隐性听力损失小鼠模型的噪声性聋易感性研究

目的 基于一种基因敲入小鼠(C57BL/6-Atp6v1b2^{Arg506X/Arg506X})的隐性听力损失(Hidden hearing loss,HHL表型探索HHL小鼠噪声暴露后听力损失发生、发展机制。方法 12周隐性听力损失模型小鼠各6只,野生型、纯合型同窝对照,给予白噪声75dB SPL暴露8小时,于噪声前、噪声暴露后1天、7天、14天行听性脑干反应(Auditory brainstem response,ABR)测试分析两组小鼠听力学差异,取2组小鼠耳蜗组织,免疫荧光染色观察内外毛细胞及内毛细胞带状突触数量变化,分析毛细胞内自噬蛋白表达。结果 低强度噪声暴露后,纯合组小鼠较野生型小鼠听力下降明显,纯合小鼠带状突触计数较野生型减少,纯合小鼠毛细胞自噬蛋白表达量较野生型降低,且内外毛细胞无明显损失。结论 HHL可能具有遗传基础且对噪声具有易感性。HHL小鼠噪声暴露后听力下降与溶酶体功能进一步降低、带状突触数量减少相关。全面的听力检测及基因检测有助于早期诊断隐匿性耳聋。噪声防护在隐性听力损失个体尤为重要。     

100dB SPL白噪声暴露对小鼠耳蜗听神经髓鞘的影响

目的观察中等强度噪声暴露是否对成年C57BL/6J小鼠耳蜗听神经造成损害。方法选取24只听阈正常的6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组(6只/每组),实验组按照暴露后时间分别为暴露后即刻(P0)、暴露后7天(P7)和暴露后14天(P14)组,另外一组未经噪声暴露,设为对照组;实验组小鼠用100dB SPL宽频带白噪声暴露2小时,在噪声暴露后即刻、7天和14天分别检测小鼠ABR阈值,之后取小鼠耳蜗行基底膜免疫荧光观察,并进一步采用透射电镜观察小鼠听神经髓鞘结构的变化。结果 1)听力学表现:P0组C57BL/6J小鼠各个频率的ABR阈值均明显高于对照组(P<0.05),以8kHz、16kHz及32kHz最为显著(P<0.01);P7时各频率阈值基本恢复,仅在32kHz显著高于对照组(P<0.05);P14时小鼠ABR阈值与对照组相比已无显著差异(P>0.05)。2)形态学表现:经共聚焦显微镜观察发现P0时听神经髓鞘信号偶有轻微减弱,而各组标本中髓鞘信号的数量和密度无明显差异。冰冻切片显示各实验组与对照组相比,髓鞘信号均有效表达,信号强度均匀、致密连贯,条索样结构清晰,数量亦无明显缺失。透射电镜下各时间点听神经髓鞘成像清晰,排列整齐,且板层样结构致密,边缘光滑,与对照组相比髓鞘形态上并无明显差异(P>0.05)。结论 100dB SPL宽频带白噪声暴露后可造成小鼠出现暂时性阈移(TTS);此种噪声暴露下耳蜗听神经髓鞘并未观察到明显的形态学改变。     

宽频带白噪声暴露对巴马香猪和豚鼠听力损伤的影响

目的通过120dB SPL宽频带白噪声对巴马香猪和豚鼠各进行单次3小时的暴露,观察比较该种噪声对两种模型动物听力损伤的特点,找到更适用于研究噪声性听力损伤的动物模型。方法选取8只6月龄ABR听阈正常的巴马香猪,和8只5~6周龄ABR听阈正常的豚鼠,设置4个ABR测听记录点:噪声暴露前,噪声暴露后即刻(P0)、1天(P1)、7天(P7)。全部测听结束后,取材制作耳蜗标本,进行扫描电镜观察形态。结果通过统计学分析,豚鼠组在120dB SPL宽频带白噪声暴露后即刻的ABR阈值与暴露1天的ABR阈值具有明显差异,具有统计学意义,而巴马香猪组则无明显统计学差异。豚鼠组在噪声暴露前和噪声暴露后7天的ABR阈值无明显统计学差异,而巴马香猪组却有明显的统计学差异。相对于豚鼠,巴马香猪耳蜗标本扫描电镜提示了更多的纤毛异常。结论120d B SPL宽频带白噪声暴露会对巴马香猪和豚鼠造成一定程度的听力损伤。其中巴马香猪较豚鼠表现更为明显的听力损失,且毛细胞出现了更多的病理改变,由此本研究表明在120d B SPL宽频带白噪声单次暴露3小时的条件下,巴马香猪是一个更适于白噪声与听力损伤的研究的动物模型,从而可以更好地为噪声性耳聋提供动物模型。     

长时程低强度噪声暴露对豚鼠内毛细胞带状突触的影响分析

目的 观察日常生活可遇低强度噪声多次暴露对豚鼠耳蜗带状体突触的损失和恢复,以及对听觉功能的影响。 方法 对豚鼠行95 dB声压级白噪声环境下4 h/d暴露,连续暴露7 d,于噪声后1 d、1周、1个月分组行听力学检查,并与对照组动物比较(每组10只),以免疫荧光法双标法对突触前膜Ctbp2和突触后膜PSD95进行标记并计数。 结果 长时程、低强度噪声暴露后听觉脑干诱发电位阈值提高(P<0.05),豚鼠内毛细胞排布、形态、数量均无明显改变,但内毛细胞带状突触数量有明显减少(P<0.05)并有不完全恢复。 结论 “安全剂量”低强度噪声多次暴露后可造成可逆听觉阈值升高,伴随内毛细胞带状体突触的明显减少和不完全恢复。     

西地那非对豚鼠噪声性听觉损伤阈移的影响

目的 探讨西地那非(sildenafil)对豚鼠噪声性听觉损伤阈移的影响.方法 将豚鼠按随机数字表法分为对照组、噪声暴露组和西地那非给药组,每组10只.西地那非组及噪声组豚鼠在白噪声(A计权声压级110 dB)暴露1周后分别腹腔注射西地那非10 mg/(kg·d)及生理盐水4mL/(kg·d),连续给药4周.分别测试噪声暴露前1日、噪声暴露后1、2及4周听性脑干反应(ABR)阈值,并通过扫描电镜观察噪声暴露后4周豚鼠耳蜗毛细胞的形态变化.结果 噪声暴露1后,噪声暴露组豚鼠ABR阈值(声压级)平均提高19.1 dB,随着时间推移,阈移逐渐加大,暴露后4周,阈值平均提高22.0 dB;西地那非组噪声暴露后ABR阈值提高19.8 dB,给药后阈移逐渐减小,给药后4周,阈值仅平均提高4.8 dB.西地那非组与噪声暴露组相比,除噪声暴露结束后这一时间点以外,其余给药后各时间点ABR阈值差异均具有统计学意义(P值均＜0.05).扫描电镜显示,噪声组豚鼠耳蜗内、外毛细胞均出现听毛紊乱、融合及缺失;而西地那非组耳蜗病变较轻,听毛仅有轻微倒伏、融合现象.结论 西地那非能够减轻噪声对豚鼠耳蜗毛细胞的损害,降低噪声性听觉损伤引起的ABR阈值升高.     

噪声暴露后豚鼠耳蜗电生理和超微结构的改变

目的 观察豚鼠噪声暴露后其耳蜗电生理与毛细胞超微结构的改变,探讨哺乳动物在毛细胞受损后能否自我修复.方法 将30只豚鼠分为四组,正常对照组5只,噪声暴露后0.5 h组5只,7天组10只,3周组10只,后三组豚鼠暴露于 120 dB SPL白噪声中2 h,分别于结束暴露后0.5 h及7天、3周后检测听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)及40 Hz听觉相关电位(40 Hz-AERP),扫描电镜观察耳蜗超微结构的变化.结果 豚鼠噪声暴露后7天组、3周组ABR及40 Hz-AERP较0.5 h组有所恢复,但未恢复至正常水平,差异仍具有统计学意义.扫描电镜观察噪声暴露后耳蜗毛细血管内的红细胞随时间延长逐渐增加,外毛细胞倒伏现象有改善.结论 噪声暴露后外毛细胞可能有自我修复功能.     

庆大霉素对内毛细胞带状突触CaVl．3钙离子通道蛋白表达的影响

目的：研究庆大霉素对C57BL／6J小鼠听力及耳蜗内毛细胞带状突触CaVl．3钙通道蛋白数量的影响,探讨听力损失与其剂量相关性变化之间的关系及意义。方法：采用固定剂量[100mg／（kg·d）]的氨基苷类抗生素（庆大霉素）对C57BI。／6J小鼠每日进行腹腔注射造模,分别在注射后的第7天、第14天、第28天（注射14d停药14d）应用ABR分别测得小鼠的听力。免疫荧光方法观察耳蜗基膜内毛细胞带状突触caVl．3钙通道蛋白的分布和表达（其中0天为空白对照组）,内毛细胞突触前后膜分别采用CtbP2和CaVl．3进行免疫荧光标记。结果：随着注射药物天数的增长ABR反应阈值明显提高,所有小鼠内毛细胞数量、形态均无明显变化,但内毛细胞带状突触CaVl．3钙离子通道蛋白量的表达存在显著差异（P〈0．01）。CaVl．3钙离子通道蛋白在庆大霉素腹腔注射CaVl．3／CtBP2表达数量在第7天时略有增加,在第14天时其表达数量明显减少,第28天与第14天比较CaVl．3／CtBP2表达数量有所增加,但低于正常。结论：在氨基苷类抗生素毒性环境中耳蜗内毛细胞CaVl．3蛋白表现为先增加后减少再增加的趋势,提示内毛细胞带状突触CaVl．3蛋白数量的增加可能存在对这类药物毒性的代偿作用,而随着药物毒性作用时间的增加,这种失代偿作用表现为听力下降,可能是损伤听力的机制之一。     

TLR4基因敲除小鼠对噪声性耳蜗损伤的反应

目的揭示Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)基因缺失对噪声性耳蜗感觉细胞损伤,听觉功能障碍和耳蜗免疫活力的影响作用,探讨噪声性耳蜗损伤的免疫炎性机制。方法将TLR4基因敲除(TLR4 KO)小鼠接触持续噪声暴露(1-7kHz,120dB SPL)1小时,以噪声暴露的野生型(WT)小鼠为对照,检测噪声暴露前和噪声暴露后25天四个频率短纯音(4 kHz、8 kHz、16 kHz和32 kHz)诱发的小鼠双耳ABR阈值。噪声暴露后1天,25天处死动物,解剖取双侧耳蜗。采用白细胞共同抗原(CD45)荧光免疫抗体标记噪声暴露前和噪声暴露后1天耳蜗基底膜免疫细胞,鬼笔环肽(phalloidin)染色噪声暴露前和噪声暴露后25天耳蜗基底膜毛细胞纤毛、表皮板的丝状肌动蛋白。荧光显微镜下观察噪声暴露后TLR4 KO小鼠和WT小鼠耳蜗基底膜组织的巨噬细胞、单核细胞和毛细胞形态变化,计数耳蜗基底膜外毛细胞的缺失数目。结果噪声暴露后1天,WT和TLR4 KO小鼠耳蜗基底膜均呈现单核细胞渗入。噪声暴露后25天,不同频率短纯音诱发的TLR4 KO小鼠ABR阈移和耳蜗基底膜外毛细胞缺失数目均低于WT小鼠(F=71.590, df=1,90, P<0.001; Tukey test, P<0.001),(F=8.996, df=1,17, P=0.008; Tukey test, P=0.008)。结论噪声暴露后TLR4基因缺失没有阻止单核细胞渗入耳蜗基底膜,但减轻噪声暴露后耳蜗感觉细胞和听功能损伤的程度。     

不同噪声暴露次数对C57小鼠听功能影响的研究

目的通过噪声暴露构建C57小鼠不同程度的耳聋模型。方法听力正常小鼠随机分成对照组A,一次噪声暴露组B,二次暴露组C和三次暴露组D,白噪声100dBSPL持续2小时,二次和三次噪声暴露为隔日给声。噪声暴露组分别在噪声暴露前,和最后一次噪声暴露后的第1天,第7天和第14天进行ABR阈值测试,第14天Ⅰ波振幅测试和耳蜗组织切片,HE染色进行毛细胞和螺旋神经节细胞计数。结果噪声暴露后第1天和第7天ABR阈值有明显升高,但B组第7天已经呈现恢复状态,而C、D组则呈现渐进性加重趋势。第14天时,B组阈值已经完全恢复,而C、D组小鼠未能完全恢复正常。ABRI波振幅在B、C、D组均有不同程度的降低。各组小鼠耳蜗内毛细胞和螺旋神经节细胞计数无明显差异,单次噪声暴露外毛细胞无明显损失,但随暴露次数增多,损失逐渐加重。结论通过不同次数的噪声暴露,可以构建稳定的C57小鼠的隐匿性听力损失和噪声性耳聋动物模型。     

强噪声暴露后不同时期豚鼠耳蜗外毛细胞死亡方式的研究

目的观察强噪声暴露后不同时期豚鼠耳蜗外毛细胞的死亡方式。方法选用健康雄性白色豚鼠48只,随机分为健康对照组及噪声暴露后3h、1d、4d、14d、30d组(实验组),每组8只,实验组动物暴露于120dBSPL、4kHz窄带噪声环境4h,各组豚鼠于实验前及噪声暴露后相应时间点处死前测试听性脑干反应(auditorybrainstem response,ABR),然后完成耳蜗基底膜铺片、Hoechst33342荧光染色,共聚焦荧光显微镜观察毛细胞核的变化并计数。对照组不作任何处理。结果实验组噪声暴露后各组ABR反应阈明显高于对照组和噪声暴露前各组(P<0.01),实验组豚鼠耳蜗可见外毛细胞出现凋亡、坏死和缺失三种变化,噪声暴露后3h、1d、4d组凋亡的细胞数明显多于坏死(P<0.05),噪声暴露后14d组凋亡与坏死的细胞数没有明显差别(P>0.05),噪声暴露后30d组坏死细胞数多于凋亡(P<0.05)。结论强噪声暴露后早期豚鼠耳蜗外毛细胞损害以凋亡为主,且凋亡过程迅速,耳蜗基底膜外毛细胞核的缺失主要源于凋亡细胞,强噪声暴露后中晚期外毛细胞损害以坏死为主。