CRISPR-Cas9敲减猪GGTA1基因的质粒构建

目的:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒。方法:将Lenti CRISPR-v2质粒转化感受态DH5α进行扩增并提取该质粒,设计并合成靶向猪GGTA1基因的g RNA(guide RNA,g RNA)序列,对Lenti CRISPR-v2质粒进行Bsm BI酶切及电泳和胶回收,并将胶回收产物与g RNA序列进行连接,构建Lenti CRISPR-v2-g RNA重组质粒,将该重组子转化感受态DH5α,培养过夜后,将其涂布于含有氨苄青霉素(Ampicillin,AMP)的LB固体培养基,筛选阳性单克隆DH5α进行培养并提取质粒,对提取的Lenti CRISPR-v2-g RNA敲减质粒进行Kpn I与Eco RI双酶切验证与序列测定。结果:Lenti CRISPR-v2载体酶切结果正确;目的 g RNA序列成功插入酶切后的Lenti CRISPR-v2载体且序列正确。结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒,该研究为后续慢病毒的包装及CRISPR-Cas9系统敲减猪GGTA1基因的效率与功能研究奠定了基础。     

t-PA基因慢病毒表达载体的构建及其在内皮祖细胞中的表达研究

目的:构建t-PA基因慢病毒表达载体并转染脐血来源的内皮祖细胞,评估其转染后功能变化情况。方法:RT-PCR获得t-PA cDNA,将真核表达质粒pcDNA3.1(+)和t-PA基因片段分别双酶切,构建pc DNA3.1(+)/t-PA质粒。对其进行酶切鉴定和测序,使目的基因连接入载体质粒中,构建成重组慢病毒载体质粒,制备包装病毒质粒转染内皮祖细胞。倒置荧光显微镜下观察转染24h后内皮祖细胞中绿色荧光蛋白的表达情况,RT-qPCR和Western blot检测转染后t-PA基因的表达水平。采用Brdu标记细胞DNA、BCA蛋白定量、MTT分析法检测内皮祖细胞DNA合成能力、总蛋白含量和细胞存活率。结果:成功构建了含有t-PA基因cDNA序列的慢病毒表达载体p Lenti6.3-t-PA,DNA测序结果完全正确,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,内皮祖细胞转染重组慢病毒后t-PA表达水平比未转染组显著增高(P0.01)。t-PA慢病毒表达载体转染内皮祖细胞后,内皮祖细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率均较对照组无明显变化。结论:成功构建t-PA基因慢病毒表达系统,转染内皮祖细胞后对其DNA合成、总蛋白合成、细胞存活率无明显影响。     

RNA干扰bcl-2基因质粒载体的构建

目的:构建bcl-2基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法:根据人bcl-2的基因序列设计短双链3条,人工合成后,连接到带增强型绿色荧光蛋白基因的pGenesil-1载体中,构成3个靶向bcl-2的重组质粒,经酶切、DNA序列测定鉴定,转人HepG-2细胞,观察绿色荧光蛋白表达情况,以确定靶向bcl-2重组质粒进行下一步研究。结果:成功构建了3个靶向bcl-2的shRNA表达载体,为下一步研究奠定基础。结论:靶向shRNA表达载体较其它形式的干扰RNA具更强烈的抑制同源基因表达的作用。     

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用

慢病毒属于逆转录病毒科,为RNA病毒。经改造的慢病毒作为外源基因载体,具有其独特的特点和优势。基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统,慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展,笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。     

Beclin1基因慢病毒载体的鉴定包装及其在银杏酮酯保护衰老海马神经元中的作用

目的:探讨自噬相关基因Beclin1在银杏酮酯保护衰老海马神经元中的作用。方法:使用酶切和DNA测序方法对已构建好的p LVX-shRNA2-Beclin1慢病毒载体进行鉴定,并与辅助包装质粒载体共同转入293T细胞得到病毒颗粒。将病毒颗粒转染原代大鼠海马神经元。培养原代大鼠海马神经元并随机分为6组:正常组、模型组、银杏酮酯组、银杏酮酯干扰组、阳性对照银杏叶提取物组和银杏叶提取物干扰组。正常组用正常培养基培养,模型组用H2O2(200μM)诱导18小时建立衰老样细胞模型;银杏酮酯和银杏叶提取物组分别用200μg/ml的药物预处理6小时后再加入H2O2诱导18小时;其余两组在银杏酮酯和银杏叶提取物组基础上分别加入慢病毒载体颗粒。通过荧光定量PCR和免疫印迹方法检测Beclin 1、LC3-Ⅱ和SyntheinⅠ表达。结果:酶切和DNA测序结果表明重组慢病毒载体p LVX-shRNA2-Beclin1的插入序列正确。用293T细胞包装的重组慢病毒能够感染原代大鼠海马神经元。体外荧光定量PCR结果显示:慢病毒颗粒转染衰老海马神经元后,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物干扰组Beclin1 mRNA水平降低。免疫印迹结果显示:与模型组相比,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物组Beclin1、LC3-Ⅱ和Synpain I蛋白表达均增加;慢病毒颗粒转染后,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物干扰组神经元Beclin1、LC3-Ⅱ和Synpain I蛋白表达明显降低。结论:Beclin1与银杏酮酯(200μg/ml)保护衰老海马神经元有关。     

编码大鼠PRMT1基因shRNA质粒的构建和鉴定

目的研究蛋白精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）基因表达的改变与血管内皮功能及动脉粥样硬化的关系。方法构建PRMT1短发夹RNA（shRNA）质粒。在GenBank中查到犬鼠PRMT1基因mRNA序列并输入siRNA网上设计软件OptiRNA中，选取两条靶序列，设计并合成编码shRNA序列的DNA单链，经退火连接后，与双酶切线性化处理回收的pGenesil-1质粒载体连接，用含卡那霉素抗性的LB平板筛选阳性克隆，小提质粒后行酶切鉴定并测序。结果构建的大鼠PRMT1-shRNA质粒经酶切鉴定及测序与预期相符。结论本研究结果为进一步研究基因干扰PRMT1基因对血浆同型半胱氨酸（Hcy）、非对称性二甲基精氨酸（ADMA）水平及血管内皮功能的影响奠定了基础。     

蛇六谷石油醚提取物对BECN1基因敲减的人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的应用RNA干扰(RNAi)技术干扰BECN1基因的表达,探讨蛇六谷石油醚提取物对BECN1基因敲减的人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法用前期实验构建成功的GV112(LV-BECN1-RNAi)重组慢病毒表达载体转染人胃癌SGC-7901细胞。MTT法检测蛇六谷石油醚提取物抑制胃癌细胞增殖的有效浓度,确定实验药物浓度。每24h(共120h)用CCK法检测人胃癌SGC-7901细胞KD+蛇六谷(BECN1基因敲减组)、NC+蛇六谷(阴性对照组)、CON+蛇六谷(空白组)的细胞活性。结果蛇六谷石油醚提取物能有效抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,且呈明显的浓度依赖性(P0.01);当人胃癌SGC-7901细胞BECN1基因敲减时则会降低其抑制作用(P0.05)。结论 BECN1基因敲减能减弱蛇六谷石油醚提取物抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖的能力,这可能是通过调节BECN1基因的表达诱导细胞自噬,从而抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖。     

VCC-1慢病毒表达载体的构建及其对胶质瘤细胞增殖的影响

目的:构建小趋化因子VCC-1的慢病毒表达载体并研究其对人胶质瘤细胞株U251增殖的影响.方法:以人结肠癌细胞为模板扩增VCC-1基因,并连入pMX载体,挑取测序正确的克隆在293 T细胞中表达,并用realtime-PCR和Westernblot进行验证.结果:成功构建了人VCC-1的慢病毒表达载体,并感染了星形胶质瘤细胞系U251.结论:证明了VCC-1基因在胶质瘤细胞的增殖过程中起促进作用,并为后续研究VCC-1和胶质瘤形成发展和浸润的机制提供了良好的基础.     

利用体外靶点效率检测指导丹参SmPAL1基因的CRISPR/Cas9载体构建

为定向编辑丹参苯丙烷代谢途径中关键酶基因SmPAL1构建CRISPR/Cas9载体,通过在线软件设计CIRSPR/Cas9靶位点,采用体外酶切法进行体外靶点效率检测,筛选活性高的序列,构建到CRISPR/Cas9载体中。设计了3个可能的CRISPR/Cas9靶位点(SmPAL1-g1,SmPAL1-g2,SmPAL1-g3),通过体外靶点效率检测,其活性分别为53.3%,76.6%,10.0%,将筛选出活性较高的2个靶位点SmPAL1-g1和SmPAL1-g2构建到载体VK005-03中并命名为VK005-03-g1和VK005-03-g2。测序结果显示,设计的2个CRISPR/Cas靶位点全部插入到VK005-03中,载体构建成功。     

脂联素球状结构域真核表达载体pcDNA3.0-gAd的构建

目的构建脂联素球状结构域（globular adiponectin,gAd）的真核表达载体,为研究gAd对糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的治疗奠定基础。方法从健康人全血中提取基因组DNA,PCR法获得脂联素球状结构域基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后与pcDNA3.0真核表达载体重组得到pcDNA3.0-gAd,分别用PCR法和DNA测序法鉴定pcDNA3.0-gAd。结果以从健康人全血中提取出的高纯度基因组DNA为模板,PCR扩增出gAd基因,真核载体pcDNA3.0经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与gAd基因进行体外重组,PCR法筛选出阳性克隆,DNA测序显示重组质粒pcDNA3.0-gAd的gAd基因与基因库中报道的脂联素基因序列（Gen-Bank：EU420013.1）中gAd序列完全一致,说明成功构建了pcDNA3.0-gAd,且序列正确。结论本研究为进一步从分子水平探究gAd基因和蛋白质的功能、深入探讨其生物作用机制创造了条件。     

BCSG1基因RNAi表达载体的构建与鉴定

目的:构建乳腺癌特异性基因(BCSG1)RNAi重组质粒,并检测其在三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-321中对BCSG1基因表达的干扰效果和对细胞增殖的影响。方法:将两组干扰片段BCSG1-R1、BCSG1-R2及阴性对照片段BCSG1-C分别克隆入pGenesil-1穿梭质粒,经酶切鉴定及测序后,将测序正确的克隆转染入大肠杆菌DH5α中进行扩增Real-time PCR检测重组质粒转染MDA-MB-321细胞后,各组细胞内BCSG1-mRNA表达水平,Transwell细胞侵袭实验检测重组质粒对MDA-MB-321细胞侵袭能力的影响。结果:成功将干扰片段和阴性对照片段克隆入pGenesil-1质粒,构建出pGenesil-1-BCSG1-R1、pGenesil-1-BCSG1-R2和pGenesil-1-BCSG1-C重组质粒。与对照组相比,BCSG1-R1和BCSG1-R2组的BCSG1-mRNA表达水平明显下调(P0.05);干扰后,MDA-MB-321细胞侵袭能力明显下降(P0.05)。结论:成功构建BCSG1-RNAi重组质粒,可有效下调三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-321内BCSG1的表达及细胞的侵袭能力。     

加味麻黄附子细辛颗粒对AR豚鼠NGFmRNA表达水平的影响

以变应性鼻炎豚鼠为模型,观察到加味麻黄附子细辛颗粒可明显降低变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜组织中NGFmRNA基因表达水平,与西药对照药比较有明显差异.     

鼻敏康颗粒对变应性鼻炎豚鼠IL-4mRNA基因表达水平的影响

以变应性鼻炎豚鼠为模型，观察到鼻敏康颗粒可明显降低变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜组织中IL-4mRNA基因表达水平，与中、西对照药比较有明显差异（P〈0．01）。     

胶质源性神经营养因子重组腺病毒载体构建及其表达的鉴定

目的：构建携带胶质源性神经营养因子（GDNF）基因的重组腺病毒载体,鉴定其基因表达。方法：采用RT-PCR方法从人胶质瘤细胞中克隆GDNF cDNA,重组携带GDNF基因的腺病毒,鉴定其在小鼠间充质干细胞中的表达。结果：以GDNF特异性引物扩增出758bp的GDNF cDNA,经测序证实序列完全正确。GDNF基因克隆入腺病毒载体pAdCMV,细胞内重组后PCR鉴定Ad-GDNF腺病毒含有GDNF基因。重组腺病毒Ad-GDNF在小鼠间充质干细胞内能够高效表达GDNF。结论：GDNF是神经系统生长、分化和损伤后修复过程中的营养因子。以间充质干细胞作为GDNF基因治疗的供体细胞,有希望用于治疗脑缺血等继发性神经损伤以及帕金森病等神经变性疾病。GDNF基因的克隆与表达,为进一步研究GDNF对神经系统疾病的神经保护和修复作用奠定基础。     

脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马小型猪冠状动脉粥样硬化相关基因差异性表达研究

目的:利用PCR array技术检测脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马小型猪冠脉应激反应与脂质转运和代谢相关基因变化,探讨脾虚痰浊冠状动脉粥样硬化发生的病理机制。方法:随机将10只健康的广西巴马小型猪分为正常组和模型组,每组5只,正常组给予普通饲料饲喂,模型组给予球囊拉伤术联合高脂饮食饲喂进行脾虚痰浊动脉粥样硬化模型复制,实验24周后,观察巴马小型猪行为学变化。呼吸机麻醉后取材,分离血清和冠状动脉,测定血清血脂、hs-CRP、IL-6水平,HE染色观察冠状动脉组织形态学变化,对模型进行评价。应用PCR array技术观察巴马小型猪冠脉应激反应与脂质转运和代谢相关基因变化。结果:造模24周后,巴马小型猪出现食少且不欲饮食、神疲乏力、倦怠等明显脾虚证候,与正常组比较,模型组血清血脂、hs-CRP、IL-6水平显著升高,HE染色结果表明,模型组小型猪血管内膜损伤严重,提示模型复制成功。PCR array结果显示,与正常组比较,与应激反应相关的25个基因中,上调11个,下调3个,与脂质转运和代谢相关的15个基因中,上调5个,下调5个。结论:脾虚痰浊巴马小型猪冠脉应激反应与脂质转运和代谢相关基因变化可能是脾虚痰浊冠状动脉硬化发生的病理机制。