糖皮质激素受体基因在受体缺失型哺乳动物细胞中的表达

本文在证实小鼠成纤维细胞系Ｅ８２．Ａ３无糖皮质激素受体（ＧＲ）的基础上，采用磷酸钙共沉淀法，用含大鼠肝ＧＲｃＤＮＡ的质粒ｐＲＧＲ－Ｎｅｏ转染给Ｅ８２．Ａ３细胞，并用Ｇ４１８筛选稳定表达细胞，Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析表明，转化细胞特异性结合［３Ｈ］曲安缩酮的结合参数及甾体特异性与经典ＧＲ相同，说明所筛选得的细胞确实表达了ＧＲ。     

GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响

目的:构建糖皮质激素受体β(GRβ)不同表达水平的肾小球系膜细胞株,研究GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响.方法:利用逆转录病毒载体pLXSN将重组GRβ正义和反义基因转入肾小球系膜细胞,经细胞培养、逆转录聚合酶链反应、基因测序和蛋白质印迹分析鉴定所构建的细胞株,应用MTT法和流式细胞术检测细胞内不同表达水平的GRβ对地塞米松的细胞增殖抑制效应和细胞周期变化的影响.结果:构建的肾小球系膜细胞分别有正确的GRβ正义和反义基因整合,转染了GRβ正义基因的肾小球系膜细胞内GRβ蛋白质表达水平明显高于转染了GRβ反义基因者(109.74±10.63 vs.19.08±1.01,P＜0.05);地塞米松对GRβ高表达的肾小球系膜细胞的增殖抑制效率显著低于GRβ低表达的肾小球系膜细胞(18.47%±2.12% vs.60.33%±5.29%,P＜0.05).在地塞米松的抑制下,转染了正义GRβ基因的细胞中,其S期细胞降低程度和G1期细胞升高的程度均明显低于未转染的细胞.结论:肾小球系膜细胞内高表达的GRβ具有拮抗糖皮质激素效应的作用,细胞内GRβ表达水平是决定细胞对激素敏感或抵抗的重要因素.     

大鼠肝胞液糖皮质激素受体的高效液相分析

目的：应用高效液相疏水作用层析法（HPHIC）分离并纯化大鼠肝胞液高、低亲和力糖皮质激素受体（GRH和GRL），为临床大剂量糖皮质激素（GC）冲击治疗提供实验依据。方法：超速离心大鼠肝组织，取上清，核素^3H-地塞米松（Dex）标记后，分别行Pseudoscatchard分析及HPHIC分析，SDS-PAGE及Western印迹法鉴定HPHIC分析后所收集的峰值管蛋白的性质。结果：在标准大气压，0～4℃条件下，只出现一个洗脱峰，峰值位置在9～11min。而在标准大气压，25℃且^3H-Dex≥50nmol/L时出现两个洗脱峰，峰值位置在3～7min及9～11min。SDS-PAGE及Western印迹法显示5～7min和9～11min时出现相对分子质量约60000、可与GC单克隆抗体结合的蛋白质分子。结论：提示有两种不同大小的GR分子存在，但是否存在GRH和GRL尚需进一步的实验证实。     

低氧对A549细胞糖皮质激素受体表达的影响

目的研究不同低氧时间培养下,人肺腺癌上皮A549细胞糖皮质激素受体α(GRα)和糖皮质激素受体β(GRβ)的表达。方法将A549细胞分成6组,低氧组(3组)和对照组(3组),分别放置于低氧小室(37℃,95%N2,5%CO2)和普通培养箱中(37℃,95%空气,5%CO2)培养。24h、48h、72h后收集细胞,运用倒置显微镜下拍摄照片、RT-PCR和免疫细胞化学方法观察缺氧对A549细胞数目、形态以及细胞内GRα、GRβ mRNA和蛋白表达的影响。结果①低氧组细胞形态发生显著改变,随着低氧时间的延长,细胞生长速度逐渐减慢,细胞肿胀变形逐渐加剧。②RT-PCR的结果显示:24hGRα mRNA表达水平低氧组(0.914±0.079)与对照组(0.883±0.208)比较略有降低,但差异无显著性(P>0.05);48、72hGRα mRNA表达水平低氧组(0.794±0.029、0.828±0.171)与对照组(1.054±0.120、1.187±0.173)比较显著降低,差异有显著性(P<0.05);24、48、72hGRβ mRNA表达水平低氧组(0.439±0.175、0.437±0.117、0.433±0.101)与对照组(0.429±0.140、0.443±0.114、0.553±0.110)比较差异无显著性(P>0.05)。③免疫细胞化学的结果显示:24hGRα蛋白表达水平低氧组与对照组比较无显著改变;48、72hGRα蛋白表达水平低氧组与对照组比较显著降低;24、48、72hGRβ的蛋白表达水平低氧组与对照组比较无显著改变。结论低氧可导致A549细胞GRα的mRNA和蛋白表达水平显著降低;低氧环境可能会影响糖皮质激素作用的发挥。     

糖皮质激素受体与虚证的关系及中药的调节

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)属细胞内核受体超家族中的一员,是一种配基依赖型转录因子.GR几乎在机体的所有有核细胞中表达,在很多生理以及病理过程中发挥重要作用,包括维持内环境的稳定、抗应激、调节神经系统的功能等.另外,糖皮质激素的抗炎、抗自身免疫和抗肿瘤的作用也是由GR介导的,因此,GR也是重要的免疫系统调节因子.通过调节GR,可以对机体和细胞的生理、病理状态产生重要影响.中医药在调节糖皮质激素受体方面也进行了许多探索,为中医药作用机制研究奠定了现代生理病理学基础.     

Increased hsp70 of glucocorticoid receptor complex induced by scald and heat stress and its possible effect on the affinity of glucocorticoid receptor

Background Glucocorticoid （GC） insensitivity/GC resistance is an important etiological and prognostic factor in multiple diseases and pathophysiological processes such as scald, shock and asthma. The function of GC was mediated by glucocorticoid receptor （GR）. Scald not only decreased the expression of GR but also reduced the affinity of GR, which played an important role in GC resistance in scalded rats. Whereas the molecular mechanism responsible for the decrease of GR affinity resulted from scald remains unclear. Recent studies showed that the changes of heat shock proteins （hsp） especially hsp90 and hsp70 of GR heterocomplex were associated with GR low affinity in vitro. Methods The affinity of GR in hepatic cytosols and in the cytosols of SMMC-7721 cells were determined by radioligand binding assay and scatchard plot. GR heterocomplex in cytosols were captured by coimmunoprecipation and the levels of hsp90 and hsp70 of GR complex were detected by quantitative Western blotting. Results Similar with that of hepatic cytosol of scalded rats, a remarkable decrease of GR affinity was also found in the cytosol of heat stressed SMMC-7721 cells. The level of hsp70 of GR complex in hepatic cytosol of scalded rats （30% total body surface area immersion scald） and in cytosol of heat stressed human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 were both increased by 1.5 fold, whereas no change of hsp90 in GR heterocomplex was found. According to the correlation analysis, there may be a positive relationship between increased hsp70 of GR complex and decreased GR affinity in the cytosols. Conclusions The primary results indicated that the level of hsp70 of GR heterocomplex was increased in the hepatic cytosol of scalded rats and the cytosol of heat stressed SMMC-7721 cells. The increase of hsp70 of GR complex might be associated with the decrease of GR affinity.     

Forskolin augments the effects of glucocorticoids on proliferation and differentiation of a human osteosarcoma cell line by u

Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎａｕｇｍｅｎｔｓｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆａｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｂｙｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｌｕ...     

基于Cre/loxP系统的糖皮质激素受体基因条件性打靶嵌合鼠的获得

目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件.方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交筛选发生正确同源重组的ES细胞,囊胚注射法制备嵌合体并进行生殖系检测及纯化建系.结果:成功构建了针对GR基因第2外显子的诱导型目标载体,转染ES细胞获得了工程化的ES细胞,经囊胚注射获得了由工程化的ES细胞和体细胞共同发育而来的嵌合体小鼠.结论:基于Cre/loxP系统的GR基因条件性打靶嵌合鼠的获得,为得到理想的诱导型GR基因剔除小鼠模型奠定了基础.     

NMDA受体对烫伤应激大鼠海马糖皮质激素受体基因表达的影响

目的：观察烫伤应激后海马糖皮质激素受体（GR）基因表达的变化，探讨N－甲基－D－天冬氨酸（N－methyl-D-aspartate,NMDA）受体在这种变化中的作用。方法：利用RT－PCR技术，检测烫伤前腹腔注射NMDA受体拮抗剂MK－801及激动剂NMDA对烫伤应激后2h GR mRNA水平的影响。结果：烫伤应激后2h海马GR mRNA水平明显降低（P＜0．01）；应激前腹腔注射MK－801使烫伤后降低的GR mRNA水平明显恢复（P＜0．01），注射NMDA使其进一步降低（P＜0．05），注射生理盐水无明显变化。结论：NMDA受体介导了烫伤应激导致的海马GR转录水平基因表达的下降。     

大鼠外周血白细胞糖皮质激素受体的测定

目的为了测定糠皮质激素受体（GR）的结合参数,以利于今后进一步探讨GR改变在某些疾病发生中的作用及对治疗的指导意义。材料和方法以［3H］地塞米松（Dex）为配基,建立了大鼠外周血GR的放射配体结合测定方法。结果Scatchard作图分析[3H]Dex特异结合呈一直线,表现结合容量(Ro)和平衡解离常数（Kd）分别为（3387±328）位点／细胞和（2.35±1．13）nmol/L（±s,n=5）,[3H]Dex特异结合有明显的甾体特异性。结论大鼠外周血白细胞[3H]Dex特异结合部位具备了鉴定受体所必须的基本条件。     

过氧化物增殖激活受体α激动剂非诺贝特下调大鼠肝脏糖皮质激素受体表达

目的 探讨过氧化物增殖激活受体α(PPAR-α)激动剂非诺贝特对大鼠糖皮质激素受体(GR)表达调节作用.方法 30 只雄性SD大鼠随机分为对照组,FE1组(非诺贝特50mg·kg~(-1)·d~(-1),1个月),FE2组(非诺贝特100 mg·kg~(-1)·d~(-1),1个月),FE3组(非诺贝特100mg·kg~(-1)·d~(-1),2个月),MK886组[同时给予非诺贝特(100 mg·kg~(-1)·d~(-1))和PPARa抑制剂MK886(30 mg·kg~(-1)·d~(-1)),1个月].检测SD大鼠肝脏、肌肉、脂肪组织GR基因和蛋白表达水平,同时测定肾上腺11β-羟化酶(CYP11B1)基因表达水平,并以放免法测定大鼠血皮质酮水平.结果 非诺贝特显著下调了大鼠肝脏组织GR基因和蛋门质表达水平,FE1、FE2和FE3 3组GR mRNA水平分别较正常组降低55%、54%、68%,蛋白质表达水平分别降低了28%、77%和99%;并升高.肾上腺CYP11B1表达水平及血中皮质酮水平,而MK886完全逆转了非诺贝特的这些效应[正常组、FE1、FE2、FE3、MK886组皮质酮水平分别为(393±23)、(495±44)、(516±18)、(622±93)、(382±37)ng/ml],提示非诺贝特可抑制肝脏GR表达,并促进肾上腺皮质酮合成增多,这些作用依赖于PPARα激活.结论 PPARα激活剂非诺贝特可抑制肝脏GR表达.     

Studies on the function and regulation of low－affinity glucocorticoid receptor

Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ￥ＬｅＹｉｎｇｙｉｎｇ（乐颖影）；ＸｕＲｅｎｂａｏ（徐仁宝）（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏ...     

慢性阻塞性肺疾病激素不敏感与糖皮质激素受体核内转移的相关性

 目的  研究慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD)对糖皮质激素不敏感是否与糖皮质激素受体 (glucocorticoids receptor,GRα)的核内转移有关。方法  将来自12例健康人、15例轻中度哮喘患者和15例COPD患者的人外周血单个核细胞 (peripheral blood molecule cells,PBMC)进行体外培养。ELISA方法检测其IL-8蛋白质水平,并计算地塞米松 (Dex)半抑制浓度。PBMC在Dex中培养0.5~6 h,通过Western blot检测GRα蛋白质水平,GRα的核内转移则通过免疫荧光和共聚焦显微镜来观测和分析评估。结果  COPD患者PBMC较轻中度哮喘患者和健康志愿者对Dex相对不敏感。Dex半抑制率 (IC50Dex)与糖皮质激素受体GRα核内转移呈负相关 (r=-0.54,P=0.000 8)。Dex可诱导增加各组PBMC中的总GRα,但GRα胞内分布各组间存在差异。Dex可明显增加健康人及哮喘患者核内的GRα,但并未增加COPD患者核内GRα。健康人及哮喘患者的PBMC中,Dex预处理能显著抑制TNF-α诱导的IL-8分泌,而在COPD患者的PBMC中这种抑制作用不明显。结论  COPD对糖皮质激素的不敏感与GRα核内转移有关。GRα核内转移受抑制可能是造成糖皮质激素在COPD患者中发挥抑制炎性作用欠佳的原因之一。     

Effects of Dexamethasone on glucocorticoid receptor expression in a human ovarian carcinoma cell line 3AO

Ourpreviousworkhasshownthatdexamethasone (Dex) ,asyntheticglucocorticoid ,inhibitshumancarcinomacell(3AO)proliferationandinducesdifferentiationinatime andconcentration dependentmanner 1　Butthemolecularmechanismbehindtheseobservationswasunclear Thepresentstudyinvestigatestheexpressionofglucocorticoidreceptor (GR)in 3AOcellsbyDexaswellastheDex inducedcellulareffectsthatweremediatedbyGR METHODSMaterialsRPMI 16 40mediumwasobtainedfromNissuiPharmaceuticalCo ,Ltd (Tokyo ,Japan) 1,2 ,4 …     

分泌高滴度重组人糖皮质激素β受体正义和反义cDNA逆转录病毒细胞系的建立

目的：建立分泌重组人糖皮质激素β受体cDNA的逆转录病毒的细胞系。方法：脂质体介导含人糖皮质激素β受体正义和反义全长cDNA的重组逆病毒质粒分别转染包装细胞PA317，经G418筛选抗性克隆。结果：细胞培养上清液的RT-PCR联合序列分析表明G418抗性PA317细胞克隆能稳定合成并分泌相应的重组病毒颗粒；NIH3T3细胞测定的正、反义cDNA重组病毒滴度分别为2×105 CFU/ml和1.8×105 CFU/ml。结论：成功建立了能分别产生重组hGRβ正义和反义cDNA逆转录病毒的高滴度细胞系，为后续研究工作打下坚实基础。     

外源性糖皮质激素对胎鼠肺糖皮质激素受体基因的作用

目的：研究糖皮质激素在妊娠后期肺表现活性物质合成过程中对糖皮质激素受体（GR）的调节作用。方法：采用分子生物学杂交技术、Northern印迹法测定胎鼠肺及其二种主要细胞的GR mRNA及Wrang法测定外源性糖皮质激素对胎鼠肺及二种主要细胞GR结合活性的作用。结果：大剂量地塞米松可使胎鼠肺GR结合活性增加GRmRNA无变化。在成纤维细胞（FIB）营养液中加入10^-7mol/L的可的松,GR结合活性和蛋白量增加,GRmRNA无变化。上皮细胞（EPI）GR蛋白量减少,GRmRNA无变化,肺表面活性物质蛋白（SP－A）经同样处理其值增加。结论：胎鼠肺GR的调节发生于转译后水平,妊娠后期使用糖皮质激素对胎鼠的成熟有重要生理意义。     

糖皮质激素受体β的稳定过度表达对激素调节人骨肉瘤细胞增殖分化作用的影响

目的:研究糖皮质激素受体β(GRβ)的稳定过度表达对激素调节人骨肉瘤细胞增殖分化作用的影响,探讨糖皮质激素受体β的生物学意义.方法:将GRβ在人骨肉瘤细胞中稳定过度表达,用不同浓度(10-10～10-6 mol/L)的地塞米松处理稳定过度表达GRβ的细胞,用活细胞计数法和MTT法检测细胞的增殖,用标准酚比色法检测碱性磷酸酶(AKP)的活性.结果与结论:在稳定过度表达GRβ的人骨肉瘤细胞中,糖皮质激素抑制细胞增殖和诱导细胞分化的作用均减弱;GRβ可能是GRα的内源性抑制因子.     

稳定表达糖皮质激素受体β的人骨肉瘤细胞系的建立

目的:建立稳定表达糖皮质激素受体β的细胞系.方法:构建糖皮质激素受体β的真核表达载体,用Lipotransfectamine法转染人骨肉瘤细胞系HOS-8603,经G418筛选后得到稳定转染细胞株;用极限稀释法获取亚克隆细胞株;用定量RT-PCR方法鉴定糖皮质激素受体β mRNA的表达.结果与结论: 建立了稳定表达糖皮质激素受体β的细胞株,为进一步研究糖皮质激素受体β的生物学意义打下了基础.     

银屑病患者血中糖皮质激素及其受体mRNA的测定及其意义

目的　研究银屑病患者体内糖皮质激素水平及其受体基因表达的变化 .方法　用酶免疫法测定了 2 2例银屑病患者、15例临床治愈的银屑病患者和 2 0例正常人对照组血清糖皮质激素水平 ,用 RT- PCR方法检测 12例银屑病患者和10例正常人对照血白细胞糖皮质激素受体 m RNA的表达水平 .结果　银屑病患者组血清糖皮质激素水平 (0 .5 8± 0 .0 7μmol· L- 1 )高于银屑病临床治愈组 (0 .49± 0 .11μmol· L- 1 )和正常对照组 (0 .48± 0 .10 μmol· L- 1 ) ,差异有极显著性(P<0 .0 1) ,银屑病患者组血白细胞糖皮质激素受体 m RNA表达明显低于正常对照组 (P<0 .0 1) .结论　银屑病患者体内糖皮质激素浓度不低于正常水平 ;银屑病患者组血白细胞糖皮质激素受体 m RNA表达低于正常水平 ,提示银屑病患者体内促肾上腺皮质激素释放激素 -糖皮质激素 -糖皮质激素受体系统平衡失调 ,可能与银屑病的发病有一定关系     

Increased hsp70 of glucocorticoid receptor complex induced by scald and heat stress and its possible effect on the affinity of glucocorticoid receptor

Background Glucocorticoid (GC) insensitivity/GC resistance is an important etiological and prognostic factor in multiple diseases and pathophysiological processes such as scald, shock and asthma. The function of GC was mediated by glucocorticoid receptor (GR). Scald not only decreased the expression of GR but also reduced the affinity of GR, which played an important role in GC resistance in scalded rats. Whereas the molecular mechanism responsible for the decrease of GR affinity resulted from scald remains unclear. Recent studies showed that the changes of heat shock proteins (hsp) especially hsp90 and hsp70 of GR heterocomplex were associated with GR low affinity in vitro. Methods The affinity of GR in hepatic cytosols and in the cytosols of SMMC-7721 cells were determined by radioligand binding assay and scatchard plot. GR heterocomplex in cytosols were captured by coimmunoprecipation and the levels of hsp90 and hsp70 of GR complex were detected by quantitative Western blotting.Results Similar with that of hepatic cytosol of scalded rats, a remarkable decrease of GR affinity was also found in the cytosol of heat stressed SMMC-7721 cells. The level of hsp70 of GR complex in hepatic cytosol of scalded rats (30% total body surface area immersion scald) and in cytosol of heat stressed human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 were both increased by 1.5 fold, whereas no change of hsp90 in GR heterocomplex was found. According to the correlation analysis, there may be a positive relationship between increased hsp70 of GR complex and decreased GR affinity in the cytosols.Conclusions The primary results indicated that the level of hsp70 of GR heterocomplex was increased in the hepatic cytosol of scalded rats and the cytosol of heat stressed SMMC-7721 cells. The increase of hsp70 of GR complex might be associated with the decrease of GR affinity.