拉米夫定与恩替卡韦序贯治疗中的乙型肝炎病毒准种动力学

目的 研究HBV准种群体在拉米夫定(LAM)与恩替卡韦(ETV)序贯治疗过程中的动态演变及其临床意义. 方法 对2例采用LAM-ETV序贯治疗出现不同临床结果的患者进行了近4年的随访,用多聚酶链反应-克隆-测序的方法研究HBV准种组成的长程动态演变,用最大似然法建立遗传进化树分析代表序列的遗传进化关系,结合血清学和病毒学指标分析HBV准种演变与临床过程的关系. 结果 2例患者均出现了LAM耐药病毒学突破,采用ETV治疗后,1例患者获得了持续病毒学应答,另一例患者在ETV治疗72周时又出现病毒学突破.病毒学突破均发生在原有对药物敏感的优势准种被耐药株替代时,ETV耐药与rtL180M+S202G+M204V三联突变株成为优势准种密切相关,准种动力学和遗传进化分析结果提示LAM治疗筛选出的rtL180M合并M204V联合突变株在HBV种群中的累积与此三联突变株的出现有直接关系.结论 HBV准种组成与核苷类药物敏感性密切相关,LAM耐药株可进一步演化为ETV耐药株,对使用核苷类药物治疗的患者进行HBV准种监测具有重要临床意义.     

拉米夫定与恩替卡韦序贯治疗中的乙型肝炎病毒准种动力学

目的 研究HBV准种群体在拉米夫定(LAM)与恩替卡韦(ETV)序贯治疗过程中的动态演变及其临床意义. 方法 对2例采用LAM-ETV序贯治疗出现不同临床结果的患者进行了近4年的随访,用多聚酶链反应-克隆-测序的方法研究HBV准种组成的长程动态演变,用最大似然法建立遗传进化树分析代表序列的遗传进化关系,结合血清学和病毒学指标分析HBV准种演变与临床过程的关系. 结果 2例患者均出现了LAM耐药病毒学突破,采用ETV治疗后,1例患者获得了持续病毒学应答,另一例患者在ETV治疗72周时又出现病毒学突破.病毒学突破均发生在原有对药物敏感的优势准种被耐药株替代时,ETV耐药与rtL180M+S202G+M204V三联突变株成为优势准种密切相关,准种动力学和遗传进化分析结果提示LAM治疗筛选出的rtL180M合并M204V联合突变株在HBV种群中的累积与此三联突变株的出现有直接关系.结论 HBV准种组成与核苷类药物敏感性密切相关,LAM耐药株可进一步演化为ETV耐药株,对使用核苷类药物治疗的患者进行HBV准种监测具有重要临床意义.     

拉米夫定和恩替卡韦治疗慢性乙型重型肝炎的近期疗效观察

目的观察拉米夫定(LAM)和恩替卡韦(ETV)治疗慢性乙型重型肝炎的近期疗效。方法回顾性研究本院慢性乙型重型肝炎住院患者88例,其中对照组(27例)给予常规综合治疗,治疗组分别在综合治疗基础上加用LAM(35例)或ETV(26例)抗病毒治疗。结果治疗8周后,治疗组TBil、凝血酶原时间国际标准化比值(INR)及MELD评分均较对照组明显降低(P0.05),治疗组好转率和HBVDNA低于检测下限的比率明显高于对照组(P0.05)。按治疗前MELD评分高低分为两组,发现MELD评分≤25时,治疗组好转率高于对照组(P0.05),而MELD评分25时,治疗组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。LAM组与ETV组间的疗效差异无统计学意义。结论 LAM和ETV治疗慢性乙型重型肝炎均具有较好疗效,宜尽早使用。     

恩替卡韦抗乙型肝炎病毒剂量和疗效的研究

目的探讨恩替卡韦(ETV)治疗慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒活性,以找到一个合理的剂量用于今后大样本的临床试验。方法多中心、随机、双盲、安慰剂对照的临床试验,选择未经抗病毒治疗的CHB患者212例,按1:1:1的比例随机分为ETV 0.1 mg组69例,ETV 0.5 mg组72例,安慰剂组71例,治疗28d,并停药观察56 d。检测患者血清HBV DNA水平、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和肝功能的变化。结果ETV组表现出明显的抗病毒活性,在治疗28 d后,用bDNA法检测HBV DNA水平,ETV 组中达到主要终点疗效(HBV DNA水平下降2个对数级或达测不出水平)的患者比例明显高于安慰剂组(分别为86%、93%、3%,P<0.01);0.5 mg/d ETV组的HBV DNA下降幅度>0.1 mg/d ETV组(P <0.01)。在56 d的停药观察期间,0.5 mg/d ETV组患者HBV DNA的反弹幅度<0.1 mg/d ETV组(P<0.01)。三组不良事件的发生率相当(ETV 0.1 mg组45%,ETV 0.5 mg组40%,安慰剂组42%)。无一例发生约物相关的严重不良反应。结论ETV组的抗病毒活性显著优于安慰剂,0.5 mg/d组的ETV的抗病毒活性比0.1 mg/d组更强且持久。     

恩替卡韦、拉米夫定治疗乙型重型肝炎的疗效和安全性

目的评估恩替卡韦、拉米夫定治疗HBV相关重型肝炎的疗效和安全性。方法选择2010年1月1日至2015年12月31日在本科住院治疗HBV相关慢加亚急性肝衰竭患者157例,分3组,恩替卡韦组52例,拉米夫定组55例,对照组50例。3组患者均接受内科综合治疗,恩替卡韦、拉米夫定组分别口服恩替卡韦、拉米夫定抗病毒治疗。观察指标包括:24周生存率,12周HBV DNA转阴率、肝功能、凝血酶原活动度(PTA)变化,住院时间,腹水、肝性脑病、消化道出血、肝肾综合征、自发性腹膜炎等并发症的发生率。结果恩替卡韦、拉米夫定组患者的24周生存率分别为69.2%(36/52)、72.7%(40/55),高于对照组56%(28/50)(P均0.05)。治疗12周,恩替卡韦、拉米夫定组较对照组患者的TBil、ALT、AST均显著下降(P均0.05)、PTA显著升高(P0.05);HBV DNA的转阴率分别为88.5%(46/52)、85.5%(47/55),高于对照组10%(5/50)(P均0.05)。恩替卡韦、拉米夫定组肝性脑病、肝肾综合征、腹水发生率均低于对照组(P均0.05),平均住院时间分别为(85±48.6)d、(79±44.3)d,低于对照组(124.3±58.5)d(P均0.05)。结论恩替卡韦、拉米夫定可提高乙型重型肝炎患者的生存率、减少并发症、缩短住院时间,安全性良好。     

恩替卡韦耐药乙型肝炎病毒株的出现和消失

目的 1例拉米夫定耐药患者在接受恩替卡韦治疗过程中出现恩替卡韦耐药相关性变异,继续治疗后恩替卡韦耐药株自动消失,并发生HBeAg血清学转换,对该例患者HBV耐药株的动态变化进行了动态观察.方法 收集该患者的系列血清标本及血清HBV DNA、转氨酶等系列临床数据,采用血清HBV DNA的PCR扩增与直接测序,限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,RT序列的克隆与测序等方法,检测HBV耐药株的比例及动态变化.结果 该患者在应用恩替卡韦治疗前就已经存在拉米夫定耐药株(rtL180M rtM204V),在恩替卡韦治疗后拉米夫定耐药株一度被抑制,随着治疗时间的延长,拉米夫定耐药株的比例又占主导地位.在此基础上,于恩替卡韦治疗第128周,选择出恩替卡韦耐药株(rtL180M rtM204V rtT184L),临床上伴随有ALT和HBV DNA水平的反弹.该例患者在发生恩替卡韦耐药后继续接受恩替卡韦治疗,恩替卡韦耐药株自行消失,HBV DNA转阴(套式PCR方法),ALT复常,并出现HBeAg血清学转换.结论 恩替卡韦可有效地治疗拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者,但长期单药治疗可出现恩替卡韦耐药;在出现恩替卡韦耐药后,继续应用恩替卡韦仍然有效,甚至可发生HBeAg血清学转换和HBV DNA的清除.在恩替卡韦治疗过程中,在出现恩替卡韦变异株之前,可能需要先出现拉米夫定耐药株,在此基础上再选择出恩替卡韦耐药株.     

恩替卡韦与拉米夫定治疗慢性乙型肝炎随机、双盲、双模拟对照研究

目的以拉米夫定（LVD）为对照,评估恩替卡韦（ETV）治疗中国成人慢性乙型肝炎（CHB）的抗病毒疗效和安全性。方法多中心（26个中心）、随机、双盲、双模拟的对照研究。519例核苷类初治的CHB患者,随机分为ETV组（0．5mg／d）258例和LVD组（100mg／d）261例,用药时间至少52周。应用两种HBV定量法（bDNA和PCR）于12、24、36和48周检测血清病毒载量,每隔4周随访患者,记录不良事件和实验室异常的数据,以监测研究药物的安全性。结果ETV和LVD两组患者的基础人口学、临床和病毒学特征相似。经过48周的治疗,到达主要疗效终点者,ETV组为90％,LVD组仅69％（P〈0．0001）。HBV DNA的载量（PCR定量）,ETV组平均下降5．9lg拷贝／ml,LVD组平均下降4．3lg拷贝／ml,二者相差超过1．5lg拷贝／ml（P〈0．0001）。用PCR法,ETV组中有76％的患者测不到病毒（〈300拷贝／ml）,而LVD组中仅为43％。ALT的复常,ETV组也优于LVD组,分别为90％和78％（P=0．0003）。两组患者HBeAg的血清学转换率分别为15％和18％,差异无统计学意义（P=0．39）。两组患者不良事件的发生率基本相似,分别为60％和56％,严重不良事件的发生率分别为3％和5％。在治疗期间,没有死亡病例。结论ETV治疗核苷类初治CHB患者,抑制病毒和改善肝脏生化功能方面均优于LVD,安全性与LVD相当。     

恩替卡韦初治耐药的乙型肝炎病毒体外表型分析

目的:探讨恩替卡韦初治患者发生病毒学突破的可能病毒学原因。方法:扩增1例恩替卡韦初治发生病毒学突破的患者在治疗基线和发生病毒学突破时的乙型肝炎病毒(HBV)全长基因组,构建全长基因组克隆并测序,筛选代表性基因组构建1.3倍复制型质粒,转染Huh7细胞后以Southern blot方法观察病毒复制能力,并分别以单克隆病毒和病毒准种群的形式进行恩替卡韦体外药敏试验,Southern blot检测基线及病毒学突破时单个病毒株及准种群的体外药敏情况。结果:在治疗基线和病毒学突破时间点的22个和25个全长克隆中分别筛选出7个和8个代表性克隆,体外药敏结果显示该患者血清中无论是基线还是病毒突破后的病毒株,无论单克隆病毒株还是本研究所构建的病毒准种群在体外情况下均对恩替卡韦敏感。结论:在本例恩替卡韦初治患者未发现与病毒学突破相关的病毒因素,其耐药机制值得进一步研究。     

恩替卡韦和拉米夫定治疗乙肝病毒相关重型肝炎的临床疗效比较

[目的]比较核苷（酸）类似物恩替卡韦和拉米夫定治疗乙肝病毒相关重型肝炎的临床疗效.[方法]回顾性分析58例乙肝病毒相关重型肝炎患者的临床资料,均接受内科标准治疗和核苷（酸）类似物抗乙肝病毒治疗.其中30例患者使用恩替卡韦抗病毒治疗,28例患者使用拉米夫定.收集并随访患者的存活时间、生化指标、凝血功能、血液常规检查和并发症等临床资料,比较恩替卡韦和拉米夫定的临床效果.[结果]恩替卡韦或拉米夫定组抗病毒治疗的乙肝病毒相关重型肝炎患者血清DNA水平均下降.30d生存率分别为80％和82.1％（P=0.554）,90 d生存率分别为63.3％和57.14％（P=0.416）.2组患者30 d和90 d的生存率无显著差异.[结论]恩替卡韦较拉米夫定更快地抑制HBV复制,能较快改善乙肝病毒相关重型肝炎患者的肝脏功能,但对短期生存率无明显改善.     

恩替卡韦治疗拉米夫定失效慢性乙型肝炎一年的疗效

目的评价恩替卡韦（ETV）对拉米夫定（LVD）失效的慢性乙型肝炎（CHB）患者治疗1年的疗效和安全性。方法选择LVD治疗失效的CHB患者145例，按4：1比例随机分为ETV组（1．0mg／d）116例和安慰剂组29例，治疗12周后，所有患者进入36周的开放用药阶段（ETV1．0mg／d）。观察血清HBVDNA水平、乙型肝炎e抗原（HBeAg）、肝生化功能的变化和不良事件的发生率。结果经12周的治疗，ETV组患者血清HBVDNA平均下降4．30log10拷贝／ml（聚合酶链反应法），安慰剂组下降0．15log10拷贝／ml（P＜0．01）。第12周时，在基线丙氨酸转氨酶（ALT）异常的患者中，ETV组的ALT复常率明显高于安慰剂组（分别为68％与6％，P＜0．01）。两组间不良事件的总发生率相当（33％与28％）。经48周的治疗，服用ETV48周患者HBVDNA的下降幅度为5．08log10拷贝／ml；服用ETV36周患者HBVDNA的下降幅度为4．86log10拷贝／ml；在治疗前ALT异常的患者中，上述两组ALT的复常率分别是85％和90％。治疗结束时，在基线HBeAg阳性的患者中，有6．2％（8／129）出现血清学转换。在治疗期间，未发生与耐药相关的变异。每天服用ETV1．0mg，持续48周的安全性和耐受性良好。结论ETV（1．0mg／d）治疗LVD失效的CHB患者具有显著的抗病毒和临床疗效。     

拉米夫定耐药后序贯治疗中HBV准种的演变

目的:探讨拉米夫定(LAM)耐药后序贯治疗中HBV准种的演变特点.方法:收集7例拉米夫定耐药患者序贯治疗中的血清,对HBV聚合酶基因逆转录酶区进行PCR扩增克隆并测序,结合临床用药分析序列突变,探讨其演变特征.结果:患者1、4、5在序贯治疗中LAM耐药变异株一直存在,主要以M204I+L80I、M204I+L80I+L180M、M204V+L180M+G173L、M204V+L180M为主,所占比例在不断发生变化,患者2、3在序贯治疗中检测出野生株,但患者2在后续治疗中又选择出LAM耐药变异株.患者6在ADv联合ETV治疗时、患者7在单用ADV治疗时测时分别测出双重耐药株M204v+L180M+G173L+T184A和M204V+180M+G173L+236D.结论:拉米夫定耐药后序贯治疗中原耐药突变不易消失,且容易在此基础上筛选出交叉耐药株或多重耐药株,他的出现影响序贯治疗的应答甚至导致序贯治疗的失败.     

慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗中的病毒准种演变

目的 探讨拉米夫定耐药后换用恩替卡韦补救治疗的慢性乙型肝炎患者的病毒准种演变.方法 提取1例慢性乙型肝炎患者治疗中的7个不同时间点(0、24、48、60、72、96、152周)血清中的HBV DNA,巢式聚合酶链反应法扩增HBV DNA聚合酶基因逆转录酶区,克隆测序法对逆转录酶区氨基酸替换形式及准种分布进行分析,并采用扩增耐药突变系统聚合酶链反应法对患者病毒种群中野毒株与病毒总量进行定量检测.结果 患者在治疗过程中主要存在rtM204V、rtL180M+rtM204V和rtM204I 3种拉米夫定耐药相关的病毒株变异形式,各病毒株所占比例不断发生变化,基线时HBV野毒株为优势病毒株,在病毒学突破时,种群中全部为耐药突变株;换用恩替卡韦治疗后,随着病毒载量的下降,拉米夫定耐药突变株被抑制,野毒株在种群中比例逐渐上升,并成为优势病毒株(79.3%).扩增耐药突变系统聚合酶链反应检测结果显示,在基线和发生病毒学突破时,野毒株在种群中的比例分别为68.55%和0.21%,换药治疗后24周,野毒株比例开始上升,此后野毒株占种群的比例波动于16.01%～26.93%.结论 慢性乙型肝炎患者在核苷(酸)类药物序贯治疗过程中,HBV种群的准种分布一直处于动态变化中.不同的HBV准种演变模式可能在恩替卡韦补救治疗中对恩替卡韦耐药发生的作用也不相同.

Abstract：

Objective To investigate the evolution of hepatitis B virus (HB V) quasispecies in one patient during lamivudine (LAM) monotherapy and switching to entecavir (ETV) rescue treatment. Methods Serum samples were taken at seven different time points during antiviral therapy (0, 24, 48, 60, 72, 96,152 weeks, respectively), the HBV DNA polymerase gene was amplified, cloned and sequenced to analyze the amino acid substitutions within HBV DNA polymerase gene and distribution of virus quasispecies. Quantitative detection of the HBV wild strains and total virus was performed by amplification refractory mutation system real-time PCR (ARMS-PCR). Results Three mutation patterns detected during antiviral therapy in the patient: rtM204V, rtM204V+rtL180M and rtM204I. The HBV quasispecies were found always in dynamic variation. The HBV populations were completely replaced with the LAM-resistant variants when the viral breakthrough was encountered during LAM monotherapy. Interestingly, the wild-type variants presented gradually dominant (79.3%) with the decline of HBV DNA load after switching to ETV rescue administration. ARMS-PCR results showed that the wild-type variants account ed for 68.55% of the HBV populations at baseline and this proportion declined to 0.21% when the viral breakthrough emerged under LAM therapy. The wild-type variants gradually increased from week 24 after switching to ETV rescue therapy and the proportion of HBV wild-type variants in the population fluctuated between 16.01% to 26.93%. Conclusions The distribution of virus quasispecies were always in dynamic variation during sequential therapy with nucleotide analogs in chronic hepatitis B patients. Different patterns of dynamic HBV quasispecies may have different contribution in ETV resistance in LMV refractory patients with ETV administration.     

Characterization of hepatitis B virus X gene quasispecies complexity in mono-infection and hepatitis delta virus superinfection

Hepatitis delta virus(HDV) seems to strongly suppress hepatitis B virus(HBV)replication, although little is known about the mechanism of this interaction. Both these viruses show a dynamic distribution of mutants, resulting in viral quasispecies. Next-generation sequencing is a viable approach for analyzing the composition of these mutant spectra. As the regulatory hepatitis B X protein(HBx) is essential for HBV replication, determination of HBV X gene(HBX)quasispecies complexity in HBV/HDV infection compared to HBV monoinfection may provide information on the interactions between these two viruses.AIM To compare HBV quasispecies complexity in the HBX 5' region between chronic hepatitis delta(CHD) and chronic HBV mono-infected patients.METHODS Twenty-four untreated patients were included: 7/24(29.2%) with HBeAgnegative chronic HBV infection(CI, previously termed inactive carriers), 8/24(33.3%) with HBeAg-negative chronic hepatitis B(CHB) and 9/24(37.5%) with CHD. A serum sample from each patient was first tested for HBV DNA levels.The HBX 5' region [nucleotides(nt) 1255-1611] was then PCR-amplified for subsequent next-generation sequencing(MiSeq, Illumina, United States). HBV quasispecies complexity in the region analyzed was evaluated using incidencebased indices(number of haplotypes and number of mutations), abundancebased indices(Hill numbers of order 1 and 2), and functional indices(mutation frequency and nucleotide diversity). We also evaluated the pattern of nucleotide changes to investigate which of them could be the cause of the quasispecies complexity.RESULTS CHB patients showed higher median HBV-DNA levels [5.4 logIU/mL,interquartile range(IQR) 3.5-7.9] than CHD(3.4 logIU/mL, IQR 3-7.6)(P = n.s.)or CI(3.2 logIU/mL, IQR 2.3-3.5)(P < 0.01) patients. The incidence and abundance indices indicated that HBV quasispecies complexity was significantly greater in CI than CHB. A similar trend was observed in CHD patients, although only Hill numbers of order 2 showed statistically significant differences(CHB2.81, IQR 1.11-4.57 vs CHD 8.87, 6.56-11.18, P = 0.038). There were no significant differences in the functional indices, but CI and CHD patients also showed a trend towards greater complexity than CHB. No differences were found for any HBV quasispecies complexity indices between CHD and CI patients. G-to-A and C-to-T nucleotide changes, characteristic of APOBEC3 G, were higher in CHD and CI than in CHB in genotype A haplotypes, but not in genotype D. The proportion of nt G-to-A vs A-to-G changes and C-to-T vs T-to-C changes in genotype A and D haplotypes in CHD patients showed no significant differences. In CHB and CI the results of these comparisons were dependent on HBV genotype.CONCLUSION The lower-replication CHD and CI groups show a trend to higher quasispecies complexity than the higher-replication CHB group. The mechanisms associated with this greater complexity require elucidation.     

Evolution of multi-drug resistant hepatitis B virus during sequential therapy

Multi-drug resistant hepatitis B virus (HBV) has been reported in hepatitis B patients who received sequential antiviral therapy. In vitro studies showed that HBV constructs with mutations resistant to lamivudine and adefovir have marked reduction in sensitivity to combination of lamivudine and adefovir, whereas constructs with mutations resistant to either drug remain sensitive to the other drug. We conducted this study to determine whether mutations conferring resistance to multiple antiviral agents co-locate on the same HBV genome in vivo and to describe the evolution of these mutations. Sera from six patients who had been found to have multi-drug resistant HBV mutations to lamivudine+adefovir, lamivudine+hepatitis B immunoglobulin (HBIG), or lamivudine+entecavir on direct sequencing were cloned after nested polymerase chain reaction (PCR). Analysis of 215 clones from 11 samples with multi-drug resistant mutations on direct sequencing showed that 183 (85%) clones had mutations to both therapies on the same genome; 31 clones had lamivudine-resistant mutants only. Clonal analysis of serial samples from three patients showed progressive evolution from all clones with lamivudine-resistant HBV mutations only to mixtures of clones that have multi-drug resistant mutations and clones that have lamivudine-resistant HBV mutations only, and ultimately all clones having multi-drug resistant HBV mutations. In conclusion, mutations conferring resistance to multiple antiviral agents co-locate on the same viral genome, suggesting that combination therapy directed against mutants resistant to each treatment may not be adequate in suppressing multi-drug resistant HBV. De novo combination therapy may prevent the emergence of multi-drug resistant mutants.     

慢性乙型肝炎患者病毒准种特性的初步研究

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)是否存在准种特性,并初步了解HBV准种的复杂性和遗传差异性。 方法用多聚酶链反应(PCR)技术从1例CHB患者血清中扩增HBV整个PreC/C基因区,然后用T载体克隆PCR产物,从转化阳性的克隆中随机选出34个克隆进行核酸序列分析。结果在34个测序克隆中发现存在28种不同的序列,序列间差异性介于0.2％～2.1％。变异位点分布于整个区域。所有序列nt1896位均无变异。 结论 在CHB患者体内HBV存在复杂的准种特性。     

乙型肝炎病毒感染不同状态下血清病毒反转录酶区准种特点及其临床意义

目的 研究HBV感染不同状态下血清病毒反转录酶(RT)区准种特点和临床意义.方法 50例未接受抗病毒治疗的HBV感染者分为慢性HBV携带者(ASC)组10例、慢性乙型肝炎(CHB)组30例和乙型肝炎肝硬化(LC)组10例.收集患者外周血血清,抽提HBV DNA,PCR扩增RT区基因组后克隆、测序.每例患者获得15～30个序列,进行HBV RT区的准种异质性分析及相关基因突变统计等生物信息学分析.多均数比较采用方差分析,中位数比较采用非参数检验分析,非计量资料比较采用x2检验.结果 总共测序1221个克隆,其中ASC组152个,CHB组780个,LC组289个.3组间基因型构成差异无统计学意义.准种复杂度为LC组＞CHB组＞ASC组,3组间差异有统计学意义(F=33.400,P＜0.05).准种离散度为LC组＞CHB组＞ASC组,LC组与CHB组及ASC组均差异有统计学意义(F=18.070,P＜0.05),CHB组与ASC组间差异无统计学意义.结论 慢性HBV感染过程中,免疫清除期比免疫耐受期具有更宽的HBV变异谱系,随着病程的延长和病情加重,HBV的准种趋向复杂.     

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD野毒株和变异株的变化

目的 观察慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者应用拉米夫定治疗前后,YMDD野毒株及变异株的动态变化,并分析其临床意义。方法 取5例CHB患者治疗前与治疗48周的10份血清标本,先用PCR法扩增包括YMDD基序的乙型肝炎病毒(HBV)部分核苷酸序列,然后进行DNA序列测定,同时分别进行克隆,每份标本随机挑选20～24株单克隆,用实时荧光PCR法检测YMDD野毒株及其变异株。结果 5例CHB患者治疗前PCR产物直接测序结果未检出YMDD变异,治疗48周时有4例检出YMDD变异,但对每株克隆的分别检测显示：治疗前YMDD变异株(YIDD／YvDD)所占比率分别为0％、9．5％、0％、4．5％、5．6％;治疗48周时所占比率分别为100％、100％、65％、100％、0％。其中1例患者治疗前检出YIDD变异株,而治疗48周时YVDD变异株则变成优势株。治疗52周时,4例YMDD变异患者中2例HBVDNA和血清丙氨酸转氨酶(ALT)突破,1例患者ALT突破,但HBVDNA为阴性。结论 YMDD变异株在拉米夫定治疗前的血清中已存在,在服用拉米夫定后,由于选择性抑制了野毒株,使YMDD变异株由弱势株变成优势株,部分患者可导致拉米夫定临床耐药。YVDD变异株可能比YIDD变异株的复制能力强。     

拉米夫定、阿德福韦酯治疗一例患者后乙型肝炎病毒P基因序列的演变与分析

目的 了解对拉米夫定(LAM)和阿德福韦酯(ADV)临床耐药慢性乙型肝炎患者治疗前后HBV P基因序列变化.方法 选择患者治疗前、LAM治疗后1年、更换ADV治疗后1年3个时间点标本,采用一步法扩增HBV株P基因,随机挑选5个克隆进行测序,分析核苷酸和氨基酸的变化.结果 治疗前和ADV治疗1年后血清所有克隆的HBV均为B基因型,LAM治疗1年后血清所有克隆的HBV均为C基因型.LAM治疗后1年,5个克隆中有4个发生rtM204I变异,并伴随rtI91L(A区)、rtS256C(E区)双突变,还有10个氨基酸发生变异.ADV治疗1年后,所有克隆的HBV均转为无YMDD突变的病毒株,spacer domain区发生27～183个碱基缺失,同时有21个氨基酸发生变异,未见rtN236T和rtA181V/T相关变异.与治疗前序列对比,有15个氨基酸发生替代.结论 核甘(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎过程中,HBV是否发生基因型转换有待证实,spacer domain区大片段碱基缺失可能与HBV对ADV耐药相关.