慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能与单个核细胞乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞(PBMC)及树突状细胞(DC)内HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的存在状况,DC成熟度及功能状态与DC或PBMC中HBV cccDNA载量的关系.方法 分离29例CHB患者和10例健康对照者的PBMC,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CS...     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能与单个核细胞乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的关系

Objective To investigate the relationship between the maturity and function of dendritic cells (DC) and hepatitis B virus covalently closed circular DNA (HBV cccDNA) load in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC)/monocyte-derived DC in patients with chronic hepatitis B (CHB). Methods The peripheral blood samples were collected from 29 patients with CHB and 10healthy controls. PBMC were isolated freshly and induced with granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4). A large amount of DC were harvested after seven days of culture. The expressions of CD209, CD80, CD86, human leucocyte antigen (HLA)-DR and CD1a of DC were analyzed by flow cytometry. The HBV cccDNA load in PBMC and DC were measured by real-time polymerase chain reaction (PCR). The interleukin-12 (IL-12) level in the culture supernatant of DC was determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The effects on T lymphocyte proliferation induced by DC were tested by mixed lymphocyte reaction (MLR). The data was compared by t test and analysis of variance. Results HBV cccDNA could be detected in PBMC from 16 patients, but not in DC from all 29 patients. HBV cccDNA load was all negatively correlated with the expressions of CD209 (r= -0. 793, P＜0.01), CD80 (r= -0. 581,P＜0.05), CD86 (r=-0. 698, P＜0.01), HLA-DR (r=-0. 817, P＜0.01), CD1a (r=-0. 734, P＜0.01), IL-12 level (r=-0. 632, P＜0.05) and allogenic T lymphocyte proliferation induced by DC (r=-0. 617, P＜0.05). The expressions of CD209, CD80, CD86, CD1a and HLA-DR on DC,IL-12 level in culture supernatant of DC and the allogenic T lymphocyte proliferation induced by DC in patients with positive PBMC HBV cccDNA were all significantly lower compared to those in healthy controls, and the changes of the parameters mentioned above were greater in PBMC HBV cccDNA positive patients than those in PBMC HBV cccDNA negative patients (P ＜ 0. 05 or P ＜ 0. 01).Conclusions The function and maturity of DC are impaired in CHB patients. HBV cccDNA can be detected in PBMC from CHB patients. Moreover, the higher PBMC HBV cccDNA is, the worse DC function and maturity are, which could be one of the important mechanisms of HBV persistent infection.     

乙型肝炎病人外周血单个核细胞共价闭合环状DNA的检测

乙型肝炎病毒(HBV)感染的靶器官主要是肝脏，但是很多肝外器官，如骨髓、淋巴结、脾、肾、皮肤、结肠、胃、睾丸、精子及肾上腺旁神经节及外周血单个核细胞(PBMC)等均能被HBV感染。目前认为PBMC存在HBV的感染，但有无HBV的复制，仍存在争议。共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV复制的模板，如果能够发现外周血单个核细胞存在cccDNA，不     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究进展

共价闭合环状DNA(covalently dosed circular DNA,cccDNA)在HBV的复制及感染状态的建立过程中起着非常重要的作用,现将cccDNA的研究进展总结如下. 一、HBV cccDNA的检测方法 1.PCR法:PCR法包括普通PCR和定量PCR.由于松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)在负链和正链上存在缺口,我们可以设计一对跨越两个缺口的引物,由于cccDNA有完整的双链,可以被有选择地扩增.但起始模板量不能太高,否则rcDNA也有可能被扩增,Kock等[1]发现,每个PCR反应管中HBV DNA量在6×105拷贝/ml时能达到最佳的灵敏度与选择性.     

乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的检测

目的 检测不同肝脏病变程度的乙型肝炎患者外周血中的HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA),评价其相关的影响因素和临床意义.方法 共观察57例乙型肝炎患者,其中轻度慢性乙型肝炎患者26例,重型乙型肝炎患者31例.患者入院后行PT、肝功能、肝炎病毒血清标志物等常规检测,并进行总HBV DNA和HBV cccDNA检测.Logistic逐步回归分析影响血清HBVcecDNA检出率的相关因素.结果重型乙型肝炎组13份血清标本HBV cccDNA为阳性,轻度慢性乙型肝炎组仅1份血清标本HBV cccDNA为阳性,血清HBV cccDNA的含量为1.25×103～4.88×104拷贝/mL,两组患者血清HBV cccDNA检出率差异有统计学意义(P=0.0014).血清HBV cccDNA检测诊断重型乙型肝炎患者的灵敏度和特异度分别为41.94%和96.15%.Logistic逐步回归分析显示,血清HBV ccvDNA的检出率与PT有关(X<'2>=7.2192,P=0.0072),而与患者的年龄、性别、血清总HBV DNA、TBil和ALT水平无相关性.结论 部分乙型肝炎患者特别是重型肝炎患者外周血中可以检测出HBV cccDNA,血清HBV cccDNA的检出可作为支持重型乙型肝炎诊断的指标之一.     

54例慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与血清HBsAg定量检测结果分析

目的 检测慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)和血清HBsAg,分析两种定量指标之间及其与血清HBV DNA载量的相关性.方法 应用PSAD消化+滚环扩增+跨缺口实时荧光PCR方法,定量检测54例慢性乙型肝炎患者甲醛固定石蜡包埋肝组织HBV cccDNA水平;用化学发光试剂定量检测患者血清HBsAg.用Pearson检验及直线回归分析方法 对数据进行分析.结果 患者肝组织HBV cccDNA与血清HBsAg定量水平之间呈正相关(r=0.459,P＜0.01),但与血清HBV DNA载量相关性无统计学意义;血清HBsAg定量水平与血清HBV DNA载量呈正相关(r=0.328,P＜ 0.05),与病毒复制效率呈负相关(r=-0.373,P＜0.05).结论 慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA载量与血清HBsAg定量水平相关,结合血清HBVDNA定量检测,可以更全面的反映HBV的复制水平,评价抗病毒疗效.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

HBV共价闭合环状脱氧核糖核酸（cccDNA）是嗜肝 DNA病毒基因组的复制中间体,是嗜肝 DNA 病毒部分基因的mRNA和前基因组 RNA的合成模板,在 HBV感染初期即能检测到,且长期存在于细胞核中。其在 HBV 复制过程中起着关键的作用,它的长期存在也是乙型病毒性肝炎慢性化的主要原因之一。HBV cccDNA肝细胞中持续感染及抗病毒治疗复发之间的关系受到广泛的关注与肯定,现就 HBV cccDNA 常用检测方法及其临床意义作一综述。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞及肝组织中HBV cccDNA定量检测

目的优化HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)特异性定量检测方法,并观察HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中的分布情况。方法标本抽提核酸后,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切,再以跨双缺口的特异性引物进行荧光PCR定量检测HBV cccDNA;用10份HBV高滴度(10~7拷贝/mL)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证此检测方法的特异度和灵敏度;取慢性乙型肝炎患者PBMC和肝组织穿刺标本各50份,检测其总HBV DNA和cccDNA。结果10份血清标本均无假阳性cccDNA检测结果,灵敏度可达到10~3拷贝/mL。所有PBMC中cccDNA检测均阴性;所有肝组织中总HBV DNA和cccDNA检测均阳性,总HBV DNA含量为3．19×10~2～6．69×10~7拷贝/μg人基因组DNA,cccDNA含量为7．32×10~0～6．51×10~6拷贝/μg人基因组DNA,同一患者肝组织中总HBV DNA含量是cccDNA含量的10．7倍至9．2×10~5倍。结论本方法特异度和灵敏度高。PBMC不能支持HBV的复制。在慢性乙型肝炎患者的肝组织中均可检测到cccDNA,但其水平并非与细胞内总HBV DNA水平正相关。     

慢性乙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞HBVcccDNA检测的临床意义

目的了解慢性乙型肝炎患者血清及外周血单个核细胞内是否存在HBV共价闭合环状DNA。方法以20例HBV携带者、75例慢性乙型肝炎和8例肝移植术后患者分离PBMC,应用增效PCR法检测HBVcccDNA。结果本次未在PBMC中检测到HBVcccDNA;20例HBV携带者血清HBVcccDNA阳性率为10%,75例慢性肝炎轻、中、重度患者分别为32%、52%和76%,肝移植患者为12.5%(P0.01);按血清HBVDNA载量不同分为1×105copies/ml、1×105～108copies/ml和1×108copies/ml三组,其血清HBVcccDNA阳性率分别为15.4%(2/13)、50.0%(16/32)和76.7%(23/30,P0.01)。结论慢性乙型肝炎患者肝外HBVcccDNA的检测还需要进一步研究。     

应用滚环扩增技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究

目的 应用滚环扩增(RCA)技术检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA),观察该方法的特异性和敏感性.方法 以HBV全基因质粒为模板,经酶切、连接、浓缩、胶回收纯化等步骤,构建和制备HBV cccDNA标准品.抽提7例慢性乙型肝炎患者肝组织总DNA,进行滚环扩增.用HBV cccDNA标准品、3.2 kb线性HBV DNA、健康肝组织总DNA及15例慢性乙型肝炎患者血清总DNA作为对照,验证此方法的特异性.将HBV cccDNA标准品进行系列稀释,了解该方法的敏感性.结果 成功构建了HBV cccDNA,并可用RCA方法进行扩增.RCA方法可从2 mg的慢性乙型肝炎患者肝组织中检测到HBV cccDNA,并可检测低至1×102拷贝/μL的HBV cccDNA.RCA方法不能检测3.2 kb线性HBV DNA,在健康肝组织及15例慢性乙型肝炎患者血清中亦检测不到HBV cccDNA.结论 RCA方法操作较方便,具有很高的特异性和敏感性.     

乙型肝炎患者外周血单个核细胞端粒酶活性的研究

目的 了解乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）端粒酶活性的表达情况。方法 通过扩增端粒重复序列（TRAP）及光度酶联免疫法，分别检测健康人及各类乙型肝炎患者PBMC的端粒酶水平。结果 各组患者PBMC在植物血凝素（PHA）刺激前均有端粒酶活性的表达，以急性型肝炎组最高，重型肝炎组最低，二者差别具有显著性（P〈0．001）。PHA刺激后与刺激前比较各组端粒酶活性均有显著性升高（P〈0．001），刺激后的端粒酶水平以重型肝炎组为最低，与其他三组比较差别具有显著性（P〈0．05）。慢性重型乙型肝炎经胸腺五肽（TP5）治疗后端粒酶活性显著增高（P〈0．05）。结论 HBV急性感染期PBMC的端粒酶水平升高；慢性感染期PBMC的端粒酶水平在体内被抑制。TP5具有免疫调节作用，能使过低的端粒酶水平趋向于正常。     

慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞丙型肝炎病毒检测及其意义

目的 探讨外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）在丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的感染中的作用。方法 对２２例慢性丙型肝炎患者２１例抗－ＨＣＶ（＋）血液管析患者及１２例健康献血员的ＰＢＭＣｓ分别进行ＨＣＶＲＮＡ,ＨＣＶ抗原检测及电镜观察。结果 （１）２２生丙型肝炎肝炎患者ＰＢＭＣｓ中有７７．３％（１７／２２）ＨＣＶＲＮＡ阳性,（２）感染ＨＣＶ的ＰＢＭＣｓ中电镜下发现复制的ＨＣＶ颗粒;（３）ＨＣＶ颗粒阳笥者的血清和     

肝移植患者外周血单个核细胞中HBV DNA检测及临床意义

目的研究乙型肝炎肝硬化终末期患者肝移植后外周血单个核细胞(PBMC)HBV DNA状态及临床意义.方法应用荧光PCR技术检测乙型肝炎肝硬化终末期肝移植术后30例患者血清及PBMC标本HBV DNA,并用细胞计数法和管家基因β-actin标定PBMC HBV DNA,观察PBMC HBV DNA与血清HBV DNA定量关系;观察患者肝移植术后不同时间PBMC HBV DNA水平.30例对照组为肝炎肝硬化失代偿期患者.结果移植后患者19份(63%)PBMC标本HBVDNA阳性,低于对照组(87%,26/30).以Ct值为定量参数,移植后患者PBMC HBV DNA水平显著低于对照组(P=0.02);肝移植术后患者PBMC HBV DNA长期维持于103～104拷贝/106细胞水平,与肝移植后时间无明显关系.移植后患者血清HBV DNA均阴性,而对照组血清阳性率为48%.结论乙型肝炎肝硬化终末期患者肝移植术后,经有效预防HBV再感染治疗后,虽然血清中不能测出HBV DNA,但PBMC中HBV DNA阳性,这可能成为肝外"病毒池",导致供肝再感染;对移植后患者监测PBMC HBV DNA,可能有助于早期诊断HBV再感染或复发.     

慢性乙型重型肝炎患者外周血单个核细胞衍生的树突状细胞表型与功能

目的 通过检测慢性乙型重型肝炎(CSHB)患者外周血单个核细胞(PBMC)衍生的树突状细胞(MoDC)经聚肌胞苷酸刺激后表型变化及细胞因子分泌情况,了解MoDC的免疫调节功能及其在慢性乙型肝炎(CHB)重症化中的作用.方法 采集CSHB组患者37例、CHB组患者20例和健康对照者20例的外周血,分离PBMC,免疫磁珠细胞分选法获得纯化的PBMC,体外培养诱导为未成熟树突状细胞(iDC),聚肌胞苷酸刺激为成熟树突状细胞(mDC).流式细胞术检测iDC及mDC细胞表面人类白细胞DR抗原(HLA-DR)、CD83、CD86、CD80的平均荧光强度(MFI);ELISA测定聚肌胞苷酸刺激后12、24、48 h的MoDC培养上清液中IL-12、IL-6、TNF-α分泌水平.多组间比较采用单因素方差分析,并进行方差齐性检验.结果 3组iDC表面HLA-DR、CD83、CD86、CD80的MFI比较,差异无统计学意义.CSHB组患者mDC表面HLA-DR、CD83、CD86、CD80的MFI与CHB组、健康对照组比较,显著低下(F值分别为59.73、13.95、34.80和73.02,均P＜0.05).聚肌胞苷酸刺激12、24、48 h时IL-12分泌量为:健康对照组＞CHB组＞CSHB组(F值分别为151.34、126.65、72.76,均P＜0.05),其中24 h时分泌量最高,分别为(48.2±7.6)、(56.7±11.8)、(97.8±16.2)ng/L.IL-6在上述3个时间点的分泌量为:CSHB组＞CHB组＞健康对照组(F值分别为92.50、86.89、64.57,均P＜0.05),其中12 h分泌量最高,分别为(1698.3±340.4)、(965.8±231.7)、(697.8±213.6)ng/L.TNF-α在上述3个时间点的分泌量为:CSHB组＞CHB组＞健康对照组(F值分别为58.66、122.36、44.73,均P＜0.05),24 h表达量分别为(19 672.7±4214.7)、(9946.1±2586.5)、(6659.2±955.8)ng/L.结论 CSHB患者MoDC成熟障碍,表现为IL-12分泌低下,而IL-6及TNF-α分泌亢进,可能是加剧肝脏炎性反应致重型肝炎的重要因素.     

Dynamic changes of HBV DNA in serum and peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis patients after lamivudine treatment

AIM: To study the dynamic changes of hepatits B virus (HBV) DNA in serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients after lamivudine therapy. METHODS: A total of 72 patients with chronic HBV infection were included in this study. All patients were confirmed to have the following conditions: above 16 years of age, elevated serum alanine amonotransferase (ALT), positive hepatitis B e antigen (HBeAg), positive HBV DNA in serum and PBMCs, negative antibodies against HAV, HCV, HDV, HEV. Other possible causes of chronic liver damages, such as drugs, alcohol and autoimmune diseases were excluded. Seventy-two cases were randomly divided into lamivudine treatment group (n=42) and control group (n=30). HBV DNA was detected both in serum and in PBMCs by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR), during and after lamivudine treatment. RESULTS: In the treatment group, HBV DNA became negative both in serum and in PBNIC, of 38 and 25 out of 42 cases respectively during the 48 wk oflamivudine treatment, the negative rate was 90.5% and 59.5% respectively. In the control group, the negative rate was 23.3% and 16.7% respectively. It was statistically significant at 12, 24 and 48 wk as compared with the control group (P < 0.005). The average conversion period of HBV DNA was 6 wk (2-8 wk) in serum and 16 wk (8-24 wk) in PBMC. CONCLUSION: Lamivudine has remarkable inhibitory effects on HBV replication both in serum and in PBMCs. The inhibitory effect on HBV DNA in PBMCs is weaker than that in serum.