2a型HCV E1、E2/NS1区基因cDNA的克隆及序列分析

目的：了解丙型肝炎病毒（HCV）2a型基因组E1 E2／NS1区序列，为进一步研究HCV包膜蛋白的生物学功能奠定基础。方法：用逆转录套式PCR（RT－nPCR)从江苏省1例丙型肝炎患者血清中扩增出两条分别约770bp、1100bp的片段，分别以限制性内切酶EcoR I、BamH I和EcoR I、Hand Ⅲ双酶切后连入pUC19载体中，转化感受态细胞，经限制性酶切长度多态性分析（RFLP）和PCR法证实为阳性克隆后，用全自动序列分析仪测序。结果：分别测得约770bp、1100bp的核苷酸序列，拼接后得到的完整核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别与HCV－1、HC－C2、HCV－BK、HC－J6、HC－J8相应序列作比较，显示分离株HCV在核苷酸水平上与以上分离株的同源性分别为60．5％、60．1％、59．7％、87．8％、67．5％；在氨基酸水平上的同源性分别为67．3％、66．4％、65．0％、87．8％、79．0％。结论：分离株（HCV－JS）与HC－J6同属2a型，但同源性有一定差异。     

5株呼吸道合胞病毒地方株F蛋白基因序列分析

目的呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ｆ蛋白是ＲＳＶ感染免疫中最重要的病毒蛋白，为了解我国ＲＳＶ地方株Ｆ蛋白的基因状况和变异特征，随机选取北京、广州、长春和河北四个地区具有不同流行特征的ＲＳＶ地方株（Ａ亚型）５株，进行ＲＳＶＦ蛋白全基因的核苷酸序列分析。方法以提取的病毒ｍＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增、目的基因的克隆及序列测定，对地方株及原型株的序列进行比较分析。结果地方株Ｆ蛋白基因与原型株Ａ２株有很高的同源性，核苷酸全序列的同源性为９５．１％～９６．１％，氨基酸同源性为９６．７％～９７．４％。核苷酸有义突变率为２２．６％～２５．９％。３非编码区的核苷酸序列比蛋白编码区变异显著。河北地方株（Ｅ７３株）在３非编码区有６个核苷酸的插入。Ｆ２亚单位的氨基酸变异高于Ｆ１亚单位。在北京地方株（ＺＨＳ１３株）Ｆ１亚单位内，由具有中和能力单克隆抗体所识别的抗原表位区中存在一个氨基酸的变异。结论我国ＲＳＶ地方株与原型株之间的Ｆ蛋白基因尽管存在一定的变异，但仍有很高的同源性。地方株间Ｆ蛋白的核苷酸、氨基酸变异的位置及形式很相似，提示我国ＲＳＶ的不同流行特征可能并非由于Ｆ蛋白的基因变异所致。     

我国部分地区呼吸道合胞病毒地方株磷蛋白基因序列分析

目的 了解我国呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）地方株的Ｐ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｐｒｏｔｅｉｎ,Ｐ）蛋白基因状况和变异特征。方法 选取不同地区具有不同流行特征的６株ＲＳＶ地方株,以提取的病毒ｍＲＮＡ为模板进行逆转录－聚合酶链扩增（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增、目的基因的克隆及序列测定分析。结果 地方株和同亚型原型株之间Ｐ蛋白核苷酸序列及推导出的氨基酸序列同源性均超过９５％;不同亚型间存在较大差异,核苷酸全序列同源性低于８５％,尤其在３′端非编码区及中间变异区。由氨基酸序列推导出的疏水性分析图显示,Ａ、Ｂ亚型中间变异区存在疏水性的不同,这为解释Ａ、Ｂ亚型间Ｐ蛋白电泳迁移率的不同提供了一种可能。结论 我国ＲＳＶ地方株与原型株之间的Ｐ蛋白无论在核苷酸水平还是在氨基酸水平均存在一定的变异。这些结果对于了解我国ＲＳＶ地方株的基因状况提供了有益的     

西安地区一株TT病毒的基因克隆及序列分析

目的 对TTV阳性扩增产物进行克隆及测序，以了解西安地区TTV基因及基因结构的特点。方法 采用巢式PCR从转氨酶活性异常增高的患者血清中，得到TTV阳性扩增产物，将其插入pGEM-T easy载体，进行克隆及序列分析。结果 获得1个pGEM-TTV重组载体。序列分析表明，插入片段为196bp。该序列与AF065400株等对应位置的核苷酸同源性分别为：AF065400（中国株）94．9％、AF351132（中国株）98．0％和NC－002076（日本株）99．0％。结论 西安地区TTV阳性扩增序列与报道的AF065400株、AF351132株和NC－002076株的序列具有高度的同源性，属同个基因型别。     

北京地区2000-2004年分离的呼吸道合胞病毒B亚型株G蛋白基因的序列分析

目的 了解近年来北京地区流行的B亚型呼吸道合胞病毒（BSV）G蛋白的基因特征。方法 2000年冬季至2004年冬季自首都儿科研究所附属儿童医院收集的急性呼吸道感染患儿呼吸道标本，从中分离到B亚型RSV毒株，每年随机选取1至2株毒株，用RT-PCR扩增其G蛋白全基因后克隆至pBS-T载体中，筛选出阳性克隆后测序，并与B亚型标准株（CH18537）和文献报道的毒株序列进行比较分析。结果 所测毒株G蛋白全基因核苷酸长度分别为915、921和981bp，推导的氨基酸长度分别为292、293、312和315从。分离株与B亚型标准株CH18537间存在着明显的差异，CH18537株同分离株间的核苷酸的同源性为91．9％～93．7％，氨基酸的同源性只有85．0％～89．0％。分离株间核苷酸的同源性为93．4％～98．8％，氨基酸的同源性为88．2％～98．6％。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端，而胞内区和跨膜区相对保守。此外，在进行G蛋白基因分析的8株B亚型分离毒株中，我们发现有3株BSVG蛋白在490～495位核苷酸缺失，3株RSVG蛋白在c末端791位后出现了60个核苷酸的插入，导致C末端259位后出现20个氨基酸的插入。这60个核苷酸与相邻的前60个核苷酸高度重复，只出现3至4个核苷酸的差异。该3株分离株与文献报道的有60个核苷酸插入的两株（S00-4和BA4128／99B）核苷酸和氨基酸同源性分别为97．5％～98．6％和95．5～98．1％，在插入的20个氨基酸中，有高达50％（9～10个氨基酸）左右的丝氨酸和苏氨酸氧连接的糖基化位点。结论 RSVB亚型G蛋白基因变异存在着多样性，分离株既有核苷酸替代，又有基因缺失和插入，还有糖基化位点的改变和氨基酸长度的改变。这种变异使G蛋白高度糖基化，提示最终可能导致病毒抗原性的改变。北京分离的有60个核苷酸插入的变异株与日本及西班牙报道的变异株有非常近的亲缘关系，提示这种G蛋白基因中有60个核苷酸插入的B亚型变异株已经在子代病毒中形成稳定遗传并在世界范围内传播。     

牛IL-18基因的克隆及遗传进化分析

目的：克隆牛白细胞介素18（IL-18）全基因，并对其进行序列分析。方法：从ConA刺激培养的牛外周血淋巴细胞提取总RNA，利用巢式RT-PCR方法扩增出牛IL-18全长cDNA，将其克隆到pMDl8-T载体上，测序后进行序列分析。结果：成功地克隆到了牛IL-18全基因，序列分析表明，实验中所克隆到的牛IL-18序列与GeneBank所登录的牛IL-18核苷酸序列及其推导氨酸序列同源性分别是99．5％和99％。与人、猕猴、野猪、山羊属、马等核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别在84．9％-99．5％和74．9％～99％之间，研究结果在国内还未见报道。结论：成功地从牛外周血中克隆到了牛IL-18的基因，其全长为598bp。     

湖北地区119例 HCV 1b 型 NS3丝氨酸蛋白酶区的序列变异研究

目的：分析丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)1b 型非结构蛋白3(non-structure protein 3, NS3)丝氨酸蛋白酶区序列的变异规律及影响意义。方法使用基因型别特异性引物,通过巢式 PCR 的方法扩增119例慢性 HCV 1b 型患者血清中 HCV NS3区。对 PCR 产物进行测序后获得 NS3区核苷酸及氨基酸序列。分析119例 HCV 1b 型 NS3区序列的同源性及种系进化,分析 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异情况及重要功能位点的突变情况。结果湖北地区 HCV 1b 型与 HCV 1b 型标准株及亚洲地区序列同源性较高,核苷酸序列同源性为85.94％及87.68％,氨基酸序列同源性可达96.83％及92.39％,而与欧美地区1b 型同源性较低,核苷酸序列同源性均为85.57％,氨基酸序列同源性分别为92.17％及93.38％。进化树分析提示湖北地区序列与中国其他地区序列亲缘性较接近,而与日本、东南亚地区及欧美地区的1b 型亲缘性较远。 NS3丝氨酸蛋白酶区185个氨基酸内有34个位点有氨基酸突变,但其重要的功能区包括催化酶底物特异性结合位点以及 Zn2﹢结合位点在所有序列中均高度保守,无一例发生突变。结论对湖北地区 HCV 1b型 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异规律及生物学意义的研究进一步丰富和完善了对 HCV 1b 型基因组变异情况的认识。为了解 HCV1b 型在中国地区的进化过程提供一定理论基础。     

北京地区人偏肺病毒融合蛋白F编码基因的序列分析

目的进一步了解北京地区人偏肺病毒（hMPV）编码基因的特征。方法在原先工作的基础上，从分属于hMPV的两个不同基因进化簇（即基因型）的两份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增F蛋白全基因，克隆至pBS-T载体中并进行测序，与GenBank中hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析。结果BJ1816和BJ1887的F基因全长均为1620个核苷酸，编码539个氨基酸。BJ1816和BJ1887F蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为83．8％和94．4％，与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性（98．3％～99．6％）。BJ1816和BJ1887的F蛋白是典型的I型糖蛋白，具有与迄今已发现的hMPV相同的裂解位点（RQSR）。BJ1816和BJ1887之间F2亚单位的氨基酸同源性高于F1亚单位的同源性（96．9％vs93．8％）；除位于羧基末端的跨膜区和胞质尾区外，F1亚单位的其余部分较保守（95．4％）；糖基化位点保守。种系进化分析显示BJ1816和BJ1887属于不同的进化簇。结论F蛋白的序列分析进一步证明BJ1816和BJ1887分属于不同的基因型，其F蛋白的基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似，是病毒的膜表面糖蛋白，提示其在病毒的感染与免疫中起到重要的作用。     

四川省流行性乙型脑炎病毒优势基因型的研究

目的了解四川省乙脑主要流行区乙脑病毒的分子生物学特性,为防治提供依据。方法对2007-2010年间分离到的13株乙脑病毒进行PreM和E基因区扩增,采用MEGA5生物学软件完成氨基酸序列和病毒进化树分析。结果基因分型显示13株均属于基因I型。13株病毒之间比较,PreM基因核苷酸和氨基酸同源性为97％-100％和98．7％-100％,E基因核苷酸和氨基酸同源性为97．8％～99．9％和99．6％～100％,其同源性极高。13株病毒与2004年四川分离株比较E基因核苷酸同源性在97．7％～99．6％之间,氨基酸同源性在98．6％-100％之间;PreM基因的核苷酸同源性在96．2％-99．1％之间,氨基酸同源性在97．5％-98．7％之间;与疫苗株P3和SA14—14—2比较E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为87．6％～88．3％和97％～97．8％;PreM基因核苷酸和氨基酸同源性分别为84．1％～85．8％和93．7％-96．2％。13株病毒E基因的8个氨基酸毒力位点均没有发生改变。结论四川省乙脑病毒已呈现基因I型为优势型别的态势,其PreM和E区核苷酸和氨基酸高度保守,关键的氨基酸毒力位点没有变化,提示目前使用的疫苗对流行株的感染具有保护作用。     

惠州市重症手足口病病原谱及EV71型VP1区基因特征分析

目的分析惠州市手足口病重症病例的病原谱构成,了解惠州市肠道病毒71型分离株的VPl区基因特征．为科学防治手足口病提供科学依据。方法采集300例重症手足口病（HFMD）患者标本,采用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒核酸,并对肠道病毒7l型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxA16）进行分型检测;选择8株EV71分离株进行VPl区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较。并用Mega5．0软件构建亲缘性进化树。结果通过实时荧光RT-PCR特异性检测,EV71阳性结果154份,阳性率为51．33％;CoxAl6阳性结果38份,阳性率为12．67％。测序结果表明,8株EV71之间的VPl基因核苷酸同源性为96．9％～99．2％。氨基酸同源性为99．3％～100％。VPI区基因遗传进化分析表明。8株EV71分离株与c4基因亚型的代表株处于同一分支,均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论惠州市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型一致,未产生明显的抗原漂移及变异。     

Molecular cloning of hepatitis C virus genome from a single Japanese carrier: sequence variation within the same individual and among infected individuals.

A hepatitis C virus (HCV) genome was isolated and sequenced from a single Japanese patient with chronic non-A, non-B hepatitis. The genome (HCV-JT), which was constructed with 23 cDNA clones, consisted of 9436 nucleotides with a long open reading frame which could encode a sequence of 3010 amino acid residues. To study the sequence variation of the HCV genome in an individual, we analyzed another sequence of the HCV genome (HCV-JT') constructed with different cDNA clones derived from the same patient. The nucleotide variation between HCV-JT and -JT' was less than 1%, and was distributed throughout the genome except in the 5' non-coding region, where no variation was observed. The diversity was higher (1.6%) in the putative envelope protein region than in other regions. The nucleotide and deduced amino acid sequences of HCV-JT showed homologies of about 91 and 95%, respectively, with those of other Japanese HCV isolates. The nucleotide diversity was high in the gp 70 region (corresponding to the NS 1 region of flaviviruses) and low in the 5' non-coding and p22 (putative core protein) regions. A similar pattern of distribution of nucleotide changes was observed on comparison of HCV-JT with an American isolate HCV-US, where the homologies in nucleotide and amino acid sequences were about 79 and 85%, respectively. Base transversions contributed about 50% of the total base exchanges between the Japanese and American HCV sequences, but only 20% or less of those among Japanese HCV or among American HCV sequences. Thus, the Japanese and American HCVs are genetically distinguishable, supporting our earlier prediction that these two HCVs could be classified as different subtypes.     

Genotype distribution and comparison of the putative envelope region of hepatitis C virus from Korean patients

Comparative nucleotide sequence studies of the genomes of hepatitis C virus (HCV) revealed that there are at least 6 different genotypes of HCV. The prevalence of HCV genotypes among the patients with liver diseases in Korea was investigated using the polymerase chain reaction (PCR) for the NS5 region. In the 75 HCV RNA positive samples, two genotypes, type 1b and type 2a, were the major causative agents which accounted for 60% and 33% of infections respectively, while 7% could not be assigned a genotype by the methods used. The nucleotide sequences of cDNAs encoding the putative envelope proteins from 10 type 1b and 5 type 2a genotype samples were analyzed. Approximately 31–42% of the nucleotide sequences of type 1b samples examined differed from those of different genotypes, In the case of type 2a samples, 36–42% of the nucleotide sequences differed from those of different genotypes. The diversities of the amino acid sequences were the same or greater than those of the nucleotide sequences. Two hypervariable regions (HVR1 and HVR2) were recognized in both HCV genomes of genotypes 1b and 2a. However, the sequence divergence within the HVR2 region of genotype 2a was less than that of genotype 1b. © 1995 Wiley-Liss, Inc.     

丙型肝炎病毒NS5a高免疫原区人工合成多肽抗原性的研究

目的 检测不同基因型丙型肝炎病毒(HCV)非结构5a区(NS5a)高免疫原区短链多肽的抗原性，确定该区的主要线性抗原表位并探讨基因异质性与免疫原性间的关系。方法 设计并合成特异性多肽；DNA Star软件对多肽氨基酸同源性进行比较；间接ELISA法检测多肽的抗原性。结果多肽氨基酸的同源性在不同区及不同基因型间变化较大。氨基酸残基2212～2241、2272-2301和2302-2331的多肽抗原性最强。18个来自保守区的多肽可以与不同基因型抗-HCV阳性血清起反应(阳性率高达96％)；而来自不同基因型间氨基酸序列保守性较低区的多肽抗原性与同基因血清的反应性较高。结论 HCV NS5a高免疫原区主要的线性抗原位于氨基酸残基2212-2241、2272-2301和2302-2331的位置；人工合成的多肽可以有效地用于检测抗-HCV抗体；一些多肽的抗原性具有基因型特异性。     

Structural homologies between RNA gene segments 10 and 11 from UK bovine, simian SA11, and human Wa rotaviruses

The nucleotide sequences of gene segments 10 and 11 from UK bovine rotavirus have been determined. Gene 10 is 751 nucleotides long and contains a single long open reading frame capable of coding for a protein of 175 amino acids. When compared with the published data for gene 10 of the simian rotavirus SA11 and human Wa strains it was found to be more closely related to the SA11 structure (92% nucleotide sequence homology; 97% amino acid sequence homology) than to the human Wa structure (84% nucleotide, 86% amino acid sequence homology). All three strains have two potential N-glycosylation sites in the hydrophobic N terminus of the gene 10 protein. Gene 11 from UK bovine rotavirus is 667 nucleotides long with a single long open reading frame capable of coding for a protein of 198 amino acids. When compared with the published sequence of gene 11 from the human rotavirus Wa, the UK bovine rotavirus gene 11 was found to be one nucleotide longer in the 5'-noncoding region and three nucleotides longer in the coding region. The nucleotide sequence homology was 86%. The predicted proteins coded by segment 11 in UK and Wa rotaviruses are both rich in serine and threonine (23%) and very hydrophilic, but differ appreciably in amino acid sequence (83% homology).     

Nucleotide sequence of dengue 2 RNA and comparison of the encoded proteins with those of other flaviviruses

We have determined the complete sequence of the RNA of dengue 2 virus (S1 candidate vaccine strain derived from the PR-159 isolate) with the exception of about 15 nucleotides at the 5' end. The genome organization is the same as that deduced earlier for other flaviviruses and the amino acid sequences of the encoded dengue 2 proteins show striking homology to those of other flaviviruses. The overall amino acid sequence similarity between dengue 2 and yellow fever virus is 44.7%, whereas that between dengue 2 and West Nile virus is 50.7%. These viruses represent three different serological subgroups of mosquito-borne flaviviruses. Comparison of the amino acid sequences shows that amino acid sequence homology is not uniformly distributed among the proteins; highest homology is found in some domains of nonstructural protein NS5 and lowest homology in the hydrophobic polypeptides ns2a and 2b. In general the structural proteins are less well conserved than the nonstructural proteins. Hydrophobicity profiles, however, are remarkably similar throughout the translated region. Comparison of the dengue 2 PR-159 sequence to partial sequence data from dengue 4 and another strain of dengue 2 virus reveals amino acid sequence homologies of about 64 and 96%, respectively, in the structural protein region. Thus as a general rule for flaviviruses examined to date, members of different serological subgroups demonstrate 50% or less amino acid sequence homology, members of the same subgroup average 65-75% homology, and strains of the same virus demonstrate greater than 95% amino acid sequence similarity.     

武汉市新分离2株乙型脑炎病毒E基因分型及序列分析

目的 对2009年武汉市新分离的2株乙型脑炎（简称乙脑）病毒进行基因分型和序列分析,了解本地乙脑病毒株的分子生物学特性。方法 将2009年从三带喙库蚊中分离的两株乙型脑炎病毒用RT-PCR法扩增E基因,将其进行测序,并用DNAstar and MegAlign软件与其他基因型代表株进行比对。结果 16组样品检出两株阳性（WHJX9-09、WHJX10-09）,这两株阳性均属于GI型。两株新分离JEV之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9％和100％。同目前在武汉市使用的疫苗株SA-14-14-2相比,核苷酸同源性分别为87.4％、87.9％,氨基酸同源性为96.9％。共有15个氨基酸发生变异分布在3个不同结构域,中和位点没有变异但是神经毒力位点仍然存在。结论 武汉市本地新分离乙脑病毒基因型为GI型,不同于1988年在武汉检出的GⅢ型的基因型,和疫苗株SA-14-14-2相比,其神经毒力并没有减弱,但疫苗产生的抗体对新出现的GI型乙脑病毒仍有中和作用。因此提高乙脑疫苗的接种率并配合防蚊灭蚊措施对控制乙脑疫情依然至关重要。同时有必要对本市蚊虫及乙脑患者进行长期的病原学监测工作,为乙脑预测预警体系的建立提供科学依据。     

中国轮状病毒非结构蛋白NSP4基因变异特征的分析

目的　研究我国轮状病毒流行株NSP4基因的变异特点。方法　对近年来从我国不同地区获得的 2 7份人轮状病毒流行株的NSP4基因用RT PCR进行扩增 ,克隆后进行全长cDNA序列分析 ,并利用Clustal× 1.8,TreeView3 2及DNAStar软件与参比株Wa、KUN、AU 1、EW及来自GenBank的OSU、SA11、Hochi、US2 44、Bristol株的NSP4序列进行分析比较。采用PCR分型方法对VP7血清型进行鉴定 ,确定轮状病毒G型与NSP4基因型的关系。结果　氨基酸同源性比较表明 ,我国轮状病毒不同流行株NSP4之间同源性为 81.7%～ 99.4% ,据此可将 2 7株RVNSP4分为 2组 ,分别以Wa株和KUN株为代表 ,其中以Wa组为主。组内同源性分别为 92 .0 %～ 99.4%和 92 .0 %～ 98.9% ,组内变异率分别为 0～ 8 5 %及 1 2 %～ 8 5 %。两组间变异率达 16 6%～ 2 1 0 %。氨基酸进化树提示在Wa组内包括 3个亚组。轮状病毒G血清型与NSP4基因型之间的联系不确定。结论　我国流行株NSP4基因主要可分为Wa组和KUN组 ,在Wa组内可形成三个亚组 ,并且在高变区有特征性的氨基酸位点。NSP4的变异与年份有关而与地域关系不密切