小鼠载脂蛋白CⅡ编码基因的克隆

目的：克隆小鼠载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）编码序列。方法：采用逆转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法扩增获得ApoCⅡ编码序列，将ApoCⅡ基因编码片段重组入质粒pUC18，得到重组克隆载体pUCl8-ApoCⅡ，进行序列测定。结果：经测序证实重组质粒pUC18-ApoCⅡ中的ApoCⅡ编码片段的序列与GenBank中的一致。结论：成功构建了含编码小鼠ApoCⅡ基因的重组克隆载体pUC18-ApoCⅡ，为基因工程生产有生物活性的ApoCⅡ、开展ApoCⅡ的免疫学测定及进一步探讨ApoCⅡ治疗高甘油三酯血症的可能性奠定了基础。     

小鼠H—2D^d基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的：构建BALB／c小鼠H－2D^d基因的逆转录病毒表达载体。方法：采用反转录PCR从BALB／c小鼠脾细胞基因组中，扩增H－2D^d的编码基因，插入克隆载体pGEM-T中。经EcoR I和Xho I双酶切后，亚克隆法于逆转录病毒载体pMSCV的相应酶切位点，构建pMSCV-H2D^d重组表达质粒，并经双酶切和序列测定鉴定。结果：用EcoR I和Xho I双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pMSCV。克隆H－2D^d的编码基因经序列测定证实，与献报道完全一致。结论：成功构建小鼠H－2D^d编码基因的逆转录病毒载体，为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用及临床移植的基因治疗应用奠定了基础。     

小鼠脂肪组织脂联素基因编码区的克隆及序列分析

目的：克隆小鼠脂肪组织脂联素（ACRP30）编码区基因并进行序列分析。方法：用TRIzol试剂从小鼠脂肪组织提取总RNA，经RT-CR方法扩增全长的ACRP30 cDNA片段，将PCR产物克隆于pGEM-T载体，对重组质粒pGEM-ACRP30进行序列验证。结果：小鼠脂肪组织ACRP30基因编码序列不同于来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列．IRM-2（Institute of Radimion Medicine-2）小鼠和C57BL／6J小鼠脂肪组织的ACRP30基因编码序列相同。337位点上的碱基A被G置换导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代。来自脂肪组织的ACR30基因编码序列已被提交到GenBank^TM数据库。C57BL／6J小鼠的收录编号为AY749429。IRM-2小鼠为AY754346。结论：小鼠脂肪组织ACRP30编码序列是ACRP30序列的新成员，cDNA克隆的构建为进一步的蛋白表达和生物学活性研究奠定了基础。     

CD8a＋DC新基因的克隆，功能鉴定与药物研发

目的：分离小鼠脾脏CD8α＋树突状免疫细胞（LDC）的特异基因,了解这些基因与抗原递逞功能的哭系。找到LDC的特异表面标志和特异功能基因。利用LDC特异基因产物作为自身免疫疾病、病毒性疾病和肿瘤的免疫治疗手段,从中筛选出有效的候选药物。方法：从60只小鼠脾脏LDC中纯化出10ug左右的总RNA,以对应的MDC细胞RNA为对照,采用减数抑制杂交法（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）建立了特异性针对LDC的减数cDNA文库。从该文库中克隆了100多个序列,从中筛选出LDC特异的14个基因,用半定量PCR证实这些基因在LDC中高表达,而在MDC中则表达较低。体外实验采用DC细胞系DC2．4来验证从LDC文库中分离的基因能够在该细胞系表达。21个序列的RT-PCR结果阳性。为了解基因在DC中的作用,选择了12个基因进行RNA干扰实验。设计出特异的siRNA,插入到载体pSilencer1．0内,转化后酶切鉴定并测序,然后将siRNA质粒分别电转化到DC2．4细胞,经G418持续筛选,再用稀释法挑单克隆培养,每个基因最少挑6个以上的单克隆细胞扩大培养。最后用RT-PCR和实时PCR鉴定6个克隆的基因抑制率。挑选抑制率在80--90％以上的siRNA亚克隆细胞系进行基因功能鉴定。功能鉴定采用的是抗原递逞实验,将siRNA亚克隆细胞,DC2．4细胞和空质粒转化的DC2．4细胞分别与OVA可溶性抗原,吸附在乳胶颗粒表面的OVA抗原,乳胶颗粒和空白对照等培养过夜,用针对OVA抗原的25D1．16等单抗标记细胞,用流式细胞仪检测DC细胞表面的OVA抗原等。体内功能实验方法是,将这些克隆与病毒培养后,输入小鼠体内,用流式细胞仪检测受DC递逞的病毒抗原刺激后小鼠T细胞产生1,干扰素的能力。结果：基因14、79、94等的siRNA亚克隆细胞的25D1．16的表达明显低于对照细胞（P〈0．01）。基因14等的siRNA亚细胞克隆刺激小鼠T细胞产生干扰素的能力显著降低（P〈0．01）。结论：基因14、79、94等和LDC的抗原递逞功能密切有关,使用这些基因的siRNA可以降低LDC的免疫功能,具有免疫治疗功效,是良好的治疗自身免疫耐受,减少移植物免疫排斥的候选药物。相反,运用这些基因和其产物可以提高细胞免疫功能,对肿瘤治疗具有价值。     

用mRNA差异显示技术筛选和克隆小鼠海马有关基因

目的　建立筛选和克隆小鼠海马有关基因的方法。方法　采用mRNA差异显示技术筛选和克隆了快速老化模型小鼠 (SAM )海马内有关基因。结果　采用mRNA差异显示技术从SAM海马内筛选和克隆了 6个基因片段 (W1～W 6 ) ;该方法的主要优点在于可同时比较两组以上的样品 ,具有灵敏度高、简便快速等特点 ,尤适合于寻找和克隆微量样品和表达水平较低的基因。结论　mRNA差异显示技术是一种较好的筛选和克隆小鼠海马有关基因的方法。     

编码一种产黄支顶孢霉的头孢菌素C乙酰水解酶基因cahB的克隆和鉴定

利用产黄支顶孢霉 (Acremonium chrycogenum)生产头孢菌素 C时的一个重要问题是头孢菌素 C水解成脱乙酰头孢菌素 C,后者没有商业价值而成为一种无用的副产品。对于产生脱乙酰头孢菌素 C的酶学过程的特性研究将有助于避免这种副产品的积累。将一种来源于 A.chrycogenum C10的胞外头孢菌素 C乙酰水解酶 (CPC- AH)纯化至接近均一 ,该酶的分子量为 31k Da,等电点为 4.0 ,对头孢菌素 C的亲和力较低 (Km 为 33.7mm ol/L)。对该酶氨基末端的 2 0个氨基酸测序 ,基于该序列的探针用于头孢菌素乙酰水解酶基因(cah B)的克隆。 cah B编码 383个…     

SEN—V非编码区基因的克隆与序列分析

目的：调查TTV阴性的非甲-庚型肝炎患者中SEN-V感染情况。对SEN-V5非编码区部分基因进行克隆与序列分析。方法：采用巢式PCR技术检测40例TTV阴性的非甲-庚型肝炎患者血清SEN-VDNA，对PCR产物进行克隆，测序和分析。结果：40例病例中SEN-VDNA阳性38例（92%），对其中6株SEN-V基因克隆测序，并与基因库中的SEN-V（GenbankNo.AX025677)序列比较，其核苷酸序列同源性在81%-94%。结论：在TTV阴性的非甲-庚型肝炎患者中存在SEN-V感染。SEN-V的致病性及其与非甲-庚型肝炎的关系有待进一步研究。     

E2F1基因真核表达载体的构建及其对CD2 AP启动子的影响

目的构建E2F1基因真核表达质粒,并初步探讨E2F1对CD2相关蛋白(CD2AP)启动子的作用。方法 RT-PCR扩增E2F1基因,构建含E2F1基因的重组真核表达质粒,重组质粒转染人胚肾HEK-293细胞。Western blot检测E2F1蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测E2F1过表达后人CD2AP启动子的活性。结果核酸序列分析及Western blot结果证实,成功构建含E2F1基因的重组真核表达质粒;过表达E2F1能增强CD2AP启动子的活性。结论 E2F1编码基因在HEK-293细胞中获得正确表达,且E2F1蛋白可促进人CD2AP启动子的转录活性。     

Induction of gene mutations in germ cells of the mouse

Methods available to study the induction of gene mutations in mammalian germ cells are described. Results of specific locus experiments with mice indicate the importance of this test for the validation of short term tests. Out of 5 compounds studied extensively in the Environmental Research Programme of the Commission of the European Communities 2 induced mutations in the Salmonella typhimurium test and in the specific locus test, while 2 others induced mutations only in mammals. In contrast to radiation, chemical mutagens can express mutations in certain gametogenic stages only. The different gametogenic sensitivity of mammalian germ cells to chemical mutagens gives a clue for the evaluation of mutagenicity data. In the linear part of the dose-effect-curve fractionation of a dose of 600 mg/kg procarbazine reduced the yield of specific locus mutations. In the descending part of the dose-effect-curve fractionation of a dose increased the rate of specific locus mutations above the single total dose. Experiments with procarbazine indicate that oocytes are less sensitive than spermatogonia for the induction of specific locus mutations. The genetic risk is defined as the increase in percent of the spontaneous mutation rate. The genetic risk can be calculated with high confidence on the basis of relatively few animals in the experimental group. The ratio between the therapeutic dose and the doubling dose gives the percentage increase of the spontaneous mutation frequency of a patient (individual risk). The ratio between the population dose and the doubling dose gives the percentage increase of the spontaneous mutation frequency of a population (population risk). The quantification of the genetic risk of the first generation is possible on the basis of dominant cataract mutations in mice. All extrapolations are based on the assumption that man and mice are equally sensitive to the induction of gene mutations.

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Zusammenfassung Es werden die Methoden zur Erfassung von Genmutationen in den Keimzellen von Säugetieren beschrieben. Die Ergebnisse von Versuchen mit Mäusen, die mit der spezifischen Lokusmethode erhalten werden, sind wichtig für die kritische Beurteilung der Aussagefähigkeit einfacher Testsysteme. Von 5 Verbindungen, die besonders eingehend im Rahmen des Umweltprogrammes der Kommission der Europäischen Gemeinschaften getestet werden, induzieren 2 Verbindungen Mutationen sowohl im Salmonella typhimurium Test als auch im spezifischen Lokustest und 2 weitere Verbindungen nur Mutationen in Säugern. Im Gegensatz zur Strahlung, können sich nach Behandlung mit chemischen Mutagenen Mutationen nur in bestimmten Keimzellstadien manifestieren. Die unterschiedliche Empfindlichkeit der Keimzellen von Säugern ist ein wichtiger Anhalt für die Bewertung von Mutagenitätsdaten. Im linearen Teil der Dosis-Effekt-Kurve von Procarbazin führt die Fraktionierung einer Dosis von 600 mg/kg zur Abnahme der Häufigkeit spezifischer Lokusmutationen. Im abfallenden Teil der Dosis-Effekt-Kurve werden nach Fraktionierung der Dosis mehr spezifische Lokusmutationen beobachtet als nach Gabe einer entsprechenden Einzeldosis. Die Experimente mit Procarbazin ergeben, daß die Oozyten weniger empfindlich sind für die Induktion von spezifischen Lokusmutationen als die Spermatogonien. Das genetische Risiko ist definiert als prozentuale Steigerung der spontanen Mutationsrate. Die Berechnung des genetischen Risikos kann mit hoher Zuverlässigkeit aufgrund von Versuchsergebnissen mit relativ wenigen Nachkommen behandelter Tiere durchgeführt werden. Das Verhältnis von therapeutischer Dosis zur Verdoppelungsdosis ergibt die prozentuale Steigerung der spontanen Mutationshäufigkeit des Patienten (Individualrisiko). Das Verhältnis von Populationsdosis zur Verdoppelungsdosis ergibt die prozentuale Steigerung der spontanen Mutationshäufigkeit der Bevölkerung (Populationsrisiko). Die Quantifizierung des genetischen Risikos ist auf der Grundlage der dominanten Kataraktmutationen bei Mäusen möglich. Alle Extrapolationen gehen von der Annahme aus, daß der Mensch und die Maus für die Induktion von Genmutationen gleich empfindlich sind.

     

rhBMP-2m对辐射小鼠骨髓CD34~+细胞变化的影响

目的　探讨小鼠受到辐射后 ,重组人骨形成蛋白成熟肽 2 (rhBMP 2m)对骨髓CD34+ 细胞变化的影响。方法　通过60 Coγ射线照射 ,建立小鼠骨髓造血损伤模型 ,经rhBMP 2m连续治疗后 ,骨髓单个核细胞计数 ,通过流式细胞仪检测骨髓单个核细胞中CD34+ 细胞比例 ,比较对照组和治疗组之间的差别。结果　经rhBMP 2m治疗的动物 ,单个核细胞数和CD34+ 细胞比例均明显高于照射对照组 ,P <0 0 5 ,n=6。结论　对于辐射引起的小鼠骨髓造血损伤 ,rhBMP 2m能够增加造血细胞数量 ,提高骨髓单个核细胞中CD34+ 细胞的比例 ,加快骨髓造血系统的重建。     

胃癌组织KAI1/CD82、MRP1/CD9的表达及临床意义

目的探讨胃癌组织中KAI1/CD82、MRP1/CD9的表达及临床意义。方法应用免疫组化SABC法检测63例胃癌组织中KAI1/CD82、MRP1/CD9的表达,分析其与临床病理特征的关系。结果胃癌组织KAI1/CD82的阳性表达率为63.5%(40/63)、MRP1/CD9的阳性表达率为46.0%(29/63)。KAI1/CD82的表达与淋巴结转移、肿瘤分级、癌组织大小显著相关(P<0.05)。MRP1/CD9的表达与淋巴结转移、肿瘤分级显著相关(P<0.05或P<0.01)。结论 KAI1/CD82和MRP1/CD9可作为评估胃癌预后的指标。     

鼠抗人多聚体蛋白聚糖单克隆抗体对骨髓瘤细胞株生长的抑制作用

目的研究多聚体蛋白聚糖(syndecan-1,CD138)单克隆抗体(mAb)4B3对天然表达syndecan-1的人多发性骨髓瘤(MM)细胞XC-1和XG-2的生物学效应。方法采用间接免疫荧光标记和流式细胞术分析,通过4B3mAb观察XC-1和XC-2细胞膜上syndecan-1荧光标记阳性率;按常规培养方式对XC-1、XG-2进行细胞培养和台盼蓝染色记数,观察不同浓度的4B3mAb对XC-1和XG-2细胞体外生长作用。结果4B3mAb能识别XG-1和XG-2细胞表达的syndecan-1分子,表达率与商品化的鼠抗人syndecan-1 mAb(BB4)相似;同时,4133mAb与XG-1和XG-2细胞膜上syndecan-1荧光标记阳性率基本一致,反应均呈强阳性;加入不同浓度的4B3mAb,XC-1细胞数量2d后开始下降,而XG-2细胞3d后数量出现减少。结论4B3mAb抗体对XC-1和XG-2均具有明显的生长抑制作用,但XG-2细胞的生长抑制作用早于XC-1,可为MM的生物治疗提供新途径。     

吉林松原地区CD36基因单体型与2型糖尿病的相关性研究

目的对吉林松原郭尔罗斯自治县蒙古族和汉族人群中2型糖尿病（T2MD）患者CD36内含子3（intron3）[TG]重复序列基因多态性分布情况进行研究,探讨该基因多态性与2型糖尿病的相关性。方法应用PCR和直接测序法对40例正常组和193例2型糖尿病患者CD36内含子3[TG]重复序列基因多态性进行分析。结果①CD36内含子3[TG]重复序列有5种单体型,即[TG]重复次数为11、12、13、15、16次。②正常组与2型糖尿病患者之间CD36内含子3[TG]重复序列各种单体型及基因型分布差异无统计学意义（P〉0．05）。③蒙古族与汉族之间CD36内含子3[TG]重复序列各种单体型及基因型分布差异无统计学意义（P〉0．05）。④CD36内含子3[TG]重复序列13次的单体型及基因型在蒙古族人群中正常组与2型糖尿病患者之间分布差异具有统计学意义（P〈O．05）。结论CD36内含子3[TG]重复次数13次的单体型是松原蒙古族发生2型糖尿病的危险基因。