CRISPR-Cas9敲减猪GGTA1基因的质粒构建

目的:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒。方法:将Lenti CRISPR-v2质粒转化感受态DH5α进行扩增并提取该质粒,设计并合成靶向猪GGTA1基因的g RNA(guide RNA,g RNA)序列,对Lenti CRISPR-v2质粒进行Bsm BI酶切及电泳和胶回收,并将胶回收产物与g RNA序列进行连接,构建Lenti CRISPR-v2-g RNA重组质粒,将该重组子转化感受态DH5α,培养过夜后,将其涂布于含有氨苄青霉素(Ampicillin,AMP)的LB固体培养基,筛选阳性单克隆DH5α进行培养并提取质粒,对提取的Lenti CRISPR-v2-g RNA敲减质粒进行Kpn I与Eco RI双酶切验证与序列测定。结果:Lenti CRISPR-v2载体酶切结果正确;目的 g RNA序列成功插入酶切后的Lenti CRISPR-v2载体且序列正确。结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒,该研究为后续慢病毒的包装及CRISPR-Cas9系统敲减猪GGTA1基因的效率与功能研究奠定了基础。     

t-PA基因慢病毒表达载体的构建及其在内皮祖细胞中的表达研究

目的:构建t-PA基因慢病毒表达载体并转染脐血来源的内皮祖细胞,评估其转染后功能变化情况。方法:RT-PCR获得t-PA cDNA,将真核表达质粒pcDNA3.1(+)和t-PA基因片段分别双酶切,构建pc DNA3.1(+)/t-PA质粒。对其进行酶切鉴定和测序,使目的基因连接入载体质粒中,构建成重组慢病毒载体质粒,制备包装病毒质粒转染内皮祖细胞。倒置荧光显微镜下观察转染24h后内皮祖细胞中绿色荧光蛋白的表达情况,RT-qPCR和Western blot检测转染后t-PA基因的表达水平。采用Brdu标记细胞DNA、BCA蛋白定量、MTT分析法检测内皮祖细胞DNA合成能力、总蛋白含量和细胞存活率。结果:成功构建了含有t-PA基因cDNA序列的慢病毒表达载体p Lenti6.3-t-PA,DNA测序结果完全正确,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,内皮祖细胞转染重组慢病毒后t-PA表达水平比未转染组显著增高(P0.01)。t-PA慢病毒表达载体转染内皮祖细胞后,内皮祖细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率均较对照组无明显变化。结论:成功构建t-PA基因慢病毒表达系统,转染内皮祖细胞后对其DNA合成、总蛋白合成、细胞存活率无明显影响。     

RPS20RNA干扰慢病毒的构建及其对CT26细胞生长的影响

目的 研究脾虚证差异表达基因——核糖体蛋白S20 (RPS20)RNA干扰慢病毒转染对小鼠结肠癌细胞(CT26)细胞指数的影响,验证前期筛选的RNA干扰序列的有效性,为后续在小鼠体内以RNA干扰进行RPS20的功能鉴定提供参考.方法 根据前期筛选的RPS20 RNA干扰有效序列,进行质粒载体的重组,包装RPS20干扰慢病毒并转染CT26细胞,采用xCELLigence细胞动态分析仪实时监测转染后细胞的细胞指数以反映细胞的生长情况.结果 测序图谱和Blast比对结果表明重组慢病毒包装载体构建成功,慢病毒滴度为1.2×105 TU/mL,RNA干扰慢病毒转染后CT26细胞指数的增长受到明显抑制,转染后30 h细胞指数抑制率达到82.24％.结论 前期筛选的RPS20 RNA干扰序列可成功构建包装干扰慢病毒,转染后能有效抑制CT26细胞的生长,可为后续研究提供参考.     

重组腺病毒PAd-VP3的制备及其与姜黄素协同诱导SW480细胞凋亡的实验研究

目的利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,观察其与姜黄素单独或联合对结肠癌SW480细胞凋亡及周期分布的影响。方法设计VP3 cDNA扩增引物,从PET15b-VP3质粒中扩增VP3 DNA序列,与pShuttle-IRES-hrGFP连接构建pShuttle-VP3-hrGFP穿梭质粒,PCR和EcoRⅤ酶切电泳鉴定;线性化穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP,转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,构建pAd-VP3重组腺病毒质粒并经PCR、电泳及测序鉴定,线性化腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞进行pAd-VP3重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法进行病毒浓缩和纯化并将其单独或联合姜黄素作用人结肠癌SW480细胞,观察其对细胞凋亡及周期分布的影响。结果pShuttle-VP3-hrGFP穿梭质粒构建鉴定成功,pAd-VP3重组腺病毒质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5kb的片段,PCR反应扩增出了402 bp的片段,重组质粒测序证实VP3-hrGFP编码区成功地克隆入了腺病毒pAd中,且其序列与GeneBank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包装出携带VP3基因的腺病毒,滴度为1.738×1012opu·ml-1,获得的重组腺病毒及姜黄素单独或合用均可阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡(P0.05,P0.01),二药联用效果更为显著(P0.01)。结论细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,并能与姜黄素协同通过阻滞细胞周期于G0/G1期诱导结肠癌SW480细胞凋亡。     

Beclin1基因慢病毒载体的鉴定包装及其在银杏酮酯保护衰老海马神经元中的作用

目的:探讨自噬相关基因Beclin1在银杏酮酯保护衰老海马神经元中的作用。方法:使用酶切和DNA测序方法对已构建好的p LVX-shRNA2-Beclin1慢病毒载体进行鉴定,并与辅助包装质粒载体共同转入293T细胞得到病毒颗粒。将病毒颗粒转染原代大鼠海马神经元。培养原代大鼠海马神经元并随机分为6组:正常组、模型组、银杏酮酯组、银杏酮酯干扰组、阳性对照银杏叶提取物组和银杏叶提取物干扰组。正常组用正常培养基培养,模型组用H2O2(200μM)诱导18小时建立衰老样细胞模型;银杏酮酯和银杏叶提取物组分别用200μg/ml的药物预处理6小时后再加入H2O2诱导18小时;其余两组在银杏酮酯和银杏叶提取物组基础上分别加入慢病毒载体颗粒。通过荧光定量PCR和免疫印迹方法检测Beclin 1、LC3-Ⅱ和SyntheinⅠ表达。结果:酶切和DNA测序结果表明重组慢病毒载体p LVX-shRNA2-Beclin1的插入序列正确。用293T细胞包装的重组慢病毒能够感染原代大鼠海马神经元。体外荧光定量PCR结果显示:慢病毒颗粒转染衰老海马神经元后,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物干扰组Beclin1 mRNA水平降低。免疫印迹结果显示:与模型组相比,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物组Beclin1、LC3-Ⅱ和Synpain I蛋白表达均增加;慢病毒颗粒转染后,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物干扰组神经元Beclin1、LC3-Ⅱ和Synpain I蛋白表达明显降低。结论:Beclin1与银杏酮酯(200μg/ml)保护衰老海马神经元有关。     

Cas9表达对酿酒酵母细胞生长和生产天然产物的影响及CRISPR-Cas9编辑系统的优化北大核心CSCD

CRISPR-Cas9基因编辑技术在酿酒酵母中已经得到广泛的应用,但是Cas9作为外源蛋白在酿酒酵母内表达,它对酿酒酵母的生长以及生产天然产物的影响尚不明确。该研究将Cas9基因分别以整合基因组和构建到载体上的形式在酿酒酵母内表达,同时选择2种天然产物类胡萝卜素和次丹参酮二烯为目标产物,研究Cas9表达对酵母生长和生产能力的影响。结果表明,Cas9基因无论整合到基因组表达还是利用载体进行表达,Cas9对酿酒酵母的生长都会产生抑制,并以整合到基因组更为明显。当Cas9基因整合到基因组表达时,对酿酒酵母生产类胡萝卜素和次丹参酮二烯没有影响,但是当Cas9基因利用载体进行表达时,都显著降低了酿酒酵母生产类胡萝卜素和次丹参酮二烯的能力。因此为了进一步能在基因编辑后高效敲除Cas9基因,将Cas9对酿酒酵母的不利影响降到最小。该文系统研究了Ura3载体和Trp1载体的剔除效率,并构建了能够高效进行基因编辑的质粒,优化了CRISPR-Cas9基因编辑系统在酿酒酵母内的应用,为基于Cas9的基因编辑技术的应用提供参考。     

蛇六谷石油醚提取物对BECN1基因敲减的人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的应用RNA干扰(RNAi)技术干扰BECN1基因的表达,探讨蛇六谷石油醚提取物对BECN1基因敲减的人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法用前期实验构建成功的GV112(LV-BECN1-RNAi)重组慢病毒表达载体转染人胃癌SGC-7901细胞。MTT法检测蛇六谷石油醚提取物抑制胃癌细胞增殖的有效浓度,确定实验药物浓度。每24h(共120h)用CCK法检测人胃癌SGC-7901细胞KD+蛇六谷(BECN1基因敲减组)、NC+蛇六谷(阴性对照组)、CON+蛇六谷(空白组)的细胞活性。结果蛇六谷石油醚提取物能有效抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,且呈明显的浓度依赖性(P0.01);当人胃癌SGC-7901细胞BECN1基因敲减时则会降低其抑制作用(P0.05)。结论 BECN1基因敲减能减弱蛇六谷石油醚提取物抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖的能力,这可能是通过调节BECN1基因的表达诱导细胞自噬,从而抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖。     

补肾活血中药龙鳖制剂干预野生型TDP43介导的骨性关节炎软骨细胞病变的作用研究

目的:分析补肾活血中药龙鳖对TDP-43引起骨性关节炎应急反应的软骨细胞病变的干预作用。方法:通过构建TDP43慢病毒载体并转染人软骨细胞,流式细胞检测分析凋亡水平,连续细胞计数分析其细胞增殖水平,荧光定量PCR检测关键基因表达水平;采用软骨细胞培养液中加入低、中、高剂量龙鳖进行干预,分析TDP43慢病毒转染软骨细胞后的凋亡和增殖生长水平。结果:人软骨细胞转染包装好的TDP43慢病毒后,高表达TDP43基因和I型胶原蛋白α1。TDP43慢病毒转染的软骨细胞体外连续培养软骨细胞7 d后,软骨细胞出现晚期凋亡和死亡现象而抑制了细胞增殖。龙鳖加入培养后软骨细胞呈生长趋势,TDP43慢病毒转染的软骨细胞凋亡显著下降而显著提高了其增殖水平。结论:转染TDP43慢病毒软骨细胞表达TDP43引起了细胞凋亡和抑制其增殖,TDP43可能在骨性关节炎发病过程中取到负调控的作用,而中药龙鳖制剂可显著改善这一过程。     

沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒载体的构建

目的构建沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒表达载体。方法查找人p38MAPK cDNA序列,利用软件设计并合成能够形成互补双链并能转录出靶向人p38MAPK基因的短发夹状RNA的两条寡核苷酸序列,退火后连接至线性化载体pSIREN上,获得重组质粒pSIREN-p38MAPK,酶切和测序进行鉴定。结果双酶切重组质粒获得特定的酶切图谱,证实所合成核酸片段的正确重组;测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同。结论成功构建了沉默人p38MAPK基因的重组质粒pSIREN-p38MAPK。     

CRISPR-Cas 9研究进展及其在中医药研究中的应用

CRISPR/Cas 9是近年发明的一种基因组编辑技术,该技术应用sgRNA和Cas9核酸酶能够完成DNA特定位点的识别及编辑,为人类进行基因编辑提供了全新的平台。CRISPR/Cas 9来源于细菌对抗噬菌体和质粒的免疫系统,具有简单、高效、低廉和易于操作等许多优点,因此被称为最新的第三代基因编辑技术。从其发明到现在仅仅3年多的时间,CRISPR/Cas 9已经被应用于整个生物医学领域。可以预料,CRISPR-Cas 9系统在中医药领域也将具有巨大应用前景。中医学能否把握这一机遇,对自身的发展相当重要。文章就CRISPR-Cas系统的发现、免疫防御机理的揭示、sgRNA-Cas9基因编辑工具的发明,以及研究进展做一综述,并对其在中医药领域的应用做了展望。     

《老老恒言》论老年养生

简要论述了《老老恒言》中有关老年养生的思想和方法 ,认为饮食以调理脾胃为要 ,应注意饮食有节、五味调和、清淡为补 ;起居以养静为要 ,应注意调顺四时、起居有常、静养与导引相结合 ;养性以安命为要 ,应注意清心寡欲、修心养性     

珍珠母超微粉蛋白及寡肽对小鼠镇静安眠作用比较

目的比较珍珠母超微粉蛋白、寡肽对小鼠镇静安眠作用。方法利用PCPA制造小鼠失眠模型,观察小鼠的自主活动情况,ELISA法测小鼠血中ATCH含量并计算脑及脑系数。结果阳性对照组、寡肽组小鼠的自主活动次数显著降低,小鼠血中ACTH的含量增加,但脑干系数无影响。结论超微粉寡肽类成分(MCP)镇静安眠活性最强,为镇静安眠主要活性部位,调节ACTH可能是其镇静安眠机制。     

耳鸣(肾精亏损型)临床资料研究

[目的]对2007年11月至2008年11月就诊的主观性耳鸣患者246例,排除其他中医证型,主要研究肾精亏损型耳鸣患者耳鸣的临床特征,变化规律及耳鸣产生的影响等.[方法]选择肾精亏损型耳鸣患者,记录临床症状及体征,采用电测听及耳鸣匹配、听觉脑干诱发电位(ABR)等方法检查,并将资料进行统计分析.[结果]患者年龄以51～60岁最多见,其次为61～70岁.耳鸣响度的自我评分与响度匹配值之间无关联.大多数病例的耳鸣病程在一年之内.大部分患者受耳鸣困扰的程度在中度以下.ABR测试结果听力正常者占25%,右侧和左侧听神经传导至脑干功能障碍患者分别占13%和19%,双侧听神经传导功能障碍占16%.[结论]临床耳鸣患者多数为肾精亏损型,年龄以51～60岁最多见,男女比例相当,大部分患者听神经传导障碍和脑干功能障碍,高音调耳鸣患者居多.     

针灸治疗椎动脉型颈椎病的取穴规律分析

目的:探寻椎动脉型颈椎病针灸取穴规律。方法:检索CNKI、VIP,建立椎动脉型颈椎病针灸取穴数据库,采用SPSS17.0统计软件统计描述。结果:治疗椎动脉型颈椎病的针灸穴位共计72个,使用频次为1005次;所用腧穴归属为督脉、足少阳胆经、经外奇穴、足太阳膀胱经及足阳明胃经频次最多,其累积频率达82.29%;其中风池穴的频率为19.11%;夹脊穴的频率为17.13%;百会穴的频率为12.3%,三穴累积频率达64.28%。结论:针灸治疗本病,以疏通局部经络,调节阴阳气血,临床选取督脉、足少阳胆经、奇穴以及风池、夹脊、百会三穴治疗最多。     

股骨头坏死病因的相关因素分析

目的:基于中国股骨头坏死数据库(China osteonecrosis of the femoral head database,CONFHD)资料分析股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)病因的相关因素。方法:纳入CONFHD中2016年7月至2018年12月收录的病例资料,由数据库工程师从数据库中导出资料,包括患者的性别、年龄、病因、受伤类型、饮酒史(饮酒年限、饮酒频率、饮酒量)、激素应用史(激素应用时间、原发病类型、激素应用途径、激素种类)。结果:本研究共纳入病因资料完整的ONFH患者1290例。创伤性239例(18.53%),酒精性692例(53.64%),激素性359例(27.83%)。男1011例(78.37%),女279例(21.63%)。男性患者中创伤性138例(13.65%)、酒精性653例(64.59%)、激素性220例(21.79%),女性患者中创伤性101例(36.20%)、酒精性39例(13.98%)、激素性139例(49.82%);男性中酒精性比例最高,女性中激素性比例最高。1290例中,年龄≤30岁169例,激素性71例(42.01%);年龄31~40岁254例,酒精性146例(57.48%);年龄41~50岁324例,酒精性202例(62.35%);年龄51~60岁319例,酒精性185例(58.00%);年龄61~70岁158例,酒精性67例(42.41%);年龄≥71岁66例,创伤性和酒精性均为25例(各占37.88%)。受伤类型资料完整的创伤性ONFH患者144例,股骨颈骨折126例(87.50%)。饮酒史资料完整的酒精性ONFH患者544例,男性537例(98.71%),年龄41~50岁者172例(31.62%),饮酒年限6~10年149例(27.39%),饮酒次数5次≤每周饮酒<6次与每周饮酒≥7次均为127例(各占23.35%),每周饮酒量3001~3500 mL 222例(40.81%)。激素应用史资料完整的激素性ONFH患者210例,男112例(53.33%)、女98例(46.67%);激素应用时间14~10950 d,中位数365 d;原发病中免疫系统疾病50例(23.81%),比例最高,其余依次为皮肤、泌尿及血液系统等疾病;激素应用途径,口服125例(59.50%);激素应用种类,强的松68例(32.38%),比例最高,其余依次为地塞米松、甲强龙、泼尼松龙等。结论:酒精、激素、创伤仍是排在前3位的ONFH发病诱因;酒精性ONFH患者,多数饮酒时间>5年,每周饮酒次数>5次;激素性ONFH患者,激素应用时间中位数为365 d,应用途径主要是口服,排在前3位的药物为强的松、地塞米松、甲强龙,原发病主要为免疫、皮肤、泌尿、血液系统疾病;创伤性ONFH患者受伤类型以股骨颈骨折为主。     

辨证与辨病相结合辨治乳腺增生病

探讨乳腺增生病中医辨证分型的客观依据,泌免疫变化与中医辨证分型的相关性进行了总结和研究,医药辨治乳腺增生病的新思路。对乳腺增生病的红外光扫描诊断、病理分类、内分以期能够使微观医学与宏观辨证相结合,以开拓中医药辨治乳腺增生病的新思路。     

中药产业竞争力提升战略研究

本文运用了竞争力理论与战略理论，分析了中药产业竞争力提升的环境与条件，提出了提升中药产业竞争力的三大战略目标、三大总体战略、四条战略举措及三个实施阶段与重点任务。     

往来寒热证58例辨证论治探讨

收集我院门诊自2000年10月至2003年9月接诊的往来寒热证患者58例,实验室检查排除疟疾(血涂片均未找见疟原虫),分别从少阳辨证论治33例,从膜原辨证论治25例,疗效满意。     

咳嗽六经辨治初探

六经皆有咳嗽,寒热皆可致咳,治疗上不可拘于一理一方,当穷究其机,辨证施治,方能事半功倍。以六经辨证为纲,分析《伤寒杂病论》对咳嗽的有关论述,以期提高咳嗽的临床疗效。     

中医“治未病”理论的研究

治未病是中医学重要的防治思想,即预防疾病的发生和发展,防惠于未然的预防学思想,即未病之前,防止疾病的发生;已病之后,防止疾病的传变,强调以“预防为主”。本文从治未病的渊源;治未病思想的实质内容;“治未病”理论的应用;“治未病”临床研究进展等几方面解释治未病。