嗜肝细胞腺相关病毒载体的构建

HBV具有天然嗜肝性,其中由HBVpreS1基因编码的前S1(PreS1)抗原位于病毒外壳表面,是HBV嗜肝性的主要分子机制[1].重组腺相关病毒(rAAV)是目前常用的基因治疗载体.我们以腺相关病毒载体系统为基础,用PreS1的编码基因HBVpreS1替代腺相关病毒载体系统的Cap基因,构建出以PreS1为衣壳的重组腺相关病毒载体(rA AVHBVpreS1),旨在探索构建肝病基因治疗特异性载体,为肝病靶向基因治疗提供实验研究基础.     

以乙型肝炎病毒为载体的基因治疗研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)作为肝靶向性基因治疗载体的可能性。方法 用外源报告基因绿色荧光蛋白(GFP)取代HBV S基因读码框构建重组HBV载体,通过脂质体转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察外源基因的表达,半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细胞核内HBV 共价闭合环状DNA构型,常规PCR和Southern杂交检测上清液重组病毒DNA。结累 携带外源基因GFP的重组HBV载体能够在肝细胞内表达外源蛋白,此重组载体为复制缺损型,单独转染后不能在肝细胞包装与复制,在缺失包装信号ε的辅助HBV质粒下可被包装成携带外源基因的成熟重组HBV颗粒并分泌到胞外。结论 HBV可被改造成肝靶向性基因治疗载体。     

编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建

目的 克隆编码小鼠分泌型Klotho蛋白(secKlotho)的全长cDNA片段,构建secKlotho重组腺相关病毒载体.方法 以小鼠肾脏组织mRNA为模板,通过RT-PCR扩增获得小鼠Klotho基因大片段并克隆至pMD18-T载体中,再采用长臂引物进行二次PCR扩增获得编码secKlotho的全长cDNA片段,经EcoR I/Xho I酶切、连接、转化将目的 片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAV-MCS中,酶切及DNA测序对阳性克隆进行鉴定.结果 RT-PCR成功扩增出1 600 bp的小鼠Klotho基因大片段,经二次PCR扩增得到编码secKlotho 的全长1 650 bp cDNA片段,并最终获得3个序列信息和读码框完全正确的pAAV/secKlotho克隆.结论 成功构建小鼠分泌型Klotho重组腺相关病毒载体,为Klotho基因转染治疗慢性肾功能衰竭及冠状动脉粥样硬化等疾病奠定了基础.     

HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因真核重组载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定包含人乙型肝炎病毒(HBV)HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因的真核重组载体.方法:采用PCR法扩增HBcAg基因,并通过基因突变在79～80位氨基酸处生成一个Nhe I酶切位点,然后将这段基因连接到真核表达载体pIRES2-EGFP启动子下游的EcoR I和BamH I之间.同时PCR扩增PreS1第1～65氨基酸基因,并在其两端分别引入Nhe I酶切位点,通过酶切、连接,将这段基因插入到HBcAg基因的Nhe I酶切位点上.将构建的重组载体pIREScS1转化大肠杆菌DH5α,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒.结果:酶切鉴定示,插入片段大小均与预计相符.测序结果与已知序列结果一致.结论:成功构建了HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因的真核重组载体.     

转基因表达干扰素-α1抑制乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究转基因表达干扰素-α1(IFN-α1)对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用.方法 采用分子克隆技术,将HBV全基因插入真核细胞表达载体pBK-CMV中,用FuGENETM6,把pBK-HBV转染人肝癌细胞系SMMC-7721,建立HBV瞬时表达和稳定表达两种细胞模型;导入腺相关病毒载体介导的人IFN-α1重组体(pWP8A-IFN-α1),研究转基因表达IFN-α1对HBV的抑制作用.结果 pWP8A-IFN-α1转基因表达,在HBV瞬时表达的细胞培养系统中,对HBV有显著的抑制作用,HBeAg的产生被完全抑制;在HBV稳定表达系统中,对细胞培养液HBeAg的抑制率为70.6%,3 000 IU/ml外源重组IFN-α1b对HBeAg抑制率为53.6%.结论 转基因表达IFN-α1,能有效抑制HBV标志表达,其抑制作用与3 000 IU/ml的外源重组IFN-α1b的抑制作用相当.因而有可能应用转基因IFN-α1对HBV感染人群进行基因治疗.     

重组腺相关病毒载体在脑缺血动物模型基因治疗中的应用

脑缺血的基因治疗是颇具前景的治疗手段,以病毒为载体的基因治疗的有效性和安全性关系到最终治疗的成败。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体作为目前安全性最好的病毒载体系统,在动物中枢神经系统(centralnervous systerm,CNS)中已进行了有效转导。     

转基因表达干扰素—a1抑制乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究转基因表达干扰素-a1(IFN-a1)对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法 采用分子克隆技术,将HBV全基因插入真核细胞表达载体pBK-CMV中,用FuGENE^TM6,把pBK-HBV传染入肝癌细胞系SMMC-77721,建立HBV瞬时表达和稳定表达两种细胞模型;导入腺相关病毒载体介导的人IFN-a1重组体（pWP8A-IFN-a1）,研究转基因表达IFN-a1对HBV的抑制作用。结果 pWP8A-IFN-a1转基因表达,在HBV瞬时表达的细胞培养系统中,对HBV有显著的抑制作用,HBeAg的产生被完全抑制;在HBV稳定表达系统中,对细胞培养液HBeAg的抑制率为70.6%,3000IU/ml外源组IFN-a1b对HBeAg抑制率为53.6%。结论 转基因表达IFN-a1,能有效抑制HBV标志表达,其抑制作用与3000IU/ml的外源重组IFN-a1b的抑制作用相当。因而有可能应用转基因IFN-a1对HBV感染人群进行基因治疗。     

小鼠全长膜型Klotho蛋白cDNA表达体系的构建与应用

目的克隆编码小鼠膜型Klotho(mKL)蛋白的cDNA片段,构建、包装Klotho重组腺相关病毒表达体系,并检测rAAV/mKL载体表达功能。方法选择RT-PCR扩增小鼠全长mKL蛋白的基因片段,将该片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAV-IRES-hnGFP,采用酶切及DNA测序鉴定;利用AAV-293细胞包装rAAV/mKL,经转染7901细胞,检测其Klotho表达情况。结果本文成功克隆出序列信息和读码框完全正确的3 064 bp的小鼠Klotho基因片段,并构建pAAV/mKL克隆。在AAV-293细胞中包装出rAAV/mKL,病毒原液转染7901细胞后其Klotho mRNA表达上调,而细胞上清液Klotho蛋白也明显增加(P<0.01)。结论成功构建小鼠Klotho重组腺相关病毒载体(pAAV/mKL),获得了rAAV/mKL,并经转染7901细胞验证其基因表达功能正常,这就为进一步研究Klotho基因治疗衰老相关性疾病提供了技术基础。     

丁型肝炎病毒载体携带核酶在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒复制

目的:研究用丁型肝炎病毒(HDV)作为载体携带乙型肝炎病毒(HBV)特异性的锤头状核酶所构建的重组体,在细胞体系及转染动物模型中对HBV基因表达和复制的影响.方法:将HDV-核酶重组体和HBV的共表达质粒转染Huh-7细胞以分析HDV-核酶重组体对HBV基因表达的影响;用小鼠尾静脉快速注射法将共表达质粒转染到小鼠体内,检测重组体在动物体内对HBV基因表达和复制的抑制作用.结果:转染细胞中,重组体对HBsAg的抑制与HDV重组位点和核酶靶位都有关;水压法注射的质粒在小鼠肝内得到表达,与对照相比重组HDV-核酶可有效抑制在肝和血清中HBV的基因表达以及复制,与细胞中的结果一致.结论:此项体内实验为进一步构建治疗性重组HDV病毒,发现靶向性抗病毒基因治疗手段奠定基础.     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.     

高血压降压治疗目标的再认识

根据传统的高血压水平的定义,1993年WHO高血压治疗指南提出血压控制目标为<140/90mm Hg(1mm Hg=0.133kPa),但是并非所有患者都必须将血压降至同一水平,而应根据患者情况进行个体化治疗。Framingham进行的一项长达10～12年的心血管事件研究发现,第5年后,正常上限血压[收缩压(SBP