重组人凝血因子Ⅶ的研究进展

人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ,hFⅦ)是参与血液凝血级联反应的蛋白之一,在凝血过程中发挥极其重要的作用.hFⅦ主要用于治疗和预防先天性或获得性血友病患者的出血,还可用于非血友病患者的创伤性大出血.通过基因工程技术制备hFⅦ不仅安全,而且还易于大规模生产.已有文献报道在利什曼原虫、昆虫细胞、多种哺乳动物细胞以及转基因兔乳腺中成功表达重组hFⅦ.因此,开发能高效表达重组hFⅦ的表达系统,将使大规模生产hFⅦ成为可能.     

利什曼病疫苗研究进展(待续)

利什曼病是一种媒介传播的寄生虫病,由不同种属的利什曼原虫感染引起.利什曼病流行于全球88个国家,约3.5亿人受到威胁.目前治疗利什曼病的主要方法是化学疗法,但毒性和耐药性阻碍了其应用,因此急需开发出一种安全有效的利什曼病疫苗.尽管在过去的几十年,发现了许多利什曼原虫抗原,但仅少部分疫苗在临床试验阶段取得进展.此文就利什曼病疫苗的研究进展进行综述.     

IL-12可作为疫苗佐剂

真正有效的疫苗应能激发体液和细胞免疫应答,即能刺激两个主要CD4细胞亚群:TH1细胞和TH2细胞,前者产生白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ),与细胞免疫力有关;后者产生IL-4、IL-5和IL-10,与体液免疫力有关。 美国宾夕法尼亚大学兽医学院和Wistar研究所的研究者曾用硕大利什曼原虫和BALB/c小鼠进行研究,该动物对硕大利什曼原虫感染只产生TH2应答,因此,最终死亡。而C3H/HeN品系小鼠可产生两倍强度的TH1和TH2应答,体内产生的IFN-γ似能保护这类小鼠。但是,BALA/c小鼠摄入IFN-γ并用硕大利什曼原虫攻击     

利什曼病疫苗研究进展(续)

 利什曼病是一种媒介传播的寄生虫病,由不同种属的利什曼原虫感染引起。利什曼病流行于全球88个国家,约3.5亿人受到威胁。目前治疗利什曼病的主要方法是化学疗法,但毒性和耐药性阻碍了其应用,因此急需开发出一种安全有效的利什曼病疫苗。尽管在过去的几十年,发现了许多利什曼原虫抗原,但仅少部分疫苗在临床试验阶段取得进展。此文就利什曼病疫苗的研究进展进行综述.     

抗实验性利什曼病的ISCOM疫苗

疫苗接种产生的保护性免疫力取决于疫苗诱导能控制或清除病原体的免疫应答的能力。研究证实纯化的利什曼原虫抗原组分可明显保护小鼠免受实验性感染。利什曼原虫表面抗原gp63蛋白酶是一种侯选疫苗,可产生Th1 CD4~+细胞应答。作者以小鼠为模型,对gp63与免疫刺激复合物（ISCOM）构成的疫苗的免疫原性及保护效果进行了研究。     

CD137L融合蛋白真核表达载体的构建与表达

真核表达系统因具有完整的翻译后修饰、表达蛋白免疫原性较小而成为制药行业生产蛋白药物的新方向.该研究目的是构建CD137L融合基因真核表达载体,瞬时转染HEK293F细胞实现高效表达并进行蛋白纯化与活性分析.以该实验室保存的含有CD137L融合基因的质粒pET11a-FP为模板,采用PCR技术在目的基因N端添加长腹水蚤荧...     

真核表达重组小鼠IL-15/Fc融合蛋白的制备和活性鉴定

目的 制备真核表达小鼠白细胞介素15(IL-15)和IgGγ1 Fc段融合蛋白,并探讨其对抗原特异性CD8+T细胞的作用.方法 运用RT-PCR方法,从B6小鼠脾细胞中分离小鼠IL-15和IgG γ1绞链区-CH2-CH3 Fc cDNA.在IL-15 3'端和Fc 5'端引入BamH I酶切位点,将IL-15和Fc直接连接,构建小鼠IL-15/Fe融合蛋白基因,再连接到真核表达质粒载体pcDNA3.1(a+)上,转化CHO-S细胞表达、纯化后,研究其活性.结果 融合蛋白486 bp的编码由162个氨基酸组成,其中含48个信号肽氨基酸的小鼠IL-15前体蛋白和由681 bp编码227个氨基酸的IgGγ1-CH2-CH3功能区构成;表达蛋白在IL-15信号肽引导下能高效分泌到培养液中,有二聚体和三聚体两种天然结构,单体分子量约50 kDa,能特异性的结合IL-15R并抑制抗原诱导的CD8+T细胞的增殖反应.结论 成功构建了小鼠IL-15/Fc融合蛋白真核表达载体,并在CHO-S细胞中得到高效表达.此融合蛋白具有较高的生物学活性,可有效地抑制抗原特异性CD8+细胞的增殖反应.     

重组CD_(13)单链抗体和蝎毒素多肽AGAP融合蛋白真核表达及对NB4细胞的靶向杀伤作用

目的:本研究应用基因工程技术方法,构建含重组编码CD13单链抗体和蝎毒素镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide,AGAP)融合蛋白基因的表达载体,并研究CD13-AGAP融合蛋白对CD13阳性白血病细胞NB4影响。方法:克隆东亚钳蝎活性肽AGAP的基因,插入真核表达载体pSecTag2/CD13/RFP,得到pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体。酶切及测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染293T细胞,通过RT-PCR和免疫印迹方法检测融合基因和蛋白的表达。纯化融合蛋白,作用NB4细胞,CCK8检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期。结果:酶切及测序结果证实pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体构建成功,转染293T细胞后,RT-PCR和免疫印迹方法结果证实重组质粒得到有效表达,并纯化真核表达融合蛋白CD13-AGAP对血液肿瘤CD13阳性白血病细胞NB4有一定的生长抑制作用,并且使细胞周期G1期阻滞,S期减少。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pSecTag2/CD13/AGAP,并在293T细胞中成功表达,进一步证实融合蛋白对CD13阳性白...     

对治疗婴儿利什曼原虫所致内脏利什曼病的二线口服药的实验评价

在爱滋病患者中,由婴儿利什曼原虫所致的内脏利什曼病难以治疗,这是因为寄生虫的耐药性和高复发率.存在着对锑制剂和两性霉素B的替代药物,尤其是口服有效药物的需求.甲硝唑和固醇生物合成抑制剂(酮康唑、氟康唑、伊曲康唑和特比萘芬)口服后患者耐受良好,对利什曼原虫具有强活性,但用于治疗不同利什曼原虫引起的皮肤和内脏利什曼病的结果不吻合.一项实验是在治疗开始后第20日时,用培养物微量滴定法测定治疗7～17d的小鼠肝和牌中寄生虫的数量,以评价药物的活性.每日经口腔给药的剂量为:甲硝唑70和140mg/kg,酮康唑50和100mg/kg,氟康唑50和100mg/kg,伊曲康唑50和100mg/kg,特比萘芬100mg/kg.对照药葡甲胺锑酸盐每日剂量     

SARI基因真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的构建人SARI基因真核表达载体,并建立稳定转染的HeLa细胞系。方法采用RT-PCR技术从正常人外周血单个核细胞cDNA文库中扩增SARI基因序列,连接插入至pCMV-N-Flag真核表达载体,并对重组质粒进行酶切及测序鉴定;阳离子聚合物介导重组质粒转染HeLa细胞后,用G418抗生素筛选稳定转染的细胞系。间接免疫荧光检测Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系中的表达定位。RT-PCR及Western blot检测SARI mRNA及蛋白的表达变化。结果双酶切和DNA测序表明pCMV-Flag-SARI真核表达质粒构建成功。经G418筛选后,RT-PCR和Western blot表明,转染重组质粒的HeLa细胞系中SARI mRNA及蛋白的表达明显升高。间接免疫荧光结果显示,Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系的胞质和胞核中均有表达,且胞质荧光信号强于胞核。结论成功构建pCMV-Flag-SARI真核表达载体,表达的FlagSARI蛋白主要定位于HeLa细胞系的胞质中。