人内皮抑素抗肿瘤相关肽基因的克隆表达及活性研究

目的克隆并表达人内皮抑素抗肿瘤相关肽,检测其生物活性。方法人工合成人内皮抑素1~30位氨基酸(30肽,序列25~31由RGIRGAD改为RGDRGD)所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,几丁质亲和层析树脂一步纯化30肽。通过MTT法、鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验、小鼠体内抑瘤实验比较30肽和内皮抑素抗肿瘤活性。结果MTT证实30肽体外对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、胃癌7901细胞(SGC-7901)半数抑制浓度IC50为36μg/ml、47μg/ml,显著低于内皮抑素IC50179μg/ml、202μg/ml。CAM实验中30肽对血管的抑制作用更强。30肽在小鼠体内抑瘤率47.8%,效果优于内皮抑素28.7%。结论30肽具有更强抗肿瘤活性,有可能成为治疗肿瘤的一种新药物。     

肿瘤抑素41肽重组表达及活性研究

目的：构建肿瘤抑素41肽重组质粒,使其高效表达并纯化得到41肽,研究其抗肿瘤活性。方法人工设计并合成肿瘤抑素41肽基因序列,克隆到表达载体 pTYB21上,转化到大肠埃希菌 BL?21（DE3）中, IPTG诱导融合蛋白高效表达,几丁质亲和层析柱纯化后经Tricine?SDS?PAGE鉴定41肽。利用MTT法、吖啶橙／溴化乙锭（ AO／EB）荧光染色、小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤模型抑瘤实验并结合组织病理切片来研究肿瘤抑素41肽的生物学活性。结果构建肿瘤抑素41肽重组质粒,获得可溶性肿瘤抑素41肽。体外实验显示,41肽具有抑制人脐静脉内皮 HUVEC 细胞、人胃癌 HGC?27细胞和人肝癌HepG2细胞增殖和促进HUVEC、 HGC?27细胞凋亡的作用。体内实验显示,41肽对小鼠H22腹水型转移肝癌实体瘤生长具有明显的抑制作用,抑瘤率达到34?35％。结论成功构建了pTYB21?41肽重组质粒,肿瘤抑素41肽具有显著的抗肿瘤活性,为肿瘤抑素机制研究和临床应用研究奠定了基础。     

肿瘤抑素30肽的重组表达及抗肿瘤活性研究

目的：重组表达肿瘤抑素30肽并研究其抗肿瘤活性。方法设计并合成30肽基因序列,将此序列与融合蛋白表达载体 PTYB21重组,转化到大肠埃希菌 BL-21(DE3)。 IPTG 诱导表达,几丁质柱纯化得到30肽,经 SDS-PAGE 及 Tricine-SDS-PAGE 对纯化产物进行鉴定。利用 MTT 法、吖啶橙/溴化乙锭(AO/ EB)荧光染色法、小鼠 H22腹水转移型肝癌实体瘤抑瘤实验,研究30肽的抗肿瘤活性。结果成功重组并表达肿瘤抑素30肽。体外实验显示,30肽具有抑制 HGC-27胃癌细胞、 HUVEC 人脐静脉细胞增殖和促进这两种细胞凋亡的作用。体内实验显示,30肽对小鼠 H22腹水型肝癌抑瘤率达43.18 ％ 。结论重组的肿瘤抑素30肽具有较强的抗肿瘤活性。     

肿瘤抑素抗血管活性相关肽的表达及活性研究

目的利用大肠杆菌表达系统表达肿瘤抑素抗血管活性相关肽-21肽,检测其生物学活性。方法人工合成21肽基因序列(肿瘤抑素75～95位氨基酸),克隆到表达载体pTYB2上,转化大肠杆菌BL-21(DE_3),酶切和测序鉴定后,用IPTG诱导表达融合蛋白。经几丁质亲和层析柱纯化21肽。通过MTT实验,细胞生长曲线测定,小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验及组织病理学切片研究其活性。结果获得的可溶性21肽对人脐静脉内皮细胞的生长具有抑制作用。小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验抑瘤率达42.86%。组织病理学切片结果可见H22小鼠肝癌细胞死亡,血管数量减少。结论经初步检测获得具有抗血管活性的21肽,为进一步研究肿瘤抑素的作用机制和肿瘤的临床治疗奠定了基础。     

RGD肽在肿瘤诊断与治疗中的应用

RGD( Arg - Gly- Asp)肽存在于多种生物细胞外基质中,能特异性识别肿瘤细胞表面的整合素并与之结合,可作为体内RGD肽类物质的竞争性抑制剂,从而能抑制肿瘤细胞与细胞外基质的黏附与迁移、抑制肿瘤血管形成、诱导肿瘤细胞凋亡.RGD肽可以作为载体在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用,且在肿瘤显像及肿瘤治疗有潜在应用价值.该文主要介绍RGD肽在肿瘤显像中的应用、在肿瘤治疗中作为载体的应用、对肿瘤的直接抑制作用、在抗栓药物中的应用、对血小板功能的影响、诱导骨组织再生的应用研究与新进展.     

人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测

目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性。方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E．coli BL-21(DE3)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用;对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系;作用24h后,观察到细胞凋亡现象;与对照组相比,细胞凋亡数增加。结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础。     

肿瘤抑素T7肽及其衍生物T7-NGR载体构建及表达

目的为了提高作用靶向性，将导向肽NGR与肿瘤抑素L肽的C端连接，获得L肽及其衍生物T广NGR的载体。方法通过PCR和合成基因序列方法分别构建了肿瘤抑素L肽及T7-NGR的克隆载体pMD-T7和pMD-T7N，经酶切和测序鉴定后，将2种载体分别双酶切，经低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后，切下目的片段与酶切回收的质粒载体pET28a在低熔点琼脂糖中直接进行连接反应。阳性克隆经酶切和测序鉴定，转化感受态EcoliBL21（DE3），IPTG诱导表达。结果酶切和测序鉴定结果正确，分别成功构建表达载体pET-T7和pET-T，N，经IPTG诱导，完成了表达条件的优化。Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示．当IPTG浓度为1mmol/L时．25℃诱导8h．分别获得了T7肽和T7-NGR的表达产物。结论已经成功构建T，肽和T7-NGR的表达载体．获得了表达产物,为下一步的小肽活性实验奠定了基础。     

大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化

目的优化新一代重组人内皮抑素(rhED)的复性方案并检测其抗血管生成活性。方法用6 mol/L盐酸胍溶解rhED包涵体后,用稀释法与透析法相结合的方法进行复性,优化最适复性条件。复性结束后用阳离子交换层析纯化。并用rhED特异性单抗和鸡胚绒毛尿囊膜实验检测复性后蛋白的活性。结果通过优化复性条件,rhED的复性率可达到46%。复性、纯化后的rhED能与rhED特异性单抗反应,并在鸡胚绒毛尿囊膜实验中显示出抑制血管生长的活性。结论提高rhED复性率的复性条件可极大地促进新一代rhED的临床前及临床研究。     

人肿瘤转移抑制基因真核细胞表达质粒的构建

构建人肿瘤转移抑制基因ＮＭ２３－Ｈ１与真核表达载体ＰｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｒｏ的重组体。方法利用分子生物学克隆技术从质粒ｐｕｃ１８中酶切回收９００ｂｐ的人ＮＭ２３－Ｈ１基因片段,与ＰｃＤＮＡ３．１－Ｚｅｒｏ构成重组体,并根据表达载体与克隆基因核苷酸序列中酶切点分析、鉴定插入片段的正反连接。     

基因重组人肿瘤坏死因子的同时纯经及复性新工艺

目的 建立一套新的同时纯化和复性工艺,用于基因重组人肿瘤坏死因子－α（rhTNF-α)的纯化。方法 采用高效疏水作用色谱,直接表达（rhTNF-α)的大肠杆菌裂解液中纯化（rhTNF-α),并采用稀释法和透析法对上述样品进行复性研究。结果 高效疏水作用色谱在纯化（rhTNF-α)的同时,可获得高复性效率。同时,也使原来需要几步才能完成的操作,在疏水作用色谱上一次完成,大大简化了操作步骤。用SDS－PAGE和考马斯亮兰染色,对纯经的rhTNF－α进行分析和鉴定,其一步纯化的纯度达到95％以上,活性回收率分别较稀释法和透析法高2倍和3．5倍。结论 建立的纯化及同时复性的新工艺,具有简单、快速和纯度高的优点。     

RGD-蜘蛛拖丝蛋白聚合物的生物合成与纯化

蜘蛛拖丝是自然界性能最好的蛋白质纤维之一 ,其独特的机械性能 ,良好的生物相容性和缓慢的可降解性 ,作为生物材料在组织工程领域有着潜在的应用前景。本文根据蜘蛛拖丝蛋白序列高度重复的特点 ,引入与细胞黏附有关的精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 (RGD)三肽 ,化学合成RGD 蜘蛛拖丝蛋白基因单体 ,通过头尾相连倍加构建策略 ,首次得到RGD 蜘蛛拖丝蛋白基因 8聚体和 16聚体。分别将这两种多聚体与原核高效表达载体 pET 30a( )连接 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) pLysS ,用IPTG诱导表达。SDS PAGE图谱显示表达产物分子量分别为 35KD和 6 0KD ,与理论值基本相吻合 ;蛋白质印迹分析这两种表达产物均显示特异性。文中对表达产物的纯化方法进行了初步的摸索。     

重组人IL-2在E.coli中的高效表达诱导因素及其纯化的研究

表达人IL-2的E.coli pETI-2/MM294在色氨酸饥饿的培养基中发酵,加入一定量的3—吲哚乙酸诱导其trp启动子,可以使rlL-2的表达量高达总菌体蛋白量的19％。高水平表达的rlL-2以不溶性的包含体形式存在于E.coli的胞浆中。通过破碎细菌、变性抽提和使rlL-2复性后,再经CM-SephadexC-50、DEAE-SephadexA-50、SephadexG-75等一系列层析步骤纯化,最终得到的rlL-2纯度达90％以上,比活性为7.21×10~5μ/mg,总回收率为10.5％。     

人白细胞介素4的原核表达、复性、纯化及生物学活性鉴定

用PCR方法从pORF-hIL4质粒中扩增重组人白细胞介素4(hIL-4)的基因,构建PQE60原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达。对表达的目的蛋白的可溶性进行鉴定,发现hIL-4基因表达产物在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式存在,经过超声波破细菌、包涵体提取、洗涤处理后,用5mol/L盐酸胍变性溶解包涵体沉淀,上清稀释复性后透析,再经镍亲和层析进行纯化。纯化后的hIL-4进行TF-1细胞体外增生实验检测其生物学活性后,可用于人外周血树突状细胞的体外诱导培养。     

Adhesion Behavior of Human Adipo-Stromal Cells on Self-Assembled Monolayers with Different Surface Densities or Gradients of RGD Peptide

The objective of this study is to investigate the adhesion of human adipo-stromal cells on self-assembled monolayers (SAM) with different surface densities and gradients of Arg-Gly-Asp (RGD) peptide. The different densities and gradients of carboxyl groups on the SAM surface were prepared by a SAM exchange technique, and then RGD was chemically immobilized to allow the RGD surface density on the SAM to change over the range of 2.3–8.9 ng/cm² (3.0–12 pmol/cm²). The spreading area and survival percent of cells increased as the density of RGD immobilized on the SAM became high, whereas no dependence of the RGD density on the number of cells adhered was observed. The survival percent of cells tended to increase with an increase in the RGD immobilization for the carboxyl group-gradient SAM. This finding suggests the possibility that the cell adhesion can be regulated by controlling the RGD density or gradient of cell substrate.     

重组人胰岛素的制备--下游纯化工艺的研究

建立了一套通过大肠杆菌表达 (His) 6 - Arg- Arg-人胰岛素原 [(His) 6 - Arg- Arg- human proinsulin,RRh PI]制备重组人胰岛素的工艺。将大肠杆菌中以包涵体形式表达的 RRh PI依次经过 DEAE-琼脂糖快流速阴离子交换层析 ,Sephadex G- 2 5层析 ,重组复性酶切转化和 Superdex75分子筛 ,制备重组人胰岛素。 SDS- PAGE、HPL C、氨基酸组成分析和小鼠惊厥实验结果证明 ,制备的重组人胰岛素具有天然生物活性 ,而且纯度较高。     

人脐静脉内皮细胞在RGD肽聚酯材料表面的黏附稳定性研究

研究RGD肽对内皮细胞(Endothelialcell,EC)在生物材料表面黏附稳定性的影响。实验材料(聚酯)分为三组:RGD组(表面共价接枝人工合成的RGD三肽)、对照组(表面预衬纤维粘连蛋白)和空白组(表面未作任何处理),然后在三组材料表面种植体外培养的人脐静脉内皮细胞,并在定常流条件下观察比较RGD肽和纤维粘连蛋白对材料表面细胞黏附稳定性的影响。结果显示随着剪切力作用时间延长和剪切力加大,三组材料表面黏附的细胞脱落逐渐增多。空白组PET表面细胞脱落最为明显,8.19dyne/cm2作用4h后,材料表面细胞残留率仅为13.73%。PET表面结合RGD或纤维粘连蛋白后,细胞残留率明显增加,同样剪切力作用下细胞残留率分别为43.33%和40.75%,两组之间无显著性差异。由此得出结论,RGD可以提高EC在材料表面的黏附稳定性。本结果仅是一个体外实验的初步结果,需要进一步的体内实验加以证实。     

小鼠B细胞趋化因子原核表达与纯化

用多聚酶链反应 (PCR)扩增小鼠 B细胞趋化因子 (BL C)基因片断并导入 Bam H1和 Pst1两个酶切位点 ,插入到原核表达载体 PQE30中 ,构建重组质粒 p BL C- PQE30 ,并诱导相对分子量为 10 Kda的重组目的蛋白r BL C的表达 ,通过 Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。双酶切和测序分析显示小鼠 B细胞趋化因子片断正确插入原核表达载体 PQE30中 ,重组蛋白 Western blot分析显示出特异性条带。提示已通过基因工程方法获得并纯化了小鼠B细胞趋化因子重组蛋白。