TWIST在紫杉醇诱导喉癌Hep-2细胞系凋亡中的作用研究

blot分析10×10-9 mol/L紫杉醇作用24 h、48 h及72 h的细胞中TWIST,mRNA和蛋白的表达均呈降低趋势,TWISTmRNA分别降低了16.7%、46.8%、76.9%,TWIST蛋白分别降低了16.4%、33.6%、69.6%,差异有统计学意义(F值分别为10.407和18.013,P值均＜0.05).结论 TWIST在Hep-2细胞中的表达有可能参与了紫杉醇诱导的细胞凋亡.     

Twist基因高表达诱导Hep-2细胞上皮间质转化并促进其侵袭能力的实验

目的探讨编码位于常染色体上的碱性螺旋-环-螺旋转录因子（Twist）,在Hep-2细胞中的高表达对上皮细胞标记物——上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、间充质细胞标记物——神经钙黏蛋白（N-cadherin）及Hep-2细胞的侵袭能力的影响。方法以人喉癌细胞系Hep-2为实验材料,将构建好的pcDNA3.1-Twist质粒利用脂质体2000转染于Hep-2细胞,利用Western-blotting方法检测转染pcDNA3.1-Twist的细胞中Twist、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达情况;采用倒置相差显微镜观察转染pcDNA3.1-Twist后细胞的形态学变化;利用细胞侵袭实验,检测Twist的高表达对Hep-2细胞侵袭能力的影响。结果Western-blotting检测发现转染pcDNA3.1-Twist的实验组细胞中Twist和N-cadherin的表达均上升,E-cadherin的表达下降,与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）;倒置相差显微镜发现细胞形态由转染前的多角型、椭圆型变为运动能力更强的细长、梭型;检测高表达TWIST的Hep-2细胞的侵袭能力,发现转染TWIST实验组的穿过膜的细胞数为85.33±6.66,明显高于pcDNA3.1组及对照组穿过膜的细胞数为29.33±10.70和32.00±3.61,差异具有统计学意义（F=52.32,P〈0.05）。结论Twist能诱导Hep-2细胞上皮间充质转化现象的产生,提高Hep-2细胞的侵袭能力,可能通过调控E-cadherin和N-cadherin发挥作用。     

降低Twist1表达可以增加鼻咽癌细胞系HNE1对紫杉醇的敏感性

目的 研究降低Twist1表达可否改变鼻咽癌细胞系HNE1对紫杉醇的敏感性.方法 用包含Twist1小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列的表达质粒转染HNE1细胞,以新霉素(400 μg/ml)筛选阳性克隆,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法鉴定Twist1蛋白的低表达.通过Annexin V-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-碘化丙啶(propidium iodide,PI)双标法和观察DNA降解的方法分析si-Twist1 HNE1细胞对紫杉醇的敏感性,采用实时PCR技术分析凋亡相关基因的表达,流式细胞周期分析和叫甲基偶氮唑蓝(MTT)方法分析降低Twist1表达是否影响HNE1细胞增殖.结果 Annexin V-FITC-PI双标法检测结果显示,10 ng/ml紫杉醇处理后,si-Twist1 HNE1细胞的凋亡率为40.2%,显著高于对照siRNA组的24.3%,差异有统计学意义(t=56.999,P=0.000);恢复Twist1蛋白的表达,紫杉醇引起的凋亡率在低Twist蛋白表达组为44.80%±4.80%(x±s,下同),在高表达组为27.00%±2.91%,差异有统计学意义(t=4.374,P=0.049).实时PCR实验结果显示,紫杉醇处理的HNEI细胞中si-Twist组凋亡相关蛋白B淋巴细胞(bcl)-2的相对表达量为0.28±0.05,显著低于对照siRNA组的0.57±0.08,差异有统计学意义(t=6.710,P=0.021);而bax和bcl-XL基因的转录水平没有明显改变(t值分别为2.000和1.502,P值均>0.05).MTT实验和流式细胞术检测显示Twist表达降低没有影响HNE1细胞增殖(P值均>0.05).结论 降低Twist1表达可能是通过诱导凋亡提高了细胞对化疗药物敏感性,提示Twist蛋白可望成为一项新的鼻咽癌治疗靶标.     

紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用研究

目的：通过体外实验评价紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用。方法：应用人喉癌细胞系Hep-2，将细胞暴露于不同浓度紫杉醇下，分别于6、12、24、48、72h收集标本，进行细胞形态观察；流式细胞仪细胞周期分析；MTT法检测细胞生长情况，绘制细胞生长曲线；应用琼脂糖凝胶电泳进行检测和观察。结果：人喉癌细胞系Hep-2在紫杉醇的作用下，细胞分裂阻滞在分裂期的中期，并诱导细胞发生凋亡；凋亡细胞表现为细胞固缩，核染色质凝聚或者断裂；细胞DNA裂解片段呈现典型的“阶梯状”排列的条带；紫杉醇对Hep-2的细胞毒性与剂量和时间有依赖关系。结论：紫杉醇诱发人喉癌细胞凋亡与细胞分裂期阻滞密切相关，随浓度和时间延长，G2／M期细胞的比率也增高。     

喉癌多药耐药基因1表达沉默后紫杉醇诱导凋亡的研究

目的研究喉癌耐药细胞系(LSC-1/TAX)中MDR1基因表达被沉默后肿瘤细胞对紫杉醇凋亡诱导作用的反应变化。方法表达MDR1 shRNA的慢病毒颗粒转染喉癌耐药细胞系LSC-1/TAX,观察干扰前后紫杉醇诱导喉癌细胞的凋亡改变。采用琼脂糖凝胶电泳进行凋亡定性实验;Giemsa染色观察凋亡细胞的形态学改变;Annexin V-APC/7-AAD双染后,流式细胞仪对凋亡细胞进行定量。结果药敏组细胞发生早期凋亡百分比为(50.95±4.47)%,实验组为(51.04±3.96)%,耐药组为(8.60±1.25)%,对照组为(9.05±1.57)%。实验组与耐药组差异有统计学意义(P<0.05)。喉癌耐药细胞系中MDR1表达被沉默后,细胞对紫杉醇的敏感性提高,凋亡增加。结论表达MDR1 shRNA的慢病毒颗粒可有效地干扰喉癌耐药细胞系中MDR1基因表达,提高喉癌细胞对紫杉醇的凋亡敏感性。     

紫杉醇对Hep-2细胞株的细胞毒性

紫杉醇作为一种抗微管新药,在头颈部肿瘤的临床治疗中已取得初步疗效。本实验观察紫杉醇对人喉癌Hep-2细胞株的细胞毒性作用,对其诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡进行探讨,旨在为该药的临床开发提供理论依据。     

X-连锁凋亡抑制蛋白在顺铂诱导的喉癌Hep-2细胞凋亡中的作用

目的 探讨X-连锁凋亡抑制蛋白(x-linked inhibitor of apoptpsis protein,XIAP)在顺铂诱导喉癌Hep-2细胞凋亡中的作用和机制.方法 体外培养的Hep-2细胞,选择不同浓度的顺铂以不同时间作用于培养的细胞.利用结晶紫法、RT-PCR、流式细胞分析技术研究不同时间、浓度下细胞凋亡的发生率和XIAP、mRNA的表达及两者的相互关系.结果 正常状态下,Hep-2细胞为贴壁细胞,凋亡率低.顺铂作用后细胞凋亡率和XIAP表达水平发生明显变化,表现为XIAP表达水平的下降伴Hep-2细胞凋亡率的升高.不同药物浓度及不同时间点间相比较,细胞抑制率、XIAP的表达及凋亡率差异均有显著性意义.RT-PCR终产物分析表明,随着加药浓度的增加及药物作用时间的延长,XIAP的mRNA水平逐渐降低.相关性分析显示细胞抑制率、凋亡率与药物浓度及药物的作用时间成正相关,而XIAP的表达与药物浓度及作用时间呈负相关,XIAP的表达与调亡率呈负相关.结论 顺铂引起细胞死亡的主要方式是细胞凋亡.XIAP及mRNA在喉癌Hep2细胞中的表达与顺铂的作用浓度及作用时间有双相依赖性.通过诱发XIAP表达水平的降低使细胞的凋亡率升高是顺铂杀伤肿瘤的作用机制之一.     

靶向c-myc基因的siRNA抑制喉癌细胞系Hep-2的研究

目的:探讨siRNA靶向人c-myc基因对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长增殖的抑制作用.方法:根据人c-myc基因设计和合成siRNA和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep-2细胞,进行MTT、形态学和实时PCR法检测,观察其干扰效果.结果:①MTT结果显示人端粒酶siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖;②实时PCR结果显示转染组与阴性对照组和空白对照组相比,c-myc mRNA表达明显减弱,转染组S3 c-myc mRNA 抑制率达到94%;③形态学结果显示人c-myc siRNA能有效抑制Hep-2细胞增殖,肿瘤细胞异形性减小.结论:靶向c-myc的siRNA能显著抑制喉鳞状细胞癌生长增殖.     

人喉癌Hep-2细胞株CD133+肿瘤干细胞生物学特性研究

目的 研究喉癌Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性.方法 流式细胞仪分选Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞,Transwell法检测CD133+肿瘤细胞侵袭能力及三代克隆形成能力;CD133+肿瘤细胞与紫杉醇共培养,10 Gy的直线加速器照射CD133+肿瘤细胞,四甲基偶氮唑蓝法计算其相对存活率和生长抑制率,观察其放化疗抵抗性.结果 CD133+细胞比例为3.1％±0.2％,流式细胞仪分选纯度可达90.2％±5.5％,分选后的CD133+细胞贴壁,呈团块状、克隆球状生长.增殖速度明显较CD133-细胞快;Transwell实验中,相同视野CD133+细胞穿膜细胞数(526±39)个/每视野,而CD133-细胞为(220±20)个/每视野,二者差异有统计学意义(t=22.08,P＜0.01);CD133+细胞三代克隆形成率分别为30.0％±4.7％、32.2％±3.6％、32.7％±3.4％,CD133-细胞三代克隆形成率分别为15.2％±2.2％、12.0％±2.5％、13.8％±3.3％,同代比较差异有统计学意义(t值分别为8.99、14.66、12.69,P值均＜0.01).在紫杉醇共培养体系中,CD133+细胞24 h、48 h、72 h的相对存活率分别为90.1％±5.9％、85.1％±7.1％、70.3％±6.4％,均高于同时期对照组CD133-细胞(t值分别为5.24、8.18、8.14,P值均＜0.01);放射线照射后,CD133+细胞生长抑制率30.0％±7.1％,显著低于CD133-细胞的55.0％±6.3％(t=8.30,P＜0.01).结论 CD133+ Hep-2细胞所占比例较小,具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力,对放化疗有抵抗性,具有干细胞特性.靶向CD133+肿瘤细胞,有望有效杀伤喉癌干细胞.     

人喉癌组织及喉癌细胞系肿瘤千细胞表面标记的差异

目的 比较细胞膜表面蛋白CD44、ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G2,ABCG2)和CD133在人喉鳞状细胞癌(简称喉癌)组织及喉癌Hep-2、LSC-1细胞系中的表达及其差异性,从而探讨在喉癌肿瘤干细胞筛选中的价值.方法 以人喉癌组织及喉癌细胞系Hep-2、LSC-1为...     

葫芦素B对喉癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:体内外观察葫芦素B对人喉癌细胞系Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用并探讨其作用机制,为临床应用提供实验依据.方法:用0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24、48和72 h, MTT法检测细胞增殖.用0.1、1.0和10.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24 h或10 μmol/L葫芦素B作用8、12和24 h,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞凋亡.Western blot检测p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.建立喉癌裸鼠移植瘤模型,观察葫芦素B的体内抑瘤作用.结果:MTT结果显示葫芦素B对Hep-2 细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测发现随着葫芦素B浓度增高或作用时间延长,处于G2/M期细胞的比例逐渐升高,同时伴有G0/G1期细胞减少,细胞凋亡率逐渐升高,经统计学分析,各实验组之间及其与对照组之间的均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);荧光显微镜观察可见典型细胞凋亡;Western blot检测显示葫芦素B可剂量依赖性抑制p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.体内实验发现低、中、高剂量组的抑瘤率分别是32.43%、43.24%和70.27%.结论:葫芦素B通过抑制STAT3活化,抑制cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达,引起喉癌细胞G2/M期阻滞、增殖抑制和凋亡,发挥对喉癌的抗癌效应.     

放疗诱导的Hep-2细胞凋亡及X染色体连锁的凋亡抑制蛋白的表达变化

目的：观察放疗后Hep-2细胞的凋亡率和细胞内X染色体连锁的凋亡抑制蛋白（XIAP）的变化,并分析二者之间的关系。方法：体外培养Hep-2细胞,不同剂量、不同时间放疗后MTT法检测细胞生存抑制率;流式细胞仪检测XIAP荧光指数及细胞凋亡率,并分析二者的相关性。结果：体外培养Hep-2细胞,不同剂量照射后48h检测结果表明,随着照射剂量增加,细胞抑制与凋亡逐渐增加,二者呈正相关（r=0．99,P〈0．05）;XIAP荧光指数随照射剂量增加而增加;同一剂量（4Gy）照射后不同时间（12、24、48h）检测结果表明,随时间延长细胞凋亡逐渐增加。但24h结果与12h结果相比无明显差异,而48h结果与其他2组比较有明显差异,相应的XIAP荧光指数随照射后时间增加而增加,而且在24h内XIAP表达增加明显,细胞凋亡与XIAP呈显著负相关（r=0．915,P〈0．01）。结论：7射线可抑制喉癌Hep-2细胞的生长,射线引起细胞死亡的主要方式是凋亡,且有剂量与时间依赖性。XIAP表达增加可能是Hep-2细胞放射凋亡反应延迟的原因之一。     

丁酸钠对Hep-2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用及其对端粒酶活性的影响

目的 研究丁酸钠对Hep-2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用及诱导凋亡过程中对端粒酶活性的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl terazolium,MTT)比色法观察不同浓度丁酸钠对Hep-2细胞的生长抑制作用,透射电镜下观察其形态学变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling,TUNEL)法、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测丁酸钠作用后的细胞凋亡情况及细胞周期变化,端粒重复序列扩增(telomeric repeat amplification protocal,TRAP)-银染法检测端粒酶活性变化,RT-PCR分析端粒酶各组分的mRNA表达情况.结果 丁酸钠对Hep-2细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性.透射电镜下可见典型的凋亡细胞形态学改变.琼脂糖凝胶电泳可见特征性的凋亡细胞DNA梯状条带.TUNEL法显示,2.5 mmol/L丁酸钠作用72 h,细胞凋亡指数由作用前的2.27±1.18增加至33.50±2.75.流式细胞仪显示,2.5 mmol/L丁酸钠作用72 h,细胞凋亡率由作用前的2.86%增加至31.28%,G0/G1期细胞比例由50.38%增加至70.88%,S期细胞比例由27.40%减少至8.20%,细胞增殖指数由49.62%降低至29.12%.TRAP-银染法显示,丁酸钠作用后细胞端粒酶活性下降,且具有一定时间效应关系.RT-PCR显示端粒酶逆转录酶表达下降而端粒酶RNA模板和端粒酶相关蛋白表达无明显改变.结论 丁酸钠对Hep-2细胞具有生长抑制和诱导凋亡作用,并可能通过下调端粒酶逆转录酶表达而抑制端粒酶活性.     

紫杉醇对人喉鳞状细胞癌Hep-2放射增敏作用的实验研究

目的 在体外用细胞生物学实验技术了解紫杉醇联合直线加速器X射线照射对Hep-2细胞株的作用，以及紫杉醇对Hep-2细胞株细胞周期的影响，并探讨其作用机制。方法 ①用MTT法计算Hep-2细胞经直线加速器照射组；先紫杉醇作用12、18、24、30h后再直线加速器照射组；先直线加速器照射再联合紫杉醇作用12、18、24、30h组各组细胞生长抑制率。②应用流式细胞仪检测Hep-2细胞经紫杉醇作用12、18、24、30h后各组细胞周期分布。结果 ①先紫杉醇作用再直线加速器照射组细胞生长抑制率较高（各组均值达到87．51％～89．64％），与先照射再联合紫杉醇组细胞生长抑制率（各组均值为57．84％～64．34％）及单纯照射组细胞生长抑制率（均值为41．90％）相比有统计学意义（P〈0．01）。②用紫杉醇后Hep-2细胞株细胞周期停滞于G2／M期，G2／M期停滞于24-30h达到峰值（24．65％～25．15％），并在用药后30h观察到凋亡峰。结论 紫杉醇有放射增敏作用，其可能机制是使细胞生长停滞于射线敏感期G2／M期，从而加强射线对肿瘤细胞的杀伤效应。     

沉默survivin抑制喉癌细胞Hep-2生长的实验研究

目的 探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法 将重组质粒(psi-survivin)和阴性对照质粒(psi-scramble)用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)从mRNA和蛋白水平检测survivin的表达.四甲基偶氮唑蓝(MTT)观察喉癌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,将psi-survivin和psi-scramble注射于肿瘤周围,观察其抗肿瘤的效果.免疫组化法和Western blot法检测重组质粒对肿瘤Survivin蛋白表达的影响.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术(Tunel)观察肿瘤细胞的凋亡.结果 psi-survivin不仅在mRNA水平(抑制率为54.4%),而且蛋白水平也抑制Survivin表达,抑制率为37.0%.MTT证实psi-survivin明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率达71.7%.流式细胞仪结果显示psi-survivin组细胞凋亡明显增加,凋亡率达(13.05±0.56)%((-x)±s,下同).体内实验表明,质粒注射后第32天,盐水组瘤体积为(1443.9±230.5)mm3,psi-scramble组为(1348.5±198.4)Rim3,而psi-survivin组为(624.6±188.4)mm3,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-5.917,P＜0.01).psi-survivin能明显抑制肿瘤survivin的表达,抑制率为41.8%,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-80.343,P＜0.01).Tunel染色结果显示psi-survivin组肿瘤组织中出现较多凋亡细胞,而对照组未见凋亡细胞.结论 沉默survivin能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长.     

塞来昔布诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2特异抑制剂--塞来昔布对喉癌Hep-2细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及可能机制。方法 以不同浓度的塞来昔布处理喉癌Hep-2细胞,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响, Hoechst33342染色荧光显微镜下观察细胞核的形态改变,以Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率,Western blot检测Bcl-2、Bax及COX-2的表达, Western blot分析Caspase-3裂解激活。结果 MTT结果表明塞来昔布抑制Hep-2细胞的增殖呈时间和浓度依赖;Hoechst33342 荧光染色见随塞来昔布处理时间延长,细胞核逐渐出现凝集、碎裂等凋亡表现;流式细胞术检测细胞凋亡率见塞来昔布处理细胞24h, 70、100μmol/L组凋亡率分别为(28.9±2.74)%、(32.7±3.96)%;Western blot分析蛋白表达,见随药物处理浓度增加,COX-2、Bcl-2表达降低,Bax表达增加,随药物处理时间延长Caspase-3出现裂解片段。结论 塞来昔布能够有效地抑制Hep-2细胞增殖和诱导Hep-2细胞凋亡,其诱导凋亡作用机制可能与Bax／Bcl-2比值升高,Caspase-3蛋白裂解激活有关。     

Silibinin induced the apoptosis of Hep-2 cells via oxidative stress and down-regulating survivin expression

Silibinin is an anticancer and chemopreventive natural compound, which is extracted from milk thistle (Silybum marianum). It is reported that silibinin has anticancer efficacy in many malignant tumors. Laryngeal carcinoma is the second most common head and neck squamous carcinoma. In the present work, we investigated the effects of silibinin on laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) cell line Hep-2 cells. We found that silibinin induced the decrease of cell viability in Hep-2 cells with a concentration- and time-dependent manner. Moreover, silibinin resulted in the apoptosis of Hep-2 cells and had synergy effects with arsenic trioxide. Intracellular reactive oxygen species (ROS) accumulation increased because of silibinin exposure. ROS scavenger NAC alleviated the cytotoxicity of silibinin to Hep-2 cells. The mitochondrial membrane potential (MMP) was lost in Hep-2 cells treated with silibinin. Subsequently, silibinin induced the activation of caspase-3 in Hep-2 cells and caspase inhibitor Z-VAD-FMK inhibited the cytotoxicity of silibinin in Hep-2 cells. The survivin expression decreased after Hep-2 cells were treated with silibinin. In conclusion, silibinin induced the apoptosis of Hep-2 cells via oxidative stress and down-regulating survivin expression. Therefore, silibinin is a potential therapeutical agent against LSCC in future.