抗肿瘤的人重组内皮抑素基因的克隆及表达

目的 克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白重组人内皮抑素(human endosbtatin,HES)。方法 从人胎盘组织中分离总RNA,用RT-PCR法扩增出570bp的DNA片段,经序列测定证实为内皮抑素基因,并成功地克隆到pUC18质粒载体中,用Xpress系统体外表达出内皮抑素蛋白并纯化成功。结果 克隆的HEScDNA其序列和国外报道一致;构建了重组HES融合蛋白表达菌株,经SDS-PAGE等分析,表达目的蛋白达细菌总蛋白的40％以上。结论 通过HES基因克隆和表达的研究与探讨,得到了HES的基因克隆和高效表达菌株,为内皮抑素在临床治疗恶性肿瘤奠定了基础。     

人内皮抑素基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人内皮抑素基因并在大肠杆菌中表达。方法 采用PCR技术进行内皮抑素基因的克隆，并使基因定向插入表达载体PGEME－1中经IPTG诱导获取表达。结果 经DNA序列分析，人内皮抑素基因序列完全正确，经SDS－PAGE分析，出现一条特异性蛋白质条带，大小与基因10和人内皮抑素蛋白的大小的总和相符合。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得融合表达。     

人内皮抑素基因的克隆与表达及其抑瘤作用的实验研究

目的 克隆人内皮抑素基因,检测其表达蛋白的生物学活性,应用该蛋白治疗裸鼠皮下人脑胶质瘤。方法 从人肝组织提取mRNA,用反转录聚合酶链反应技术克隆人内皮抑素基因,将其重组人pUC19,双氰末端终止法测定其核苷酸序列。构建非融合表达载体pDH-endo,使其在DH5α内经温度诱导表达,纯化该表达蛋白并用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和内皮细胞抑制实验检测其活性。经荷瘤裸鼠皮下注射该蛋白治疗人脑胶质瘤。结果 成功获得551bp的人内皮抑素基因,测序正确。该诱导表达蛋白分子量为20000,具有抑制血管生成活性。该蛋白每天5、10或20mg/kg裸鼠皮下注射可抑制荷瘤裸鼠皮下人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长（抑瘤率分别为34．5％,76．1％和80．2％）。结论 人内皮抑素基因和表达和初步应用,为采用抗血管生成方法治疗脑胶质瘤等实体瘤研究奠定了实验基础。     

人内皮抑素基因的克隆及其表达产物抗肿瘤活性

目的：克隆人内皮抑素（endostatin)基因并对其表达产物进行抗肿瘤活性研究。方法：从人肝cDNA文库中获得人endostatin基因，构建人载体PET15b，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，将表达产物（rhEndostatin)纯化后应用于小鼠Lewis肺癌治疗，并通过鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验。观察rhEndostatin的血管抑制作用。结果：rhEndostatin可抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成，明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长。结论：rhEndostatin具有抗肿瘤活性。且此活性可能与其抑制肿瘤新生血管形成有关。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑索蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因，连接PGEM-T载体，测序确认，定向克隆入pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因，构建表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE分析，出现特异性蛋白质条带，并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达．表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖，为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

血管抑素基因和内皮抑素基因治疗裸鼠肺癌的初步研究

恶性肿瘤的发生、发展和转移均依赖于血管生成,以新生血管为靶点,抑制肿瘤血管生成已成为近年来癌症治疗的新策略。肿瘤血管生成是一个多步骤的复杂过程,并由多种血管生成因子和血管生成抑制因子共同调控所决定的。在血管生成抑制因子中,血管抑素（angiostatin）及内皮抑素（endostatin）起重要作用,两者均能强烈、特异性抑制血管内皮细胞增殖,阻断肿瘤的血管生成［1］。本研究应用人肺腺癌细胞系A549接种裸鼠成瘤,然后分别用血管抑素基因和内皮抑素基因瘤内注射进行治疗,以观察肿瘤生长受抑制情况。1 材料和方法1） 肺癌裸鼠模型…     

小鼠内皮抑素基因的克隆及序列测定

目的 获取小鼠内皮抑素（endostatin)基因并进行序列测定,为今后研究其机制及应用创造条件。方法 以小鼠肝脏总RNA为模板,用RT-PCR法从中扩增endostatin基因,并将所得基因重组入pUC19载体质粒,采用自动测定仪及荧光素标记引物,测定目的基因序列。结果 从小鼠肝组织中成功扩增endostatin基因,莘成功克隆入pUC19载体。经酶切鉴定正确后,命名为pUC-Endo。经测序证实所获基因序列与已知的endostatin基因序列一致。结论 成功构建小鼠endo-statin基因的重组克隆pUC-Endo,为今后利用endostatin进行胶质瘤的抗血管生成治疗研究奠定了实验基础。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

人内皮抑素基因治疗卵巢癌裸鼠移植瘤的研究

目的探索人内皮抑素基因治疗人肿瘤的可行性：方法将人卵巢癌(SKOV3)瘤组织或其细胞移植于裸鼠皮下，建立成裸鼠移植瘤模型；用高保真PCR从含有人内皮抑素基因的重组质粒中扩增出与人生长激素信号肽序列融合的人内皮抑素编码区，将此基因克隆入pGEM-T载体中，经序列测定证明其序列的正确性；将此基因克隆入真核表达载体pcDNA3。经免疫荧光试验证明能在CPS-1细胞中表达。结果用重组质粒注射已形成移植瘤的裸鼠，能显著抑制移植瘤的生长；将基因注射与肿瘤移植同时进行，基因注射不仅能部分抑制移植瘤的形成，而且能抑制移植瘤的生长。结论本研究构建的分泌型表达人内皮抑素的重组质粒可以用于肿瘤的基因治疗研究。     

人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用

目的研究人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响。方法RT-PCR获取人内皮抑素基因，通过酶切，测序鉴定获取的hES，MTT法检测该基因对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响。结果获得的hES基因经测序证实成功克隆人内皮抑素基因；hES基因转染HUVEC细胞24h、4h和72h，细胞增殖率均较正常组明显降低（P〈0．05），而脂质体对照与载体对照与对照组无明显变化。结论hES基因能够抑制HUVEC增殖。     

血小板生成素基因功能区段的体外扩增与序列测定

目的：获取具有功能的血小板生成素基因区段．方法：以正常肝组织ｍＲＮＡ为模板，聚合酶链反应扩增所需目的ｃＤＮＡ，克隆入ｐＵＣ１９中，双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列．结果：ＰＣＲ扩增得约４８０ｂｐ片段，经测序证实为血小板生成素功能区段基因．结论：已得到所需血小板生成素功能区段基因．     

Endostatin基因mRNA在卵巢上皮癌中的表达及其临床意义

目的探讨Endostatin基因mRNA在卵巢上皮癌中的表达以及临床意义。方法应用逆转录聚合酶链反应技术检测48例卵巢上皮癌组织和18例正常卵巢组织中Endostatin基因的表达。结果①卵巢癌组织中Endostatin基因的表达(平均0.525;范围0.09～1.31)明显高于正常卵巢组织(平均0.28;范围0.08～0.38;P<0.05)。②Endostatin基因在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)上皮癌组织中的表达明显高于早期(Ⅰ～Ⅱ期)上皮癌(P<0.05),而与年龄、病理类型、病理分级无关。结论Endostatin基因在卵巢癌上皮癌组织中的表达比正常组织表达高,在晚期卵巢癌上皮癌组织中的表达比早期高。本实验结果为上皮性卵巢癌的生物治疗提供了新的治疗策略。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

小鼠endostatin基因的克隆与C6鼠脑胶质瘤的治疗

目的 克隆小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因,检测其表达蛋白的生物学活性,应用该蛋白治疗大鼠Ｃ６脑胶质瘤。方法 从小鼠胶原ＸⅧｃＤＮＡ用ＰＣＲ法克 ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因,重组入ＰＵＣ１９,测序后构建非融合表达载体ｐＤＨ－ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ,使其在ＤＨ５α内经温度诱导表达,纯化该表达蛋白并用鸡胚绒 囊膜 内皮细胞抑制实验检测其活性,经荷瘤大鼠皮下注射该蛋白治疗其脑胶质瘤,结果 成功获得５５１ｂｐ的ｅ     

人神经营养素-3全长基因克隆及序列分析

目的: 扩增人神经营养素-3(human neurotrophin-3,hNT-3)全长基因并进行序列分析。方法: 应用聚合酶链反应技术,以一个健康成人基因组DNA为模板,扩增出编码hNT-3的全长基因,并克隆至pMD18-T载体中进行基因测序。结果: 所得序列与Genbank提供的序列(M61180)对比显示,除hNT-3中第555位碱基由C→T外,余序列同已知序列完全一致,改变的碱基并不影响基因编码的氨基酸序列。结论: 成功地获得了hNT-3的全长基因,且序列与已知序列高度一致。     

人蛋白质二硫键异构酶活性片段基因的克隆及序列测定

目的：获取人蛋白质二硫键异构酶活性片段基因，并进行序列测定，为今后研究其机理及应用创造条件。方法：从人胎肝组织中用反转录ｐＵＣ１９质粒载体，用双脱氧法双向测定目的基因序列。结果：从人胎肝组织中成功地扩增到ｈＰＤＩｆ基因，测出的序列与已知基因序列一致。结论：构建了ｈＰＯＩｆ基因的重组克隆，为以后的深入研究奠定了基础。