重组人IL-6对近曲肾小管上皮细胞增殖及生物学表型的影响

【目的】观察重组人白细胞介素6（rIL-6）在体外对人近曲肾小管上皮细胞株（HK-2）增殖及生物学表型的影响。探讨rIL-6对HK-2细胞作用的时间-效应及剂量-效应关系。【方法】用MTT比色法检测rIL-6对细胞增殖的影响；用流式细胞术检测rIL-6对细胞周期及α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）阳性细胞百分率的影响；倒置显微镜观察rIL-6对HK-2细胞形态改变的影响。【结果】MTT比色法示，rIL-6在10～50ng／mL作用浓度范围内促进HK-2细胞增殖，呈剂量、时间依赖效应；rIL-6作用浓度为100～200ng／mL时抑制细胞增殖，随作用浓度增加抑制作用加强（F=201．582，P〈0．001），（F=43．943，P〈0．001）。rIL-6影响HK-2细胞的DNA合成。HK-2细胞有基础量的α—SMA表达，25ng／mL rIL-6与HK-2孵育1～48h后，α—SMA阳性细胞百分率高峰出现在48h（F=442．22，P〈0．001）。rIL-6干预下，HK-2细胞形态由卵园型渐转变为长棱型、长条型。【结论】rIL-6可促进HK-2细胞增殖及生物学表型的转化，但大剂量的rIL-6可抑制HK-2细胞增殖。     

探讨游离脂肪酸对近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制

目的探讨游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFAs）对人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）的影响及作用机制。方法用含有不同浓度（0、125、250、500μmol/L）软脂酸的DMEM-F12培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）,在0h、24h、48h三个时段：MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡和细胞周期的影响,免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中白细胞介素-β（IL-β）、白细胞介素-8（IL-8）表达的变化。结果 FFAs呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖（P〈0.05）,并可能通过阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡（P〈0.05）。经FFAs作用后,IL-β、IL-8的表达增加。结论游离脂肪酸有抑制HK-2细胞增殖,促进其凋亡的作用,同时炎性细胞因子IL-β、IL-8表达增多,参与了其发生和发展的过程。     

白细胞介素-18促肾小管上皮细胞转分化的机制研究

目的探讨白细胞介素-18（IL-18）诱导体外培养的人近端肾小管上皮细胞转分化的细胞内信号的转导机制。方法应用细胞培养技术培养HK-2细胞。予不同浓度的p38MAPK通路特异性阻断剂SB203580预孵育细胞30min后,再加入IL-18共同培养。应用RT—PCR方法检测α-SMA mRNA的表达水平,ELISA方法测定细胞胞浆中α—SMA的表达水平。结果SB203580可呈剂量依赖性地抑制IL—18诱导的HK-2细胞α-SMA基因和蛋白的表达。结论阻断p38MAPK信号通路可明显抑制IL—18诱导的HK-2细胞转分化作用：p38MAPK通路可能是调控IL-18诱导的HK-2细胞转分化的主要信号通路之一。     

CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的影响

目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管细胞转分化的可能影响.方法：采用体外培养的人近曲肾小管上皮细胞株（HK2）,分别观察CTGF反义寡核苷酸和AngⅡ干预细胞对细胞CTGF mRNA和蛋白质的表达、细胞内超微结构及细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响.结果：AngⅡ干预HK2细胞48 h后,细胞CTGF mRNA和蛋白的表达显著增高（P＜0.01）;AngⅡ干预96 h后,细胞超微结构显示出间质细胞样结构;这些作用都可被CTGF反义寡核苷酸显著抑制.AngⅡ可以呈时间依赖性地刺激HK2细胞表达α-SMA,这些作用可以被CTGF反义寡核苷酸显著抑制（P＜0.01）.对照组错义寡核苷酸无上述作用.结论：CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导HK2细胞转分化具有显著的抑制作用,提示CTGF可能介导了AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞转分化.     

姜黄素对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞增殖的影响

目的通过观察姜黄素(Curcumin,Cur)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖的影响,探讨姜黄素在防治肾间质纤维化方面的作用机制。方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养;实验分为5组:空白对照组、TGF-β1组(TGF-β110μg/L)、干预1组(TGF-β110μg/L Cur1μmoL/L)、干预2组(TGF-β110μg/L Cur5μmoL/L)、干预3组(TGF-β110μg/L Cur10μmoL/L)。在倒置显微镜下观察各组细胞形态的改变,并通过MTT法检测姜黄素对细胞增殖的影响。结果TGF-β110μg/L能显著诱导人肾小管上皮细胞增殖,与空白对照组相比有显著性差异(P(0.05),并随着处理时间延长而作用增强,但和姜黄素共同作用后,其促细胞增殖作用受到显著抑制(P(0.05)。结论姜黄素能够维持HK-2细胞形态的稳定性,防止细胞纤维样改变,在一定程度上具有抑制TGF-β1诱导细胞增殖的作用,这可能是其防治肾间质纤维化的机制所在。     

大黄素对IL-1β诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨大黄素对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)的影响.方法 以IL-1β诱导体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E),同对以大黄素(12.5、25、50、100mg/L)进行干预,在12、24、48及72h观察细胞形态,细胞免疫化学染色法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及角蛋白(CK)的表达.结果 不同浓度大黄素对正常细胞形态学及其α-SMA及CK的表达无明显影响.大黄素作用48h后可减轻IL-1β诱导的细胞梭形改变,并呈时间依赖性地下调IL-1β诱导的α-SMA表达,上调CK的表达(P<0.05).结论 大黄素对IL-1β诱导的NRK52E细胞转分化有明显抑制作用.     

载脂蛋白M对肾小管上皮细胞增殖凋亡的影响

目的:探究载脂蛋白M(ApoM)缺失对肾小管上皮细胞(RTECs)增殖及凋亡的影响,为肾脏疾病的防治提供新的思路.方法:收集野生型小鼠(WT)及ApoM基因缺失型(ApoM-/-)小鼠尿液并检测尿蛋白、尿酸及尿肌酐的含量.原代培养两组小鼠的RTECs,EdU试剂盒检测其增殖活力;Western blot法检测凋亡相关关...     

IL-18对肾小管上皮细胞Col-Ⅳ及MCP-1表达和分泌的影响

目的探讨白细胞介素-18(IL-18)对肾小管上皮细胞Col-Ⅳ及MCP-1表达和分泌影响。方法应用终浓度为0,0.1,1,10,100ng/ml的IL-18处理体外培养人类近端肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)24,48,72h,用RT-PCR法检测IL-18对HK-2细胞Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA表达;采用ELISA法测定细胞培养上清中Col-Ⅳ及MCP-1分泌水平。结果IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-ⅣmRNA和MCP-1mRNA的表达,IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-Ⅳ的分泌,呈剂量依赖性地促进HK-2细胞MCP-1分泌,但其蛋白分泌量在24h即达高峰,未见时间依赖关系。结论IL-18可能部分通过促进细胞外基质的过度分泌和炎症细胞趋化,参与促进肾间质纤维化的进程。     

长效奥曲肽对肝纤维化大鼠IL-6、IL-8的影响

目的 观察长效奥曲肽对四氯化碳(CCl4)诱发大鼠肝纤维化白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的影响.方法 SD大鼠40只,随机分为正常对照组(n=8)、肝纤维化组(n=16)和长效奥曲肽组(n=16).以40%CCl4皮下注射(3mL/kg)建立大鼠肝纤维化模型,长效奥曲肽组同时给予长效奥曲肽(0.8mg/kg),每4周肌肉注射1次.8周后观察肝脏组织形态学改变、用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6和IL-8.结果 正常对照组大鼠肝脏大体形态和组织学无异常改变;肝纤维化门脉高压组及长效奥曲肽组大鼠肝脏组织形态学表现为肝纤维化改变,但后者的病理损害指标显著轻于前者(P<0.05);正常对照组血清IL-6、IL-8含量分别为(175.28±31.15)pg/mL、(81.51±16.48)μg/mL,肝纤维化组血清IL-6、IL-8含量分别为(313.27±52.79)pg/mL、(213.15±31.16)μg/mL,而长效奥曲肽组分别为(265.13±46.57)pg/mL、(185.16±32.56)μg/mL,肝纤维化组和长效奥曲肽组血清IL-6、IL-8均显著高于正常对照组,但后者两项指标显著低于前者(P<0.05).结论 长效奥曲肽能减轻大鼠肝纤维化程度及降低血清IL-6和IL-8水平.     

IL-18对肾小管上皮细胞Col-IV及MCP-1表达和分泌的影响

目的 探讨白细胞介素18（IL-18）对肾小管上皮细胞Col-IV及MCP-1表达和分泌影响。 方法 应用终浓度为0、0.1、1、10、100ng/mL的IL-18处理体外培养人类近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）24h、48h和72h。应用RT-PCR法检测IL-18对HK-2细胞Ⅳ型胶原（Col-IV）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNA表达;采用ELISA法测定细胞培养上清中Col-IV及MCP-1分泌水平。 结果 IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-IVmRNA和MCP-1 mRNA的表达,IL-18呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞Col-IV的分泌,呈剂量依赖性地促进HK-2细胞MCP-1分泌,但其蛋白分泌量在24h即达高峰,未见时间依赖关系。 结论 IL-18可能部分通过促进细胞外基质的过度分泌和炎症细胞趋化,参与促进肾间质纤维化的进程。     

人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法.方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代.取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构.结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成.细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性.细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密.结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系.     

人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法。方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代。取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构。结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成。细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性。细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密。结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系。     

川芎嗪对高糖诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨川芎嗪对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞HK-2转分化的影响.方法 将HK-2在体外与高糖(25 mmol/L的D-葡萄糖)、高糖+川芎嗪(40/80/160 μg/ml)共培养48 h后,用显微镜观察细胞形态的改变;用间接免疫荧光法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;RT-PCR检测α-SMA和E-钙黏素mRNA的表达.结果 经高糖刺激后,HK-2形态由立方形铺路石样转变为梭形长条样;加入80 μg/ml川芎嗪共同干预后,细胞形态无明显改变.免疫荧光检测显示,经高糖刺激后,α-SMA表达明显增强;加入80 μg/ml川芎嗪后α-SMA表达明显减弱.RT-PCR检测显示,经高糖刺激后α-SMA mRNA表达显著增加,E-钙黏素mRNA表达显著减少,与正常对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01);高糖+不同剂量川芎嗪组HK-2中α-SMA mRNA和E-钙黏素mRNA表达水平组间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 川芎嗪可以阻断高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,进而抑制糖尿病肾病的肾间质纤维化,且存在剂量依赖关系.     

阿魏酸钠对高糖诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用

目的观察阿魏酸钠（sodiumferulate,SF）对高糖培养的人近端肾小管上皮细胞（humanproximaltubularepithelialcells,HKC）增殖和凋亡的影响。方法选用对数期生长的肾小管上皮细胞,分为对照组、高糖组、高糖加阿魏酸钠组。四甲基偶氮唑盐（microculturetetrazolium,MTT）法观察细胞增殖能力的变化,测定细胞培养液中的乳酸脱氢酶（1actatedehydrogenase,LDH）的含量以判断细胞损伤情况,Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡。结果与对照组比较,高糖组MTT吸光度值（OD值）随培养时间延长明显降低,而高糖加阿魏酸钠组OD值与高糖组比较有明显升高（P〈O．05）。随培养时间的延长,高糖组培养基中LDH水平明显升高,在12h和24h分别为（17．55±2．45）和（28．72±3．11）U／L,而高糖加阿魏酸钠组12h和24hLDH水平降至（11．84±2．18）和（19．984-3．67）U／L,和同时间点高糖组比较均有明显降低（P〈0．05）。高糖处理组培养液中的丙二醛（malondiadehycle,MDA）水平较对照组明显增加（P〈0．01）,超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）活性明显降低（P〈0．01）,阿魏酸钠组培养液中MDA水平明显降低（P〈0．01）,SOD活性明显增加（P〈0．05,P〈0．01）。Hoechst33258荧光染色显示,对照组和高糖加阿魏酸钠组仅见个别凋亡形态细胞,高糖组典型凋亡形态细胞明显增多,细胞凋亡率为34．17％,显著高于正常对照组（5．20％）和高糖加阿魏酸钠组（7．39％,P〈0．01）。结论高糖培养可诱导人近端肾小管上皮细胞的损伤和凋亡,并抑制其增殖。阿魏酸钠对人肾小管上皮细胞系（humankidneycell,HKC）的保护作用可能是通过抑制HKC的损伤和凋亡,以及提高增殖能力实现的。     

游离脂肪酸对人近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制

目的探讨游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFAs）对人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）的影响及作用机制。方法用含有不同浓度（0、125、250、500μmol／L）软脂酸的DMEM—F12培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）在0h、24h、48h三个时段：MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡的影响,免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及凋亡相关蛋白caspase8蛋白表达的变化。结果FFAs呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖（P〈0．05）,并可诱导细胞凋亡（P〈0．05）。经FFAs作用后,iNOS及Caspase8的表达增加。结论游离脂肪酸有抑制HK-2细胞增殖,促进其凋亡的作用,FFAs可能通过激活肾小管上皮细胞内的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,加剧肾小管上皮细胞的凋亡,而caspase8参与了其发生和发展的过程。     

尿毒清胶囊人含药血清抑制尿毒症毒素血清刺激的肾小管上皮细胞-2增殖与转分化作用观察

[目的]探讨尿毒清胶囊含药血清对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)增殖与转分化的影响.[方法]将体外培养的HK-2细胞分为6组:正常时照组,体积分数5%、10%尿毒症毒素血清组(简称尿毒症血清组),体积分数5%、10%尿毒清胶囊含药血清组(简称含药血清组),蒙诺组(浓度为10-6mmoL/L).采用四氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和α-平滑肌肌动蛋白(α-sMA)阳性细胞百分率.[结果]5%、10%尿毒症血清组光吸收值(D)显著高于正常对照组(均P<0.01).5%含药血清组D值显著低于10%尿毒症血清组(P<0.01),10%含药血清和蒙诺组D值显著低于5%、10%尿毒症血清组(均P<0.01).5%、10%尿毒症血清组G0/G1期细胞百分数(PG0/G1)显著降低(均P<0.01),细胞增殖指数(TP)显著升高(均P<0.01).5%、10%含药血清组及蒙诺组可显著升高PG0/G1,降低,P(均P<0.01).5%、10%尿毒症血清组HK-2细胞α-sMA阳性细胞百分率(Pα-SMA阳性显著高于正常对照组(均P<0.01),5%含药血清组Pα-SMA阳性显著低于10%尿毒症血清组(P<0.01),10%含药血清组和蒙诺组P<,α-SMA阳性>显著低于5%、10%尿毒症血清组(均P<0.01).[结论]尿毒清胶囊抗肾纤维化作用机制可能与其抑制参与肾纤维化的肾小管上皮细胞的增殖和转分化,进而抑制肾组织纤维化有关.     

特异性shRNA抑制人近端肾小管上皮细胞Toll样受体4的表达

目的:研究RNA干扰法对人近端肾小管上皮细胞(HKC)中Toll样受体4(TLR4)表达的抑制作用。方法:将针对TLR4分子设计的采用体外转录生物合成的特异性短发卡RNA(shRNA)双链分子用脂质体转染的方法导入体外培养的HKC;应用免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察TLR4的分布及表达强弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测TLR4及内参照-βactin在mRNA水平和蛋白水平的表达量。结果:干扰组TLR4的荧光强度显著低于对照组,其mRNA和蛋白的表达量分别下降了67%和62%。同时观察到TLR4主要分布于HKC细胞的胞膜及胞质区。结论:采用生物体外转录的方法成功合成针对TLR4的shRNA双链分子,并有效地转入HKC细胞中使TLR4的表达下调。     

泛素系统在人近端小管上皮细胞Smad信号传导通路中的作用

目的:观察Smad7在TGF-β致近端小管上皮细胞转分化中的变化,泛素系统对该过程中Smad信号的调节及对TGF-β所致的小管上皮细胞转分化的作用。方法:体外培养的人近端小管上皮细胞(HK-2),随机分为对照组、TGF-β1(5μg/L)组和TGF-β1(5μg/L)+MG-132(5 mmol/L)组。Western blot检测细胞中Smad2/3磷酸化水平的改变和Smad7蛋白水平的改变;半定量RT-PCR方法观察细胞中Smad7 mRNA表达的改变。结果:West-ern blot的结果显示:①MG-132+TGF-β1组中,Smad2/3磷酸化蛋白的表达减少90%(P<0.01)。②TGF-β1作用于细胞后,Smad7蛋白表达进行性减少,30 min较0 min降低20%(P<0.05),24 h时几乎无表达(P<0.01);MG-132+TGF-β1组中Smad7蛋白表达与对照组无明显差异,与TGF-β1组相比,Smad7蛋白水平上调。③半定量RT-PCR显示:TGF-β1(5μg/L)作用于细胞后,与Smad7蛋白表达不同,Smad7 mRNA迅速升高,24 h其表达增高近1倍(与0 min比较,P<0.01);MG-132+TGF-β1组中Smad7 mRNA的表达与对照组无明显差异。结论:TGF-β可诱导Smad7 mRNA表达上调,但Smad7蛋白的表达显著减少,其机制与泛素系统活化导致Smad7蛋白的降解增加有关。     

白蛋白对近端肾小管上皮细胞增殖与凋亡的影响

 【目的】探讨白蛋白对近端肾小管上皮细胞（PTCs）增殖与凋亡的影响。【方法】用不同剂量（0．1，0．5，1，5，10，30mg／mL）去脂牛血清白蛋白（dBSA）超载体外培养的NRK52E，dBSA 0mg／mL作为对照。细胞增殖活性用MTS比色法检测和显微镜观察。细胞凋亡检测：荧光染料DAPI染核，DNA梯带实验，原位末端标记（TUNEL）实验和苔盼蓝染色计数。【结果】高剂量dBSA超载未完全融合NRK52E细胞144h后细胞变得更密集。MTS比色结果发现，高剂量dBSA（5、10、30mg／mL）超载可明显诱导NRK52E细胞增殖，增殖活性分别为（0．700±0．045）A、（1．021±0．029）A和（1．273±0．173）A，较对照细胞（0．441±0．020）A显著升高，P均〈0．05。高剂量dBSA超载的NRK52E细胞，有较多出现核碎裂和核固缩，有较强DNA梯带和原位末端标记信号。苔盼蓝染色计数发现，高剂量dBSA（5、10、30mg／mL）超载NRK52E细胞72h的死亡细胞数[（680000±28618）／mL，（970000±52915）／mL和（1132500±88954）／mL较对照的死亡细胞数[（312500±28395）／mL]显著升高，P均〈0．05；而且死亡细胞数呈剂量依赖性。【结论】白蛋白超载NRK52E细胞既可诱导细胞增殖，又可诱导细胞凋亡。