心肌直接接触诱导骨髓间充质干细胞成心肌样分化

目的 应用新生大鼠心肌细胞(CM)与骨髓间充质干细胞(MSCs)体外共培养的方法模拟心肌内环境,研究模拟环境下MSCs分化为CM的相关因素及其适宜条件。方法利用CM与MSCs不同比例直接接触和非直接接触共培养的方法模拟心肌微环境,分析MSCs形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果直接接触共培养的MSCs与(2M同步搏动,表达心肌特异性肌钙蛋白T,且MSCs与CM等比例培养时分化率最高;而在缺乏直接接触条件下,单纯的CM条件培养液无法单独诱导MSCs的横向分化。结论与CM间的直接接触为诱导MSCs分化为CM的必需条件,共培养的细胞密度对于诱导分化率有影响,条件培养液则非关键因素。     

直接与间接接触对诱导骨髓间充质干细胞成心肌样分化的影响

目的　观察心肌细胞 (cardiomyocytes ,CM)与骨髓间充质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,MSCs)直接接触和非直接接触对诱导MSCs成心肌样分化的影响。方法　体外以新生大鼠CM与MSCs直接接触和非直接接触的培养方式模拟心肌微环境 ,分析MSCs形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果　直接接触共培养的MSCs与CM同步搏动 ,且心肌特异性肌钙蛋白T染色阳性 ,阳性率为 1.3 % ;而心肌细胞条件培养液无法单独诱导MSCs的横向分化。结论　与CM细胞间的直接接触是诱导MSCs分化为心肌细胞的必须条件 ,条件培养液则非关键因素。     

条件培养液体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究*

[目的]观察乳鼠心室肌成纤维细胞条件培养液干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.[方法]分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:单纯条件培养液组(TJ)、条件培养液1组(TJ-ZY)、条件培养液2(TJ-XFK),诱导,24h后继续培养4周,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和α-actin mRNA的表达.[结果]免疫细胞化学结果显示单纯条件培养液诱导后的MSCs不表达心肌特异性蛋白cTnT,心复康参与组则表达.实时荧光定量(RT-PCR)结果显示各组均表达心肌分化早期基因,心复康参与组诱导后的MSCs的心肌分化早期基因表达明显高于单纯条件培养液组.[结论]微环境在MSCs向心肌样细胞的分化过程中起了重要作用,心复康能够提高MSCs向心肌样细胞的分化和特化作用.     

心肌微环境中Wnt11与BMP2协同作用促大鼠BM—MSCs分化为心肌样细胞的实验研究

目的探讨在心肌微环境的旁分泌作用中,Wnt11与BMP2对促进大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow—mesenchymal stem cells,BM—MSCs）分化为心肌样细胞的协同作用。方法建立Transwell共培养模型,将心肌细胞及转染Wnt11质粒的3T3细胞置于上层、BM—MSCs置于下层培养,前3天应用含50μg/L Noggin（BMP抑制剂）培养液、第4天换用含0．5μg/L BMP2的培养基诱导培养至第14天。根据不同诱导条件,培养细胞分为7组：阳性对照组（Heart组）、CM组、CM＋BMP2组、CM＋Wnt11组、Wnt11＋BMP2组、CM＋Wnt11＋BMP2组、阴性对照组（BM—MSCs组）。诱导培养结束后,采用RT—PCR方法,检测心肌特异性转录因子（Nkx2．5、GATA4、Mef2c）和成熟心肌细胞特异性基因（cTnI、ANP、d—MHC、B—MHC）mRNA表达水平。结果RT—PCR结果显示,在心肌细胞旁分泌微环境下,Wnt11与BMP2协同作用组（CM＋Wnt11＋BMP2组）心肌特异性转录因子和成熟心肌细胞特异性基因的表达明显高于阴性对照组和其他共培养对照组,低于阳性对照组（P〈0．05）。结论在心肌细胞旁分泌微环境中,Wnt11协同BMP2表达可提高BM—MSCs向心肌样细胞分化的效率。     

曲古抑菌素干预骨髓间充质干细胞向心肌细胞特化体外实验

目的:在体外以新生大鼠心肌细胞(Cardiomyocytes,CM)与骨髓间充质干细胞((Mesenchymal stem cells,MSCs)共同培养的方式模拟体外心肌微环境,研究间质干细胞在HDAC酶抑制剂曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)干预后乙酰化酶活性与MSCs向心肌细胞特化之间的联系.方法:分离大鼠MSCs将已标记的MSCs与心肌细胞、分别加入不同浓度TSA干预后的MSCs与心肌细胞混合培养.贴壁法分离大鼠MSCs在体外培养纯化后进行细胞标记.培养至第4代.根据实验需要分为3组:阳性对照组,实验组,阴性对照组.用4.6-二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)对核进行双标.分别在共培养1周后用免疫荧光染色检测MSCs细胞中的心肌结构功能蛋白:肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果:①MSCs与搏动的心肌细胞共培养1周,MSCs开始出现心肌样分化说明建立了心肌微环境;②阳性对照组中,MSCs经TSA干预48 h后与心肌细胞混合培养.出现心肌样分化并表达心肌结构功能蛋白表达.③阴性对照组中的部分MSCs可少量表达心肌结构功能蛋白.在共培养的7 d,经TSA诱导后经Brdu-DAPI双标MSCs的核,MHC和Cx43荧光显示分化率与阳性对照组的分化率有显著差别.结论:MSCs与经HDAC酶抑制剂干预后的MSCs在心肌微环境中,HDAC酶抑制剂对MSCs向心肌样细胞的特化有促进作用,提示乙酰化酶活性与细胞特化之间的存在联系.     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的状态.方法取健康SD大鼠骨髓,经密度梯度离心和贴壁培养获得MSCs,传至第两代,以10 μmol/L的5-氮杂胞嘧啶(5-aza)孵育诱导24h.培养4周,用免疫细胞化学染色方法鉴定心肌样细胞(cardiomyocyte-like cells);用全细胞膜片钳技术,检测胞膜内向钠电流,并与未经诱导的MSCs和急性分离的心肌细胞进行比较.结果MSCs经5-aza诱导后部分表达心肌特异性肌钙蛋白T,在诱导后4周记录到快速激活和失活的膜内向钠电流.与急性分离的心肌细胞比较,相同刺激脉冲下心肌样细胞所产生的电流幅值较小,Ⅰ-Ⅴ曲线向右偏移.结论经5-aza诱导后,MSCs可分化成具有兴奋性内向钠电流的心肌样细胞.     

体外"心肌样"环境诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化

目的 :探讨体外“心肌样”环境对骨髓基质细胞 (marrowstromalcells ,MSCs)分化的诱导作用。方法 :体外将MSCs与心肌细胞共培养至 16d ,用数码显微摄像及免疫荧光技术分别记录和检测被标记MSCs的生长行为和心肌特异性肌节肌球蛋白重链 (cardiacmyosinheavychainα/ β ,MHCα/ β)、肌钙蛋白I(troponinI,TnI)的表达 ;并在同等条件下 ,与用心肌条件培养基及正常培养基培养的MSCs进行比较。结果 :正常培养基组与条件培养基组均未发现MSCs分化为心肌细胞的可靠证据。但在共培养组 ,观察到了搏动的MSCs;MHCα/ β与ThI蛋白分别于第 1,4d开始表达 ,随时间延长 ,表达阳性MSCs增多。结论 :体外MSCs与心肌细胞接触生长可向心肌细胞分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

丹酚酸B诱导体外培养大鼠骨髓基质细胞向心肌样细胞分化的研究*

[目的]探讨大鼠骨髓基质细胞的体外培养及丹酚酸B(Salvianolic acid B)诱导其向心肌样细胞分化的可能.[方法]取大鼠股骨及胫骨干骨髓基质细胞(MSCs)培养,保留贴壁细胞进行传代;免疫细胞化学行肌动蛋白抗原、肌钙蛋白T抗原染色;观察丹酚酸B对骨髓基质细胞向心肌细胞分化的影响.[结果]大鼠骨髓基质细胞在形态上呈贴壁集落生长,具有成纤维细胞样外观.丹酚酸B加入5-氮胞苷诱导组后细胞死亡较少,长方形、多角形细胞明显增多.[结论]丹酚酸B能够促进体外诱导骨髓基质细胞向心肌样细胞的分化.     

心肌细胞培养环境对骨髓间充质干细胞定向分化成心肌样细胞有促进作用

目的:研究心肌细胞培养微环境对骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化成心肌样细胞的影响.方法:取SD大鼠骨髓,通过贴壁法进行骨髓间充质干细胞培养,经多次传代后获得较纯的MSCs.用5-氮胞苷(5-aza)进行诱导分化,实验组为在玻片上的5-aza干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中;对照组为5-aza干预的MSCs.显微镜下观察两组形态变化,并通过免疫组化鉴别心肌心肌特异蛋白Desmin和肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)表达及其出现时间的早晚.结果:对照组MSCs诱导后10天可见细胞由原来扁平多角形变成长梭形,15天后部分细胞体明显增粗,可见到有些细胞间有融合样情况发生,20天左右类似肌管样细胞出现.而实验组在17天左右可以看到类似心肌管样细胞.免疫组化表明实验组的阳性结果出现的时间比对照组要早.结论:心肌细胞培养环境对骨髓间充质干细胞定向分化成心肌样细胞有促进作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及荧光标记的实验研究

目的建立一种分离纯化,培养扩增、荧光标记骨髓间充质干细胞的方法,为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用荧光活性杂料CM-Dil标记。结果分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象;CM-Dil标记后,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后呈红色荧光,DIL标记阳性率为100%,标记的骨髓MSCs呈梭形,保持了良好的形。结论采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,以获得纯度较高和活性骨髓MSC,是简便有效使用可行的方法;CM-Dil是一种简洁、有效的标记骨髓MSCs的方法。     

老年骨髓基质细胞移植治疗急性心肌梗死实验研究

目的 :观察老年大鼠骨髓基质细胞 (MSC)能否在急性心肌梗死环境中存活、增殖和向心肌样细胞分化。方法 :选用老年近交系Wistar大鼠 ,取供体鼠MSC ,体外扩增 ,DAPI荧光标记。受体鼠经左冠状动脉结扎建立急性心肌梗死模型。 1周后将标记的MSC用直接注射方式移植到梗死灶中 ,移植后 3、7、14d取材 ,观察梗死灶中MSC分布、扩散及心肌特异性蛋白T(TnT)的表达。结果 :在不同移植时间梗死灶中都发现DAPI阳性的细胞 ,且细胞计数随移植时间延长而增多。部分细胞表达TnT ,其中少数细胞出现心肌样横纹。结论 :老年大鼠MSC可在急性心肌梗死环境中存活、增殖 ,有向心肌样细胞分化的能力。     

DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

目的:研究随着时间延长,DAPI标记间充质干细胞(MSCs)的标记率变化。方法:分离培养纯化成年大鼠骨髓MSCs,DAPI标记,不同时点荧光显微镜观察,计算MSCs中DAPI阳性率。将标记的MSCs移植到缺血下肢模型动物骨骼肌中,不同时点取材,冰冻切片,观察移植细胞。结果:标记当天,荧光镜下MSCs胞核呈明亮蓝色荧光,标记率接近100%,随着培养时间延长,标记率逐渐下降。移植1周和2周组织切片中,可见密集移植MSCs,3周以后,可检出的DAPI阳性细胞明显减少。结论:DAPI短期标记细胞效率很高,但标记率随着时间延长而迅速下降。     

骨髓间质干细胞在梗死心肌移植后心肌再生的实验研究

目的：研究骨髓间质干细胞在梗死心肌移植后的心肌再生作用。方法：贵州香猪24只,随机分为对照组（C组）,实验组（E组）。抽取骨髓液3ml,按照Wakitani的方法培养出骨髓间质干细胞,经5-氮胞苷诱导后,BrdU标记备用。开胸结扎冠状动脉前降支,自体骨髓间质干细胞分别经局部注射和结扎的左冠状动脉前降支远端灌注移植入自体急性心肌梗死区域,C组以DMEM对照。术后3,6周取心肌标本行免疫组化、电镜检测。结果：梗死区域可观察到标记的骨髓间质干细胞,这些细胞能表达肌球蛋白重链（MHC）,缝隙连接蛋白-43（Cx-43）,心肌特异性肌钙蛋白1（cTnTI）,电镜下有肌丝形成。结论：骨髓间质干细胞在梗死心肌内移植具有分化再生的能力。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞(MSC)在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法 抽取健康成年志愿者骨髓,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中采用全骨髓培养法,培养传代后改用含地塞米松(1×10^-8 mol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)和维生素C(50 mg/L)的条件培养基培养,在相差显微镜和电镜下观察细胞形态,免疫组化检测Ⅰ型胶原,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶(AP)染色、von Kossa法进行钙结节染色,同时测定细胞内AP(碱性磷酸酶)含量变化,并进行统计学分析。结果 原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养2~3周后,透射电镜下观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体和线粒体,细胞核较为幼稚。Ⅰ型胶原染色、AP及钙结节染色等均为强阳性;AP活性明显增强(P<0.05)。结论 MSC取材安全方便,易于诱导分化为成骨细胞,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源,本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法之一。     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

人脂肪间充质干细胞与软骨细胞接触式共培养的实验研究

目的探讨接触式细胞共培养条件下,人软骨细胞对脂肪间充质干细胞的诱导分化效应。方法用4,6-联脒-2-苯基吲哚(PKH26)荧光标记脂肪间充质干细胞,与软骨细胞进行接触式细胞共培养,细胞比例为1:1,单独培养的脂肪间充质干细胞为对照组。共培养2周后,应用流式细胞仪分选荧光标记阳性的脂肪间充质干细胞,提取细胞总RNA,采用Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的相对表达改变。结果成功分离提取脂肪间充质干细胞;Real-timePCR检测结果显示,共培养组脂肪间充质干细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因相对表达较对照组显著增加(P0.05),蛋白多糖上调307倍,Ⅱ型胶原上调584倍。结论与软骨细胞接触式共培养后,人脂肪间充质干细胞能够被诱导分化为软骨细胞。     

不同方法诱导的骨髓间充质干细胞移植修复大鼠梗死心肌

目的 探讨将不同方法诱导的骨髓间充质干细胞（MSCs）移植到心肌梗死部位后对梗死心肌的修复作用。方法 自成年大鼠骨髓中分离MSCs，分别以下列方式诱导：A组，用心肌细胞裂解液培养7d后移植；B组，MSCs与心肌细胞按1：4的比例共同培养7d后移植；C组，用5-氮杂胞苷（10μmol／L）诱导24h后，换DMEM培养液培养21d后移植；D组（对照组），用DMEM培养液培养21d后移植。建立大鼠心肌梗死模型，将上述4组MSCs进行DAPI标记后移植于梗死部位。用超声心动图检测移植前和移植30d后心肌功能的改变，苏木精-伊红染色观察移植细胞形态。结果 A、B组移植后大鼠左室舒张末期内径（LVEDD）和收缩末期内径（LVESD）比移植前减小，A、B、C组左室收缩功能指标射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）明显比移植前改善。D组移植前后大鼠各指标差异无显著性意义。A、B组移植后镜下可见DAPI标记的MSCs表现为成熟细胞形态，排列在残存的宿主心肌细胞之间，具备与宿主心肌细胞相似排列方向和形态学的特征。C、D组移植后镜下也可见到DAPI标记的细胞，但与宿主心肌细胞形态不同，小部分为成熟心肌细胞形态，大部分为成纤维细胞形态。结论 用与心肌细胞共培养和用心肌细胞裂解液培养两种方法诱导的MSCs移植于心肌梗死部位后，分化为心肌样细胞的效率高，模型鼠心功能恢复显著。