反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变，并评价其临床应用价值。方法应用PCR-反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测，所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较。结果62株对利福平耐药的菌株中，54株碱基突变被准确鉴定，灵敏度为87．1％(54／62)，阳性预测值为100％；40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定，特异性为100％，阴性预测值为83．3％(40／48)；准确度为92．2％(94／102)。与测序法结果符合率为99％。结论以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高，无假阳性结果，因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛。     

聚合酶链反应－冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变

目的评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核分支杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应－冷单链构象多态性（ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ）方法对８７株结核分支杆菌临床分离株及有药敏结果的２２份相应肺结核患者痰标本进行分析。结果ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因的敏感性为１００ｐｇＤＮＡ及５０００个菌体，属于分支杆菌特异。所有分离菌的ｒｐｏＢ基因ＰＣＲ扩增均为阳性。采用套式ＰＣＲ可使扩增敏感性提高１００倍。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ对８７株结核分支杆菌临床分离菌利福平耐药性的检测敏感性和特异性分别为８９．６％及１００％。２２份涂阳培阳痰标本中套式ＰＣＲ扩增阳性的６份均为高度利福平耐药，其ＳＳＣＰ结果也与相应分离株的药物敏感性试验相符。结论ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变快速、简便、易行，适用于结核分支杆菌分离株利福平耐药性的快速测定。如进一步提高引物增特异性及敏感性，该技术可望用于临床标本直接检测     

PCR—SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌ｒｐｏＢ基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照、５０例耐ＲＦＰ（单耐和多耐）结核分枝杆菌临床分离株、１２例ＲＦＰ敏感菌株、３５例耐ＲＦＰ肺结核患者痰标本,采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测痰标本和菌株中结核杆菌ｒｐｏＢ基因突变。结果 ５０例耐ＲＦＰ菌株中有４５例ＰＣＲ－ＳＳＣＰ条带与     

应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术检测痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变,探索其临床应用价值.方法 以结核分枝杆菌标准株H37Rv为对照,应用套式PCR扩增目的基因,并使用SSCP技术直接检测100例耐药患者和10例敏感患者痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变并进行基因测序,将SSCP结果及测序结果与细菌培养药敏结果进行比较分析.结果 PCR-SSCP直接检测痰样本中的结核分枝杆菌katG基因突变的敏感性和特异性分别是55.9%和70.0%,rpoB为76.0%和90.0%,embB为46.4%和60.0%.结论 PCR-SSCP操作快速、简单,敏感性和特异性较高,可用来直接检测临床痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变.     

结核分枝杆菌rpoB基因突变特征的初步探讨

目的 了解浙江省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征.方法 对65株临床分离菌株rpoB基因509-631位点分别进行PCR-SSCP检测和DNA序列测定,观察不同耐药株rpoB基因突变的规律.结果 耐利福平分离株96.4%（27/28）存在rpoB基因突变,其中526位突变率64.3%（18/28）,513位突变率21.4%（6/28）,531位突变率7.1%（2/28）,529位突变率3.6%（1/28）;耐其他抗结核药18.5%（5/27）存在rpoB基因突变,突变位点具有随机性.所有敏感菌株均无突变.结论 rpoB基因突变与利福平耐药密切相关,浙江省rpoB基因突变主要以526位突变为主,其次为513位,两者占总数的86%（24/28）,而耐其他抗结核药菌株也存在rpoB基因的突变,但没有明显规律,且均对利福平敏感.     

应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究

目的应用PCR-SSCP技术检测痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变,探索其临床应用价值。方法以结核分枝杆菌标准株H₃₇R_V为对照,应用套式PCR扩增目的基因,并使用SSCP技术直接检测100例耐药患者和10例敏感患者痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变并进行基因测序,将SSCP结果及测序结果与细菌培养药敏结果进行比较分析。结果PCR-SSCP直接检测痰样本中的结核分枝杆菌katG基因突变的敏感性和特异性分别是55.9%和70.0%,rpoB为76.0%和90.0%,embB为46.4%和60.0%。结论PCR-SSCP操作快速、简单,敏感性和特异性较高,可用来直接检测临床痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变。     

诱导结核分枝杆菌耐katG基因突变过程的分析

目的 在体外建立诱导结核分枝杆菌耐异烟肼药物产生的全过程,分析结核分枝杆菌产生耐药的机理.方法 对结核分枝杆菌强毒株(H37RV)进行诱导试验,与30株临床耐异烟肼药物分离株共同做聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和序列分析.结果 在第7代H37RV的PCR-SSCP电泳出现异常,经测序证实发生kat...     

山东省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的　分析山东省利福平耐药结核菌株rpoB基因突变特点。方法 本研究为回顾性调查,135株样本分别取自1997、2000及2003年的流行病学调查和医院的临床样本。采用PCR直接基因测序法分析rpoB基因突变。结果 135株结核菌中,60株为利福平耐药菌株,其中55株(91.7%)rpoB基因的利福平耐药决定区(RRDR)有突变。突变频率依次为密码子531(60.0%),526(29.1%)和516(7.3%)。1株耐药菌同时发生了少见的3个密码子(511,515,518)的多核苷酸突变。75株敏感菌株中,仅3株(4.0%)有突变,均发生在密码子533,包括一个新发现的突变基因型CTG(Leu)→ATG(Met)。结论 来自山东省结核菌中,利福平耐药表型与rpoB基因突变的符合率为94.1%,并提示密码子533突变与利福平耐药表型相关性较低。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变特征的初步探讨

目的了解浙江省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征。方法对65株临床分离菌株rpoB基因509-631位点分别进行PCR-SSCP检测和DNA序列测定,观察不同耐药株rpoB基因突变的规律。结果耐利福平分离株96.4%(27/28)存在rpoB基因突变,其中526位突变率64.3%(18/28),513位突变率21.4%(6/28),531位突变率7.1%(2/28),529位突变率3.6%(1/28);耐其他抗结核药18.5%(5/27)存在rpoB基因突变,突变位点具有随机性。所有敏感菌株均无突变。结论rpoB基因突变与利福平耐药密切相关,浙江省rpoB基因突变主要以526位突变为主,其次为513位,两者占总数的86%(24/28),而耐其他抗结核药菌株也存在rpoB基因的突变,但没有明显规律,且均对利福平敏感。     

应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的　研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。方法　根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果　 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpoB基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论　用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（Rifampicin Resistance Determining Region，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，531TCG和531TTG），应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较，部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中，其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份肺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株，其中利福平耐药株48份，荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变，3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区(Rifampicin Resistance Determining Region,RRDR)526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针(526CAC,526TAC,531TCG和531TTG),应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而,应用该技术检测84份肺结核病例痰标本,与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较,部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中,其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100%。在84份肺结核病例的痰标本中,罗氏培养阳性62株,其中利福平耐药株48份,荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例,526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中,荧光定量PCR检测43株为531TTG突变,3株为526TAC突变,另2株利福平耐药株,经测序证实,1株514密码子TTC插入突变,1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变,并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

结核分枝杆菌耐喹诺酮临床分离株gyrA基因突变的研究

目的　了解结核分枝杆菌喹诺酮 (quinolones)耐药株耐药基因突变情况,评价其应用价值。方法 通过 16SrRNA聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分析 77株分枝杆菌临床分离株;通过PCR SSCP和直接测序技术分析结核分枝杆菌的gyrA基因突变的情况。 结果 75株为结核分枝杆菌复合群。 30株喹诺酮敏感株的 gyrA基因的SSCP图谱中,11株与H₃₇R_v相同,19株与卡介苗相同;与卡介苗 gyrA基因的SSCP图谱相同的敏感株 95位密码子为ACC,与H₃₇R_v该图谱相同的敏感株 95位密码子为AGC。 45株喹诺酮耐药株中,34株 (75.6%) gyrA基因SSCP图谱泳动异常,对 25株泳动异常、出现频率较高耐药株测序证实 15株 (44.1%)为 94位密码子GAC→GGC突变;10株 (29.4%)为 90位密码子GCG→GTG的突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与 gyrA基因突变有关,PCR SSCP可能成为测定结核分枝杆菌耐喹诺酮类药基因型的快速、简便的方法。     

AmpliSensor-聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌及临床应用

目的探讨Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ－聚合酶链反应（ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ）在结核病诊断中的价值。方法采用ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ对７８４例结核病患者及１６０例肺癌患者的标本进行检测，并与ＰＣＲ（凝胶电泳后，经溴化乙锭染色）、涂片、培养等法比较。结果ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ的敏感性显著高于涂片及培养（Ｐ＜０．０１）。特异性较ＰＣＲ法高。结论ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ可以通过标准曲线划定检出下限，并可换算出标本中原始的靶ＤＮＡ值，同时具有较高的特异性和敏感性，对肺结核尤其是肺外结核的诊断有一定的临床意义。     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的 为了阐明中国结核分支杆菌耐利福平析rpoB基因突变特点。方法 对242株结核分支杆菌临床分离包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中耐利福平株193株,利福平敏感株46株,人工诱导的耐利福平株3株。结果 89．1％（172．193）的临床分离耐药株存在rpoB基因突变,而46株敏感株无突变。531位氨基酸突变率为46．1％;526位氨基酸突变率为17．1％;联合突变发生率为12．4％;还有4株细菌发生同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论 中国结核分支杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸,两者突变率之和约为63％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组;受度蓖株未发现搬运入或缺失突变;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

结核分支杆菌rpoB基因克隆与酶谱分析

目的克隆结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因。方法以结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因保守区的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增片段为探针从已建立的结核分支杆菌基因文库中筛选ｒｐｏＢ基因。结果引物ＴＲ１、ＴＲ２ｂ扩增Ｈ３７ＲａＤＮＡ获１约４１１ｂｐ片段。经克隆及序列分析表明该片段与结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因中央区域的序列同源。对约１２０００个克隆进行筛选，共获７个可疑阳性克隆，经过再次杂交证实其中３个克隆为阳性。其中１个克隆携带约３．８ｋｂ插入片段。一系列内切酶酶切分析后得出该３．８ｋｂ克隆片段的部分限制性内切酶酶谱。进一步分析表明所用４１１ｂｐ探针同源序列距两端分别为１ｋｂ和２．８ｋｂ。结论与报道的结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因开放阅读框架比较，我们克隆的３．８ｋｂ片段包含结核分支杆菌ｒｐｏＢ完整基因的大部分，为进一步研究利福平及其它利福霉素类药物抗结核作用方式及耐药机制奠定了基础