神经元有促进作用,其中某些分子最大于5KD的细胞因子可能存这一调节作用中发挥效应.     

大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞

为了观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经干细胞(NSCs)的能力,本研究通过贴壁法培养大鼠BMSCs,体外培养扩增纯化后,在细胞传代时用含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N2、B27的DMEM/F12的培养液制成细胞悬液,并进行诱导,观察诱导后细胞的形态及生长情况,用免疫荧光检测形成的细胞球的巢蛋白(nestin)的表达情况;形成的细胞球在含10%血清的培养液中进一步分化。结果显示:BMSCs在含EGF、bFGF、N2、B27的培养液中,逐渐形成nestin表达阳性的细胞球,在含血清的培养液中能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞及少突胶质样细胞。本研究结果提示经纯化的BMSCs能分化为NSCs,并具有进一步分化的能力。     

骨髓基质细胞促进人胚神经干细胞向神经元的分化

目的:探讨骨髓基质细胞(BMSCs)对人胚神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法:采用机械法分离人胚NSCs,成球法进行传代培养,采用免疫荧光染色检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达鉴定NSCs。按培养方式不同,分为NSCs自然分化组、BMSCs和NSCs直接接触共培养组及Transwell共培养组,采用免疫细胞荧光法及免疫印迹法检测各组神经元和星形胶质细胞标志物的表达。结果:在直接接触共培养组和transwell共培养组中,免疫荧光染色显示神经元标志物NSE阳性细胞率明显高于自然分化组,而星形胶质细胞标志物GFAP阳性细胞率低于自然分化组。免疫印迹检测显示Transwell共培养组中NSE表达量显著高于自然分化组,而GFAP表达量低于自然分化组。结论:BMSCs具有促进NSCs向神经元分化的作用。     

人骨髓间充质干细胞对体外培养的胎儿神经干细胞向少突胶质细胞分化的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对体外培养的神经干细胞(NSCs)向少突胶质细胞分化的影响。方法以密度梯度离心的方法获得人hMSCs,设立3个实验组,分别是hMSCs+NSCs共培养组、hMSCs条件培养基+NSCs组、NSCs自发分化组(对照组)。通过免疫细胞化学染色及RT-PCR等手段检测不同组中NSCs向少突胶质细胞分化的情况,并探讨其可能的机制。结果与自发分化组相比,共培养组及hMSCs条件培养基作用组NSCs向少突胶质细胞分化的百分率分别为(61.3±5.7)%和(58.4±6.2)%,差异均具有显著性(<0.05);且RT-PCR结果显示,共培养组及hMSCs条件培养基作用组少突胶质细胞相关基因Olig1、Olig2的表达增强。结论 hMSCs促进体外培养的NSCs向少突胶质细胞分化,可能与hMSCs分泌可溶性因子相关。     

Olig2过表达对神经干细胞向少突胶质细胞分化的影响

目的:构建大鼠olig2真核表达载体,观察其过表达对大鼠神经干细胞(NSCs)向少突胶质细胞分化的影响.方法:采用 RT-PCR,以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增olig2基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中.用电穿孔方法转染pEGFP-N3-olig2表达载体至NSCs中.用RT-PCR鉴定olig2的表达,用免疫荧光显色鉴定NSCs向少突胶质细胞的分化情况.结果:成功构建了pEGFP-N3-olig2真核表达载体;olig2在重组质粒转染的NSCs中能够高效表达;重组质粒转染的NSCs在体外诱导分化后,能够较空质粒转染的NSCs产生更多的受体相互作用蛋白(RIP)阳性细胞.结论:olig2过表达能够促进大鼠NSCs向少突胶质细胞方向分化.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠神经干细胞的培养与鉴定

目的:体外分离、培养及鉴定绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因小鼠神经干细胞(neu- ral stem cells,NSCs),为利用其示踪研究NSCs分化机制奠定基础。方法:从新生GFP小鼠海马组织分离NSCs,采用无血清培养、扩增及传代;免疫荧光和免疫细胞化学染色鉴定NSCs和神经细胞;荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果:新生GFP小鼠大脑海马组织分离的NSCs具有自我增殖及分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力;连续传代后,神经球和分化后细胞的GFP表达不受影响。结论:成功分离并获得了GFP新生小鼠NSCs,该细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,且稳定表达GFP。因此,源自GFP转基因小鼠的NSCs可以作为研究NSCs多向分化机制的有效示踪工具。     

骨髓基质细胞促进神经干细胞增殖分化

目的：探讨骨髓基质细胞（BMSCs）对神经干细胞（NSCs）增殖分化的影响。 方法:在体外比较NSCs在单独培养和在BMSCs条件培养液中培养下的分化和增殖情况。 结果:应用BMSCs条件培养液培养NSCs，分化的神经元比例较显著高于NSCs单独培养（41.1%±3.2% vs 23.3%±16.5%，P<0.05），而分化的星形胶质细胞所占比例显著降低（33.8%±4.9% vs 65.0%±10.4%，P<0.01），同时增殖细胞所占比例也显著增高（74.7％±4.7％ vs 51.4％±12.3％，P<0.01）。 结论:BMSCs对NSCs有促进其增殖和向神经元分化的作用。NSCs与BMSCs联合移植可能会增强NSCs移植的抗脑损伤作用。     

Olig1过表达对大鼠神经干细胞向少突胶质细胞分化的影响

目的:Olig1基因修饰的神经干细胞(NSCs)移植治疗中枢神经脱髓鞘疾病具有重要的应用前景。本研究目的是构建大鼠olig1真核表达载体,并观察其过表达对大鼠NSCs向少突胶质细胞分化的影响。方法:采用RT-PCR,以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增olig1基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中;用电穿孔方法转染pEGFP-N3-olig1表达载体至NSCs中,然后用RT-PCR鉴定olig1的表达,免疫荧光染色鉴定NSCs向少突胶质细胞的分化情况。结果:成功构建了pEGFP-N3-olig1真核表达载体,olig1在重组质粒转染的NSCs中能够高效表达。重组质粒转染的NSCs在体外诱导分化后,能够较空质粒转染的NSCs产生更多的少突胶质细胞(P0.01)。结论:Olig1过表达能够显著促进大鼠NSCs向少突胶质细胞方向分化。     

成年小鼠室管膜下区神经干细胞分离及培养方法改良

目的:改良成鼠神经干细胞(NSCs)分离培养方法,优化培养条件,为系统研究成体干细胞增殖与分化特性以及利用成体干细胞进行细胞治疗奠定基础。方法:视交叉前1.5 mm处离段脑组织,分离前脑室管膜下区(SVZ),通过机械性消化与化学性消化相结合的操作方法制备细胞悬液,应用改良无血清培养基悬浮培养NSCs。nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,1%胎牛血清诱导分化后免疫荧光染色鉴定NSCs多向分化潜能。系列稀释实验和5-溴脱氧尿核苷(BrdU)掺入实验比较改良培养与常规培养NSCs自我更新能力和增殖潜能。结果:改良培养条件,NSCs 7～9 d可形成nestin阳性神经球。应用1%FBS诱导后,NSCs分化为形态各异的细胞,包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,分化比例分别是(18.6±3.5)%、(73.2±5.2)%和(3.6±0.4)%。系列稀释实验结果显示当细胞接种数量为500、1000和2000个,改良培养NSCs形成次代神经球数量较常规培养对照组明显增多(P<0.05),并且8 h BrdU掺入率也显著增高达(42.4±6.2)%(P<0.05),表明改良培养条件下NSCs自我更新能力和增殖活力良好。结论:本研究建立了一种简便、操作性强、重复性高的成鼠NSCs分离培养方法。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

条件培养液对Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆增殖的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)条件培养液对其单细胞克隆增殖的影响。方法采用无血清培养法体外培养Wistar大鼠海马神经干细胞并进行传代培养,然后收集神经干细胞条件培养液。第四代细胞进行单细胞克隆,并将单细胞克隆细胞分为条件培养液组、无血清培养液对照组。通过MTT法比较两组细胞的增殖情况。单克隆培养细胞行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色,诱导分化后细胞行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Galc)免疫细胞化学染色。结果单克隆培养后克隆球表达nestin,诱导分化后细胞表达NSE、GFAP、Galc,条件培养液组细胞增殖速度高于对照组。结论条件培养液能提高Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆的增殖速度。     

无血清培养新生Wistar大鼠神经干细胞及免疫荧光鉴定

目的在无血清条件下,分离培养新生1d的Wistar大鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况,并对其生物学特性进行鉴定。方法取新生1d的大鼠海马组织,机械分离法分离神经干细胞,加入含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清培养基中培养、增殖。倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化情况,采用免疫荧光染色鉴定其生物特性。结果从新生大鼠海马组织分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断增殖,免疫荧光染色显示巢蛋白呈阳性表达。诱导分化后,免疫荧光染色可见高分子量神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白阳性表达细胞。结论无血清条件分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。     

骨髓基质细胞对中脑神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的:观察成年大鼠骨髓基质细胞诱导新生大鼠中脑神经干细胞分化为神经元的机制。方法:采用骨髓基质细胞和神经干细胞共培养方法,通过显微镜观察神经干细胞的分化状态;使用免疫组织化学技术,分析神经元在神经干细胞后代中所占的比例。结果:(1)骨髓基质细胞可诱导神经干细胞分化为高比例神经元;(2)骨髓基质细胞可促进神经元的存活。结论:骨髓基质细胞可提供神经干细胞分化为神经元和促进神经元存活的信号物质。     

Royal jelly and its unique fatty acid, 10-hydroxy-trans-2-decenoic acid, promote neurogenesis by neural stem/progenitor cells in vitro

Neural stem/progenitor cells (NSCs) proliferate vigorously as neurospheres in medium containing basic fibroblast growth factor (FGF-2), but start differentiating into neurons, astrocytes or oligodendrocytes in FGF-2-free medium. An extract of royal jelly (RJ) significantly increased the percentage in the total cell population of not only neurons immunoreactive for class III beta-tubulin (Tuj1) but also astrocytes immunoreactive for glial fibrillary acidic protein (GFAP), and oligodendrocytes immunoreactive for 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase) generated from NSCs, but decreased that of nestin-positive NSCs. These results highlight a novel and outstanding property of the RJ, i.e., that it facilitates the differentiation of all types of brain cells (neurons, astrocytes, and oligodendrocytes). On the other hand, 10-hydroxy-trans-2-decenoic acid (HDEA), an unsaturated fatty acid characteristic of RJ, increased the generation of neurons and decreased that of astrocytes from NSCs. These observations suggest that RJ contains plural components that differently influence neuronal and/or glial lineages and that HDEA is one of such components of RJ that facilitates neurogenesis by NSCs.     

大鼠神经干细胞向少突胶质细胞定向分化的观察

目的：研究神经干细胞（NSCs）向少突胶质细胞（OLs）的定向分化。方法：以大鼠14d胚胎海马分离得到的NSCs为模型,利用免疫组化、图像分析等方法观察了存bFGF存在下,不同浓度的PDGF-AA对NSCs分化为OLs的作用以及胎牛血清对NSCs分化的影响。结果：加入PDGFAA使NSCs更多地分化为OLs,且不同浓度的PDGF-AA对OLS分化的影响不同。结论：联合应用PDGF-AA和bFGF,可促进NSCs定向分化为OLs;在bFGF存在下,以PDGF-AA 40ng／ml＋0．5％FBS为最佳浓度,可促进NSCs向OLs分化、成熟。     

Expression of BMP-2 and BMP-4 proteins by type-1 and type-2 astrocytes induced from neural stem cells under different differentiation conditions

Bone morphogenetic proteins (BMPs), a subgroup of the TGF-β superfamily, play critical roles in neural progenitor cell fate determination. Neural stem cells (NSCs) are multipotent progenitor cells that can differentiate into neurons, oligodendrocytes and astrocytes under certain conditions. In our recent report, using an antibody that can recognize both BMP-2 and BMP-4 (BMP-2/4), we showed that BMP-2/4 is only expressed in astrocytes differentiated from NSCs in a medium containing 1% fetal bovine serum (FBS). In this in vitro model, the astrocytic differentiation of NSCs was mainly toward type-2. When NSCs were cultured in a medium containing 10% FBS, most of the cells differentiated into type-1 astrocytes. However, little information is available for BMP-2 and BMP-4 expression in type-1 and type-2 astrocytes induced from NSCs under these different culture conditions. In this study, using two antibodies specific for BMP-2 and BMP-4, respectively, we discriminated the presence of BMP-2 and BMP-4 in NSCs and their derivatives under 1% and 10% FBS culture conditions by RT-PCR, western blot and immunofluorescence staining. We found that BMP-2 and BMP-4 are highly expressed in both type-1 and type-2 astrocytes, and no detectable expression in NSCs, neurons and oligodendrocytes. This suggests that the astrocytes might be one source of BMPs during the differentiation of NSCs. However, in our model, we cannot exclude the possibility that microglia or endothelial cells could also be a source of BMPs.