表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌细胞株HCT-8和HT29的抑制作用及影响机制

目的探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对结肠癌细胞株HCT－8细胞和HT29细胞增殖的抑制作用,研究其对HESl与JAGl基因表达的影响。方法体外培养HCT-8细胞和HT29细胞,采用不同浓度的EGCG（10、20、35mg／L）对其进行干预,MTT法检测EGCG对HCT-8细胞和HT29细胞增殖的抑制作用：用流式细胞仪检测EGCG对HCT-8细胞和HT29细胞细胞凋亡和细胞周期的影响。实时荧光定量PCR检测EGCG干预后的HCT-8细胞和HT29细胞的HESl与JAGl基因的表达情况。结果EGCG对HCT-8细胞和HT29细胞增殖及凋亡均有影响,3个EGCG浓度对HCT-8增殖抑制率分别为（28．894±5．076）％,（34．903±1．794）％和（39．028±0．105）％;对HT29的增殖抑制率分别为（14．682±4．244）％、（22．429±3．847）％和（29．840±5．076）％。EGCG能将HCT-8细胞阻滞在G／M期,阻碍其向M期转换,将HT29细胞阻滞在S期,阻碍其向G2期转换,抑制其细胞增殖。EGCG可下调两株细胞HESl的基因表达,但差异均无统计学意义（P〉0．05）：EGCG能上调两株细胞JAGl的基因表达,但只有HCT．8细胞的基因表达差异有统计学意义（O．201±0．018比0．440±0．077．P=0．029）。结论EGCG对体外培养的HCT-8细胞和HT29细胞的增殖有明显抑制作用．且能诱导细胞凋亡和影响细胞周期。其作用机制可能与上调JAGl的基因表达有关。     

黑色素瘤分化相关基因-7和白介素-24选择性杀伤肝癌细胞和诱导增殖阻滞的体外研究

目的探讨黑色素瘤分化相关基因-7／白介素-24基因（mda-7／IL-24）对不同种类肝癌细胞的选择性杀伤作用。方法将携带人mda-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒（Ad．mda-7）感染人正常肝细胞和各种肝癌细胞,通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和酶联免疫吸附（ELISA）实验观察mda-7／IL-24基因的表达,MTT法观察肝癌细胞的生长抑制,Hoeehst染色及Annexin—V和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡情况及用流式细胞仪检测细胞周期。结果RT—PCR和ELISA提示Ad．mda-7能介导外源基因mda-7／IL-24在各种肝癌细胞株和正常肝细胞中高效表达。MTT实验结果提示mda-7／IL-24能明显抑制各种肝癌细胞的生长,Hoeehst染色和流式细胞仪检测提示mda-7／IL-24能选择性杀伤肝癌细胞,细胞周期分析提示mda-7／IL-24阻滞肝癌细胞在G2／M期,同时对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用。结论mda-7／IL-24基因能选择性杀伤各种肝癌细胞,促进细胞增殖阻滞及诱导细胞凋亡。     

法尼酯X受体的激活抑制结肠癌细胞生长

目的 探讨法尼酯X受体（FXR）的激活是否抑制结肠癌细胞的生长。方法 对人结肠癌HCT-116细胞进行体外培养,用四唑氮蓝还原法（MTT）和流式细胞仪测定FXR特异性激动剂GW4064对结肠癌HCT-116细胞生长的抑制作用,同时应用RT-PCR方法检测其FXR mRNA及VEGF mRNA的表达。结果 FXR特异性激动剂GW4064可上调结肠癌HCT-116细胞的FXR mRNA表达,下调VEGF mRNA的表达; 对结肠癌HCT-116细胞的生长具有明显的抑制作用,并促进结肠癌HCT116细胞的凋亡,且均呈剂量及时间依赖关系。结论 FXR特异性激动剂GW4064可以显著抑制结肠癌HCT116细胞的生长,激活FXR受体可能为结肠癌的治疗提供一种潜在的靶点。     

外源hTERT基因对原代培养肝细胞增殖作用的研究

目的探讨表达hTERT蛋白的重组腺病毒rAd-hTERT感染体外原代培养的肝细胞后对其增殖情况的影响。方法将表达hTERT蛋白的重组腺病毒rAd-hTERT感染体外原代培养的肝细胞。同时设空载体对照组及空白对照组。通过定量PCR及Western-blot检测基因在细胞中的表达情况；MTT法观察其对细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测rAd-hTERT对细胞周期和凋亡的影响。结果（1）以50MOIrAd-hTERT感染肝细胞可明显促进其生长增殖，但不会引起细胞毒性作用。（2）定量PCR在转录水平检测rAd-hTERT感染后的细胞中hTERT表达量明显增加。（3）Western-blot在蛋白水平验证rAd-hTERT感染后的细胞中hTERT蛋白的表达及其蛋白活性。（4）流式细胞DNA含量分析显示，rAdhTERT可引起肝细胞周期S＋62／M期增加，并抑制细胞的凋亡。结论rAd-hTERT在体外能有效促进原代肝细胞的生长。与阴性对照比较，同期生长的肝细胞S＋62／M期细胞增加，凋亡细胞减少（P〈0．05），并未引起细胞的不典型增生表现。     

P21增强结肠癌HCT116细胞化疗敏感性的实验研究

目的研究DNA损伤药物——多柔比星（Doxorubicin,Dox）抑制结肠癌细胞增殖和P21蛋白表达的关系。方法200μg／L Dox作用结肠癌HCT116细胞8～120h,细胞直接计数法绘制生长曲线;流式细胞术检测Dox作用前后细胞周期变化;免疫印迹法（Western blot）检测C-MYC、P53和P21蛋白的表达变化。结果200μg／L Dox可以显著抑制HCT116细胞的增殖;细胞周期在Dox作用8h时无明显变化,但在Dox作用24h后出现G2期阻滞;C-MYC和P53蛋白在Dox作用8h后表达显著增加,但P21在Dox作用24h后才显著增加。结论在P53被诱导表达的早期,Dox的抑制作用不甚明显;在P53诱导P21表达后Dox抑制效应才显著,即Dox抑制结肠癌HCT116细胞的增殖依赖P21的表达。     

重组腺病毒介导MDA-7/IL-24对Hep3B选择性杀伤和抑制增殖的研究

目的观察黑色素瘤分化相关基因7（MDA-7／IL-24）基因对人肝癌细胞Hep3B和正常的肝细胞L02的作用，并且探讨其该作用机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞Hep3S，逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）和ELISA方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，噻唑蓝染色法（MTT）观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检二种细胞的凋亡，利用PI染色后流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR方法检测bcl-2的表达变化。结果Ad．mda-7能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株Hep3B和正常细胞L02中高效表达，细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达（Hep3B：L02分别为790：810ng／L）。MDA-7／IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长（抑制率分别是83％和1．2％），能促进肝癌细胞的凋亡（58％：2．2％），阻滞肝癌细胞在G2／M期（48．29％：7．95％）。而对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用；能明显的抑制Hep3B的凋亡抑制基因bcl-2的表达。结论Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞Hep3B，促进细胞增殖阻滞，其机制是通过抑制bcl-2的表达诱导肿瘤细胞凋亡。     

中药癌痛克对人胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡作用及机制研究

目的通过观察不同浓度癌痛克对胃癌细胞株SGC-7901增殖及凋亡的作用，以及在相应状态下细胞内视网膜母细胞瘤（Rb）基因相对表达量的改变，探讨中药癌痛克的抗胃癌作用机制。方法以不同浓度癌痛克作用SGC-7901细胞，CCK-8检测细胞增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡率细胞周期，RT—PCR方法检测细胞内Bcl-2基因表达变化。结果2～50μg／ml癌痛克可抑制SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡，其抑制及诱导凋亡效应呈浓度依赖性；细胞周期分析处于G1期细胞百分比明显增多，处于G2／M期的细胞减少，Rb基因mRNA表达上调。结论中药癌痛克可通过抑制SGC-7901细胞增殖或诱导其凋亡，且其机制可能通过上调Rb基因表达途径使细胞阻滞在G1期，进而诱导细胞凋亡。     

巨噬细胞移动抑制因子对人结肠癌细胞增殖和血管形成的影响

目的:探讨巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对人结肠癌细胞增殖和血管形成的影响。方法:检测不同浓度的抗MIF抗体（Anti-MIF）对人HCT-116结肠癌细胞株增殖及对血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达影响。结果:100，200，400，800 μg/L Anti-MIF处理HCT-116细胞48，72 h后，细胞增殖明显受到抑制，且呈时间-剂量依赖性。100，200，400，800 μg/L Anti-MIF处理HCT-116细胞72 h后，流式细胞仪细胞周期分析表明G0/G1期细胞百分率上升，S期和G2/M期细胞百分率下降;与阴性对照组相比，Anti-MIF作用72 h后VEGF蛋白表达明显减弱，并呈剂量依赖性（P＜0.05）。结论:MIF参与调节细胞的生长周期，并可能通过VEGF影响肿瘤血管形成，而在结肠癌的发病中发挥重要作用。     

曲古抑菌素A通过雌激素受体α依赖和非依赖方式抑制乳腺癌细胞中细胞周期素D1的表达

目的探讨曲古抑菌素A（TSA）对ER—α阳性和ER—α阴性乳腺癌细胞系的作用机制。方法以含不同浓度TSA的培养液培养MCF-7（ER—α阳性）和MDA—MB-231细胞（ER—α阴性）；采用四甲基亚噻唑蓝（MTT）法检测TSA作用后肿瘤细胞的增殖状态；用流式细胞仪定量分析肿瘤细胞增殖周期的改变；用半定量RT—PCR法测定ER—α和cyclinD1mRNA的表达。Western blot检测ER—α、p21和细胞周期素cyclinD1的蛋白表达水平。结果ER—α阳性的MCF-7细胞对TSA的敏感性明显高于ER—α阴性的MDA—MB-231细胞，TSA作用48h时前者的IC50约为40．6nmol／L，后者的IC50约为272．4nmol／L。在MCF-7细胞系中，TSA能有效抑制ER—α和cyclinD1 mRNA的表达，并增强cyclinD1蛋白通过泛素-蛋白酶体通路降解，使肿瘤细胞主要阻滞在G0／G1和G2／M期。在MDA—MB-231细胞系中，TSA对cyclinD1蛋白通过泛素-蛋白酶体通路降解作用增强，但对其mRNA转录本表达无明显影响。结论TSA不仅可以通过依赖ER—α途径抑制cyclinD1 mRNA的表达，也可通过增强泛素-蛋白酶体通路降解cyclinD1蛋白而不依赖于雌激素途径。     

下调X连锁凋亡抑制蛋白基因表达增强结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶敏感性的研究

目的 观察下调X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)基因表达后结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)敏感性的变化.方法 采用脂质体包裹方法将携带靶向干扰XIAP序列的表达载体转染人结肠癌细胞HCT-8和HCT116,观察结肠癌细胞生长活性的变化;应用5-Fu后,观察结肠癌细胞对5-Fu敏感性的变化,并应用蛋白印迹方法检测结肠癌细胞内凋亡相关因子caspase-3的活性变化. 结果抑制XIAP基因表达后,结肠癌细胞HCT-8和HCT116的生长活性受到有效抑制;结肠癌细胞HCT-8对5-Fu的耐药性得到逆转(P＜0.01),HCT116对5-Fu的敏感性得到明显提高(P＜0.05);结肠癌细胞内caspase-3的表达活性提高,5-Fu诱导细胞凋亡的活性得到增强. 结论XIAP的表达是结肠癌细胞HCT-8和HCT116对5-Fu耐药的一个重要机制;抑制XIAP基因表达后能够增强结肠癌细胞HCT-8和HCT116对5-Fu化疗的敏感性.

Abstract：

Objective To investigate sensitivity of colon cancer cells to 5-fluorouracil after downregulation of XIAP gene expression. Method Colon cancer cells HCT-8 and HCT116 were transfected with a short hairpin RNA targeted to XIAP by liposome, cells viability were examined.5-fluorouracil was applied into two kinds of colon cancer cells. Tumor cells sensitiviy to chemotherapeutic drug was evaluated. Caspase-3 activity in tumor cells was examined by Western blot. Result After downregulation of XIAP expression, cell growing viability of these two kinds of colon cancer cells was restricted, HCT-8 resistance to 5-fluorouracil was reversed ( P ＜ 0. 01 ), HCT116 sensitivity to 5-fluorouracil was enhanced (P ＜ 0.05), caspase-3 expression in colon cancer cells was highly activated, apoptosis inducing activity of 5-fluorouracil was increased significantly. Conclusions XIAP expression was a important mechanism in colon cancer cells HCT-8 and HCT 116 resistant to 5-fluorouracil, sensitivity to 5-fluorouracil of HCT-8 and HCT-116 was increased by downregulation of XIAP expression.     

损伤相关模式分子对人肝癌HepG2细胞增殖能力的影响

目的 观察在DAMPs诱导下人肝癌HepG2细胞增殖能力的变化.方法 将HepG2细胞分为对照组和实验组（10、20、40、80 μl DAMPs处理的HepG2细胞）;MTT比色法检测HepG2细胞的增殖能力;实时荧光定量PCR法检测IL-6 mRNA表达的变化;Western Blot法检测HepG2细胞IL-6蛋白的表达情况.结果 HepG2细胞随着DAMPs剂量的递增及时间的延长增殖能力逐渐增强,呈现明显的量效-时效关系,在剂量40 μl,作用时间36 h时细胞增殖能力达到最强,差异有统计学意义（P〈0.01）;选取作用时间为36 h,随着DAMPs剂量的递增,实时定量PCR法检测到HepG2细胞IL-6 mRNA分别为95.55±4.47,171.80±6.60,453.30±14.47,610.59±12.70,441.04±18.91,差异有统计学意义（P〈0.01）;Western Blot法检测HepG2细胞IL-6蛋白的表达分别为1.47、2.07、2.74、3.44、3.00,差异有统计学意义（P〈0.01）.结论 DAMPs在一定剂量及时间内促进人肝癌HepG2细胞增殖,并且呈现明显的量效-时效关系.     

骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及复合纳米羟基磷灰石体外构建组织工程骨的研究

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(rBMSCs)后复合到纳米羟基磷灰石(Nano-HA)体外构建仿生人工骨的可行性. 方法 采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,溶胶-絮凝法制备Nano-HA,用Ad-BMP-2转染体外培养的rBMSCs,免疫组化、RT-PCR和蛋白印迹方法检测转染后细胞的BMP-2表达.将转染48 h的细胞均匀接种到Nano-HA支架上,第3、5天取细胞载体复合物扫描电镜观察细胞贴附、生长状况,消化收集贴附支架的细胞,蛋白印迹检测贴附支架细胞BMP-2的表达.结果 转染后BMP-2基金在mRNA水平和蛋白水平均有高表达;扫描电镜见转染细胞在支架材料分布均匀,黏附良好,转染后及复合后Western Blot检测BMP-2表达较高.结论 利用转基因技术,用含目的基因的腺病毒载体转染靶细胞复合到Nano-HA,细胞载体复合物稳定长效地分泌生长因子,体外成功地构建了仿生人工骨.     

Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌发生中的分子机制研究

目的探讨Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌细胞增殖、迁移方面的影响和其在肝癌发生发展中的可能作用。方法体外培养HepG2和L02细胞,采用免疫荧光和Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin、GSK3β、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平。培养的HepG2细胞分别用浓度100ng/ml的Wnt3α和20 ng/ml的DKK1处理,采用CCK-8检测细胞增殖活力,流式细胞实验检测细胞周期,Western Blot检测β-catenin、GSK3β、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平,Trans-well检测HepG2的迁移情况。结果与正常肝细胞L02相比,HepG2细胞高表达β-catenin,cyclin D1和c-myc,低表达GSK3β。Wnt3α能够显著促进HepG2细胞的增殖活力,而DKK1能够显著抑制其增殖。与Wnt3α组相比,DKK1处理组细胞G0/G1期细胞比例增加,(68.6±0.5)%VS(47.5±1.5)%(P0.01),而S期细胞比例减少(17.4±0.5)%VS(28.6±0.5)%,(P0.01)。Western Blot检测结果说明,Wnt3α提高了β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达水平,抑制了GSK3β的表达,而DKK1抑制了β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达。迁移实验透膜细胞数对照组为(176.40±12.98)、Wnt3α组为(238.20±18.38)、DKK1组为(110.40±9.46),P0.05。结论 Wnt/β-catenin信号通路在促进HepG2细胞的增殖和迁移方面起重要作用,在肝癌的发生发展和转移中起着重要的作用,是肝癌发生的重要分子机制。     

PLK1 及 STK15 基因在结肠癌细胞中的表达及其特异性抑制剂对结肠癌细胞增殖的影响

目的 研究保罗样激酶1（polo-like kinase 1,PLK1）及丝氨酸/苏氨酸激酶15（serine/threonine kinase15,STK15）mRNA及其蛋白在结肠癌细胞中的表达,以及其特异性抑制剂对结肠癌细胞增殖的影响。方法 选取人宫颈癌Hela细胞和人结肠癌HCT-116细胞、HT-29细胞及CACO-2细胞,以β-actin为内参照,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测PLK1 mRNA和STK15 mRNA的表达水平;采用Western blot法检测PLK1蛋白和STK15蛋白的表达水平;采用偶氮唑盐（MTT）法检测Dulbecco改良细胞培养基（DMEM培养基）、二甲基亚砜（DMSO）、SBE13（PLK1蛋白特异性抑制剂） 或VX-680 （STK15蛋白特异性抑制剂） 处理后4种癌细胞的增殖活性。结果 与Hela细胞比较,HCT-116细胞、HT-29细胞及CACO-2细胞的PLK1和STK15 mRNA及其蛋白的表达水平均较高（P＜0.05）。① Hela细胞：与DMEM组比较,SBE13组、VX-680组及SBE13＋VX-680组的增殖能力无明显变化（P＞0.05）。② HCT-116细胞和HT-29细胞：与DMEM组比较,VX-680组和SBE13＋VX-680组的增殖能力均降低（P＜0.05）,但SBE13组的差异无统计学意义（P＞0.05）。③ CACO-2细胞：与DMEM组比较,SBE13组、VX-680组及SBE13＋VX-680组的增殖能力均降低（P＜0.05）。结论 HCT-116、HT-29及CACO-2结肠癌细胞的PLK1 mRNA和STK15 mRNA及其蛋白的表达水平均高于Hela细胞,应用其特异性抑制剂可抑制部分结肠癌细胞系的生长。     

分泌型凋亡相关蛋白1调控成纤维细胞凋亡的研究

目的探讨分泌型凋亡相关蛋白1（secretedapoptosis-relatedprotein1,SARP1）调控增生性瘢痕患者的成纤维细胞（fibroblast,FB）凋亡的作用。方法构建SARP1腺病毒载体（Ad-sARPl）．感染瘢痕患者的皮肤FB,促进其表达SARP1蛋白,观察其蛋白表达后人FB增殖与凋亡的变化,明确SARP1蛋白对FB的调控作用,并通过转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（TuNEL）方法、流式细胞仪（FACs）分析细胞增殖与凋亡动态变化。结果成功构建Ad-SARP1,并能够感染人FB,通过逆转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）检测到SARP1的mRNA值明显增加,Western印迹方法检测SARP1蛋白表达明显增多（P〈0．05）;其蛋白表达后四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法检测,与带荧光的腺病毒空载体（Ad-EGFP）及对照组相比,Ad-SARP1感染的FB增殖活力均显著增高;TUNEL检测Ad-SARP1感染FB前后细胞凋亡结果显示,细胞凋亡明显受到抑制,凋亡阳性细胞变少,接近瘢痕成纤维细胞（HSFB）凋亡;FACS分析表明,感染组FB的细胞凋亡指数与对照组相比明显下降（P〈0．01）。结论sARP1参与调控增生性瘢痕患者的FB功能,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖加快。     

核心蛋白聚糖对膀胱癌细胞生长抑制机制的研究

目的 探讨核心蛋白聚糖（DCN）对膀胱癌细胞生长的影响。方法 以膀胱癌T24细胞株为研究对象，采用MTT法检测不同浓度、不同时间的DCN对T24细胞存活率的作用，采用流式细胞术分析DCN对T24细胞周期及凋亡的影响，采用ELISA和Western blot法检测DCN对转化生长因子-β1（TGF-β1）和P21蛋白表达的影响。结果 与其他浓度相比，40、50 μg/mL DCN作用72 h时对T24细胞的抑制作用最强，差异有统计学意义（P<0.05），且G1期细胞达到最高值，S期细胞达最低值（P<0.001）。5、10、20、30、40、50 μg/mL DCN作用72 h后均能促进T24细胞凋亡，且在40 μg/mL时达到最大值(P<0.001)；与0 μg/mL相比，5、10、20、30、40、50 μg/mL DCN作用72 h对TGF-β1表达均有抑制作用, 最明显的抑制作用浓度为40 μg/mL(P<0.001)；与0 μg/mL相比，40 μg/mL DCN能促进P21蛋白上调（P<0.001）。结论 DCN在体外能够抑制膀胱癌T24细胞生长，诱导其凋亡，其可能的作用机制为下调TGF-β1及上调P2l蛋白表达。     

MMP-1在人牙周膜成纤维细胞中的表达

目的：在基因和蛋白水平检测体外培养人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）金属基质蛋白酶-1（MMP-1）的表达情况。方法：①收集4～6代体外培养的人PDL细胞,使用PCR方法检测细胞内MMP-1的基因表达;②取细胞外液用Westernblot方法检测MMP-1蛋白表达。结果：PCR结果显示MMP-1在PDL中基因水平上有表达,而Westernblot结果在蛋白水平上也证明了MMP-1在PDL中有表达,结论：体外培养的PDL具有MMP-1的功能。     

p53对胃癌细胞BGC823中Survivin基因表达的影响

目的 探讨p53基因对胃癌细胞株BGC823中Survivin基因表达的影响及其作用机制。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测胃癌细胞株BGC823中Survivin和p53基因表达情况；利用质粒pcDNA3．0-rpS3转染该细胞株。应用实时聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测细胞在培养后不同时间点Survivin mRNA和蛋白表达水平。结果 确认了胃癌细胞株BGC823中Survivin和突变型p53基因的表达。受野生型p53质粒转染的胃癌细胞在培养16和24h后，Survivin mRNA和蛋白质水平呈明显下降趋势。结论 野生型p53在转染胃癌细胞株BGC823后可显著抑制后者Survivin基因的转录和表达。     

人真皮来源淋巴管内皮细胞的流式细胞仪分选和生物学特点

目的用流式细胞仪分选培养人真皮来源淋巴管内皮细胞,研究其生物学特点。方法采用中性蛋白酶及胶原酶消化包皮组织获得真皮细胞悬液．应用流式细胞仪检测和分选Podoplanin＋和Podoplanin-／CD34＋细胞．所获细胞进行体外培养。传代细胞进行免疫荧光及RT-PCR方法检测LECs特异标志的表达,低密度脂蛋白吞噬、鼠尾胶原三维培养检测功能特点,MTT法及氚标记法测定细胞增殖周期和低氧条件对其增殖的影响。结果人真皮细胞中CD31＋,CD34＋和Podoplanin＋细胞所占比例分别是6．0％,4．4％和1.4％。Podoplanin＋CD34＋细胞在单层培养时形成内皮细胞典型的铺路石样外观,表达内皮细胞特异性标志CD3l及吞噬DiI-Ac-LDL和三维培养微管形成功能。Podoplanin＋细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志Prox-1,Ang2和VEGFIR-3．和CD34＋细胞间具有显著性差异。两组细胞生长曲线相似均于接种至培养板后的3～5d逐渐进入对数生长期,接种后的6—8d均进入停滞期。在缺氧环境下,氯化钴浓度为50μM和100μM时刺激细胞增殖,当浓度大于200μM细胞增殖明显受到抑制。结论应用流式细胞仪可以富集人真皮来源淋巴管内皮细胞和血管内皮细胞．尽管两者表达特异性分子标志不同,其在三维培养和缺氧条件下生长特点相似．     

Ox-LDL对血管内皮细胞ABCA1及炎症因子表达的研究

目的：研究在致动脉粥样硬化（AS）因子氧化低密度脂蛋白胆固醇（Ox-LDL）刺激下,人血管内皮细胞ECV304中ATP-结合盒转运子A1（ABCA1）对炎性细胞因子ICAM-1及IL-1β水平调节作用,阐明ABCA1基因在AS发生中的可能机制。方法：培养人血管内皮细胞株ECV304,加入Ox-LDL（30ng／ml）刺激3、6、12、24h,以荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）检测ABCA1、ICAM1 mRNA表达量,Western blot和酶联免疫吸附（ELISA）法检测ABCA1、ICAM1及IL-1β蛋白表达量;ABCA1的反义寡核苷酸（100nmol／L）转染人血管内皮细胞,按相同方法给予Ox-LDL刺激细胞,同样的方法测定上述指标的改变。阴性对照为未加Ox-LDL刺激并同时培养的细胞。结果：与阴性对照组比较,人血管内皮细胞株ECV304在给予Ox-LDL刺激不同时间后,AB—CA1、ICAM-1的mRNA和蛋白及IL-1β蛋白水平均增高;给予ABCA1反义寡核苷酸转染后各时间点ABCA1、ICAM-1 mRNA表达均降低,ABCA1、ICAM-1及IL-1β蛋白表达水平也降低。结论：人管内皮细胞在Ox-LDL作用下,其ABCA1可能通过增加IL-1β的表达,促进炎症细胞因子ICAM-1释放,在AS的早期发生中发挥作用。