低氧/高糖环境下间充质干细胞对RPE生物学特性的影响

目的：建立人骨髓间充质干细胞( hMSCs)与视网膜色素上皮细胞( RPE)低氧高糖培养的细胞共培养模型,研究在与hMSCs共培养条件下低氧及高糖时RPE细胞增殖、凋亡和移行等生物学特征的影响,对糖尿病刺激脉络膜新生血管( CNV)的机制进行初步探讨。
　　方法：使用Transwell间接共培养模型。将共培养模型按照培养氧浓度及糖浓度培养基类型分为4组：常氧常糖组(21% O2加5.56mmol/L葡萄糖培养液,A组)、常氧高糖组(21% O2加30mmol/L葡萄糖培养液,B组)、低氧常糖组(5% O2加5.56mmol/L葡萄糖培养液,C组)和低氧高糖组(5% O2加30mmol/L 葡萄糖培养液,D 组)。通过CCK-8检测间接共培养模型在12,24,48 h时RPE细胞的增殖能力、Transwell 检测间接共培养模型在24 h 时 RPE细胞的移行情况、流式细胞仪检测间接共培养模型中24 h时RPE细胞的凋亡情况。
　　结果：与对照组相比,12,24和48 h时, B组(1.61±0.41,1.80±0.34,1.91±0.35)、C 组(1.34±0.46,1.94±0.40,2.14±0.41)及D组(1.98±0.47,2.26±0.42,2.55±0.40)中的细胞增殖能力均较对照组(0.92±0.45,1.27±0.32,1.59±0.41)增强(P<0.05),并且低氧高糖联合作用组增殖能力最强。在24h时,B 组(149.5±9.19)、C 组(140±9.90)、D组(170.5±7.78)较对照组(114.5±7.78)的RPE
　　细胞移行能力增强(P<0.05)。而在24h时各组间的凋亡情况无明显差异(P>0.05)。
　　结论：与hMSCs共培养条件下,低氧及高糖环境促进RPE细胞的增殖和移行,而对其凋亡并无影响。     

高糖体外对视网膜色素上皮增生以及活性氧表达的影响

目的:研究高浓度葡萄糖对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增生以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的影响。方法:体外培养人RPE(ARPE-19),随机分成4组,即正常对照组用含5.6mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液,高糖组用30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液,高糖+SB203580组用p38-MAPK特异性阻断剂SB20358010μmol/L预处理30min后,再用含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液,甘露醇组(渗透压对照组)用含5.6mmol/L葡萄糖和24.4mmol/L甘露醇的DMEM/F12培养液。各组培养48h用MTT法检测各组视网膜色素上皮细胞的增生活力,用CM-H2DCFDA荧光染色检测RPE细胞中ROS的产生量。结果:与对照组相比,高糖培养人视网膜色素上皮细胞48h可以导致RPE细胞的损伤,抑制RPE细胞增殖,并使ROS生成增加,在一定程度上,与p38-MAPK途径的激活有关。结论:高糖培养ARPE-19可致细胞损伤,抑制增殖,并使ROS生成增加。     

高糖对体外培养的视网膜Mǖller细胞活性的影响

背景视网膜Mǖiler细胞具有为视网膜组织提供营养、维持视网膜的正常结构等多种生理功能,研究发现Mǖiler细胞的病变会导致视网膜血管发生相应的改变。探讨高糖对视网膜Mǖiler细胞的影响对于糖尿病视网膜病变（DR）的发病机制研究具有重要意义。目的研究不同浓度的葡萄糖对体外培养的视网膜Mǖiler细胞活性的影响。方法取出生后10d清洁级SD大鼠的视网膜组织,用组织块培养法在含质量分数20％胎牛血清的DMEM培养液中体外原代培养Mǖiler细胞并传代,取第3代细胞用免疫组织化学法对细胞进行鉴定。将不同浓度（5．5、30．0、40．0mmol／L）的葡萄糖加入培养基中培养4d,MTT比色法测定各组波长570nm处Mǖller细胞的吸光度（A570）值,计算各组细胞的相对存活率;采用流式细胞仪检测各组Mǖller细胞的凋亡率。结果培养的细胞贴壁生长,呈长梭形;95％以上细胞神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）反应阳性。MTT比色法检测显示,正常葡萄糖组及30．0mmo／L、40．0mmol／L葡萄糖处理组Mǖller细胞A570值分别为0．24±0．01、0．21±0．03和0．20±0．02,总体差异有统计学意义（F=6．755,P〈0．05）。与正常葡萄糖组比较,30．0mmol／L、40．0mmol／L葡萄糖处理组A570值均明显降低,差异有统计学意义（q=0．645、0．486,P〈0．05）。流式细胞仪检测结果表明,正常葡萄糖组、30．0mmol／L和40．0mmol／L葡萄糖处理组Mǖller细胞凋亡率分别为（26．40±0．25）％、（30．19±0．16）％和（36．23±0．19）％,总体差异有统计学意义（F=294．530,P〈0．05）,与正常葡萄糖组比较,30．0mmol／L、40．0mmol／L葡萄糖组凋亡率均明显升高,差异有统计学意义（q=0．754、0．484,P〈0．05）。结论高浓度葡萄糖可抑制视网膜Mǖller细胞的生长并增加其凋亡率,葡萄糖的上述作用呈浓度依赖性。     

ILK siRNA对高浓度葡萄糖诱导的人LECs增生和上皮向间质转化的抑制作用

目的探讨整合素连接激酶（ILK）对高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和转化的作用。方法将体外培养的人LECs系SRA01/04细胞分别培养在含葡萄糖5.5mmol/L（正常对照组）和30.5mmol/L（高糖组）的培养液中,用RT-PCR检测培养0、6、24h后ILK mRNA的表达;用ILK siRNA脂质体转染细胞,转染6h后,加入2组培养液处理24h,检测ILK、细胞增生核抗原（PCNA）、LECs转化指标α-SMA和FN在mRNA水平的表达。结果高糖组培养6h和24h,SRA01/04细胞ILK mRNA是正常对照组的2.48倍和2.32倍（P〈0.01）,刺激后24h,SRA01/04细胞PCNA、α-SMA、FN的mRNA表达分别是正常对照组的1.75、1.96和1.75倍（P〈0.01）。ILK siRNA干扰后,正常对照组ILK的表达是非转染细胞的30%,高糖组转染细胞ILK mRNA水平（P〈0.01）是非转染细胞的21%（P〈0.01）,转染细胞PCNA、α-SMA和FN的表达分别是非转染细胞的29%、33%和39%（P〈0.01）。结论高浓度葡萄糖可诱导LECs增生、上皮向间质转化及ILK表达上调,抑制ILK的高表达能阻止这些过程。     

高糖条件下糖康乐对RPE细胞GSH表达的影响

目的探讨在高糖条件下糖康乐对兔视网膜色素上皮（RPE）细胞谷胱甘肽（GSH）表达的影响。方法采用体外培养的兔RPE细胞,分成空白对照组、高糖组、糖康乐组和牛磺酸组4个实验组（n=6）,在高糖条件下糖康乐组加以不同质量浓度的糖康乐,对RPE细胞的GSH含量进行测定。结果RPE细胞的GSH含量在高糖作用后明显降低（t=5．72,P〈0．01）,糖康乐在质量浓度为2μg／mL时可显著抑制GSH含量的降低（t=4．63,P〈0．01）,在2p．g／mL时其作用优于阳性对照组的牛磺酸（t=4．74,P〈0．01）。结论一定质量浓度的糖康乐可以抑制高糖所导致的RPE细胞GSH含量的降低。     

缺氧和高糖对视网膜色素上皮细胞增生及VEGF、TGF-β1表达的影响

目的 探究缺氧、高糖环境对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长、增生及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达变化的影响.方法 采用酶消化法进行C57小鼠RPE细胞的体外原代培养.通过组织形态学观察和免疫化学染色对培养的RPE细胞进行鉴定.实验缺氧组:在DMEM培养液中加入CoCl2,使其浓度分别为50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1;实验高糖组:在DMEM培养液中加入D-葡萄糖,使其浓度分别为15 mmol·L-1、30 mmol·L-1、45 mmol·L-1.分别向培养的RPE细胞中加入上述培养液,共6组,每组3份;正常对照组加入含5.5 mmol·L-1葡萄糖、不含CoCl2的培养液.观察各组细胞在不同培养条件下的活力、倍增时间及增生情况.采用ELISA法检测各组细胞在培养不同时间后(24 h、48 h、72 h)上清液中VEGF及TGF-β1表达量的变化.结果原代培养及传代早期的RPE细胞生长较为旺盛;在缺氧和高糖培养条件下所培养的细胞活力和分裂次数均较正常对照组有所降低或减少,而倍增时间较正常对照组延长.在缺氧和高糖培养条件下培养24 h、48 h、72 h后,细胞上清液中VEGF和TGF-β1表达量均较正常对照组高(P<0.05);当CoCl2浓度为100 μmol·L-1和D-葡萄糖浓度为30mmol·L-1时,VEGF和TGF-β1在24 h、48 h、72 h表达均高于其他浓度,缺氧状态下48 h表达量分别为(43.28±0.88)ng·L-1和(8.90±1.38)ng·L-1,高糖状态下分别为(39.76±0.56)ng·L-1和(8.81±0.92)ng·L-1;缺氧组2种细胞因子表达量在48 h达到高峰,而高糖组在72 h达到高峰.结论 应用酶联合消化法可获得纯度较高的体外C57小鼠培养RPE细胞;缺氧和高糖状态可对RPE细胞增生起到明显抑制作用,但能够明显上调RPE细胞的VEGF、TGF-β1表达量.     

新型海藻多糖化合物保护高糖诱导的RPE细胞异常增殖

目的:研究在高糖条件下,从海藻中萃取的新型多糖化合物对高糖诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞异常增殖的保护作用。方法:将体外培养的RPE细胞分为空白组、高糖组和多糖化合物组,空白组为正常RPE细胞培养液,高糖组为含30mmol/L葡萄糖的培养液,多糖化合物组为含30mmol/L葡萄糖和200mg/L多糖化合物的培养液。应用MTT法测量36h内不同时间点(6,12,24和36h)高糖以及多糖化合物对RPE细胞增殖影响。结果:高糖导致RPE细胞异常增殖,多糖化合物组RPE的细胞异常增殖明显得到保护,与高糖组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:从海藻中萃取的新型多糖化合物可以明显保护高糖所导致的RPE细胞的异常增殖。     

缺氧条件下共培养时观察Mtiller细胞对RPE细胞生长的影响

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞和Mtiller细胞在维持视网膜的正常代谢中起重要作用,多种生理、病理过程与二者的相互作用有关。目的利用Transwell小室体外共培养兔Mtiller细胞与RPE细胞,观察缺氧条件下Moller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。方法应用组织块培养法和酶消化法分别培养原代兔Mtiller细胞和RPE细胞,免疫组织化学法鉴定2种细胞。取第3代培养良好的细胞进行试验。应用CoCl2培养细胞以建立细胞化学缺氧模型,分为常氧组和缺氧组,每组又分为对照组（RPE细胞单独培养）、共培养组（MOiler细胞与RPE细胞共同培养）。利用Transwell小室建立Mtiller细胞和RPE细胞的共培养模型,各组分别培养3、6、24、48h,利用MTT法和结晶紫染色法对培养存活的RPE细胞进行计数,检测常氧及缺氧条件下Miiller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。结果原代培养的RPE细胞符合RPE细胞的特征,90％以上呈现CK．18阳性反应。培养的Miiller细胞对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100染色呈阳性反应。与常氧培养条件比较,缺氧条件下单独培养的RPE细胞增生数量增加,细胞迁移数量增加,差异有统计学意义（P〈0．01）;缺氧条件下与MUller细胞共培养的RPE细胞增生数量和迁移数量明显增加,与常氧组和单细胞培养情况下比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。缺氧条件下,与RPE细胞单细胞培养组比较,共培养组RPE细胞的增生和迁移增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论缺氧可以促进RPE细胞的增生和迁移,Mtiller细胞可以加重缺氧引起的RPE细胞的增生和迁移。     

高糖对人视网膜色素上皮细胞Na-K-ATP酶表达的影响

目的 观察高糖对人视网膜色素上皮（RPE）细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达的影响。方法 采用ARPE-19细胞，培养4周后分为高糖组（葡萄糖浓度30mmol／L）与对照组（葡萄糖浓度7mmol／L），继续培养2周、4周，RT-PCR法检测Na-K-ATP酶α1、Na-K-ATP酶β1的mRNA表达水平的变化，Western blot法检测Na-K-ATP酶β的蛋白表达情况。结果 高糖抑制Na-K-ATP酶α1与β1的mRNA表达，2周、4周时α1与β-actin光密度比值分别为0．17、0．23，对照组分别为0．37、0．36；β1与β-actin光密度比值分别为0．69、0．41，对照组分别为0．98、0．83；Na-K-ATP酶β蛋白表达水平较对照组降低，2周、4周时与β-actln的比值分别为0．51、0．25，对照组分别为0．65、0．68。结论 高糖环境下人RPE细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达水平降低，可能参与了黄斑水肿的发生。     

辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

背景有多种因素参与年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病,其中视网膜色素上皮（RPE）细胞的氧化应激损伤与AMD的发病密切相关。实验和临床研究表明,辅酶Q10是一种强抗氧化剂,探讨其对人RPE细胞的氧化应激损伤是否有保护作用对于AMD的防治有重要的临床意义。目的探讨辅酶Q10对体外培养的人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用及其作用机制。方法体外培养人RPE细胞,分为正常对照组（单纯培养基培养）、不同浓度（0．01、1、100μmol／L）辅酶Q10预处理组和单纯叔丁基过氧化氢（TBHP）处理组,其中各浓度辅酶Q10预处理组以辅酶Q10预处理后暴露于TBHP,光学显微镜下观察各组RPE细胞的形态;用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组RPE细胞活性的变化;AnnexinV—FITC／PI染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;TBARS法检测细胞的脂质过氧化水平;用DCFH—DA荧光法检测细胞内活性氧簇（ROS）水平;实时定量PCR法检测RPE细胞中促凋亡基因FasmRNA的表达;Westernblot法检测细胞中Fas蛋白的表达。结果单纯TBHP处理组RPE细胞贴壁数量较正常对照组明显减少,而0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组贴壁细胞数较单纯TBHP处理组增加,高浓度辅酶Q10预处理组细胞形态的改善和细胞存活的数目更接近正常对照组。与单纯TBHP处理组比较,1μmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组RPE细胞吸光度（A450）值明显增高（0．52±0．10VS．0．25±0．03、0．59±0．06VS．0．25±0．03）,差异均有统计学意义（P=0．041、0．002）;RPE细胞的凋亡率明显下降[（72．1±6．6）％VS．（91．7±2．3）％、（69．0±4．4）％VS．（91．7±2．3）％],差异均有统计学意义（P=0．032、0．004）;0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组的细胞脂质过氧化水平依次降低,与单纯TBHP处理组比较差异均有统计学意义（P=0．047、0．030、0．015）,与单纯TBHP组相比,0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞内ROS水平逐渐下降,I;xmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞内ROS水平明显低于单纯TBHP处理组（5．25±0．90 vs11．39±2．30、7．91±0．80VS．11．39±2．30）,差异均有统计学意义（P=0．028、0．007）;与单纯TBHP处理组相比,辅酶Q10预处理组细胞中FasmRNA表达量均有不同程度的下降,1μmol／L、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞中FasmRNA表达量的差异均有统计学意义（P=0．049、0．008）;0．01、1、100μmol／L辅酶Q10预处理组细胞中Fas蛋白表达量均明显下降,差异均有统计学意义（P=0．001、0．000、0．000）。结论辅酶Q10对体外培养的人RPE细胞具有保护作用,其作用在一定范围内呈浓度依赖性,这种保护作用可能与减少细胞的氧化应激损伤和抑制细胞凋亡有关。     

高糖条件下人视网膜色素上皮细胞的上皮-间质转化

背景 研究证实,有多种细胞参与增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发生和发展过程,其中RPE细胞的上皮-间质转化(EMT)可能与PVR有关,其主要生物学行为是RPE细胞的增生和迁移.已证实高血糖是糖尿病视网膜病变(DR)发病的主要原因,而高糖条件下RPE细胞是否发生EMT鲜有报道. 目的 建立体外高糖细胞培养模型,探讨高糖对人RPE的迁移能力及EMT的影响.方法 用含质量分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基对人RPE细胞D407细胞株进行体外培养和传代,取6～8代细胞用于实验.依据培养液中血糖浓度的不同将细胞分为3个组,正常对照组培养基中葡萄糖终浓度为5.5 mmol/L,高糖培养组葡萄糖终浓度为60.0 mmol/L,用含5.5 mmol/L葡萄糖和甘露醇的DMEM培养基培养细胞作为高渗对照组.采用细胞划痕试验法检测划痕后0、24、48和72 h时3个组RPE细胞的迁移率,用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测高糖培养组在培养不同时间点RPE细胞间质化标志物闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA在细胞中的相对表达水平.结果 正常对照组培养的RPE细胞呈多角形,核仁清晰,排列致密;高糖培养组随着培养时间的延长,RPE细胞逐渐变大、变长,细胞结构不清,排列紊乱;高渗对照组细胞结构接近正常对照组.划痕试验显示,高糖培养组在划痕后48 h可见细胞迁移,划痕后72 h划痕基本消失,而正常对照组和高渗对照组划痕仍然存在.划痕后各时间点高糖培养组细胞迁移率明显高于正常对照组和高渗对照组,组间和各时间点的差异均有统计学意义(F分组=328.600,P=0.000;F时间=773.270,P=0.000).RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,高糖培养后48 h、72 h组细胞中ZO-1 mRNA的表达水平明显低于正常对照组,而α-SMA mRNA的表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 高糖条件下RPE细胞的迁移能力增强,发生EMT改变,可能参与增生性糖尿病视网膜病变(PDR)的发生.     

枸杞多糖对高糖所致RF/6As通透性和Rho激酶的影响

目的探讨高糖条件下猴脉络膜-视网膜内皮细胞（RF/6As）损伤时的单层通透性、Rho激酶1（ROCK1）的变化及它们之间的关系,和枸杞多糖（LBP）对上述变化的影响。方法体外培养RF/6As,分为等渗葡萄糖处理组（对照组）、40mmol/L葡萄糖处理组（高糖组）及LBP＋40mmol/L葡萄糖处理组（LBP＋高糖组）。各组分别培养1、3、5、7d,应用倒置显微镜观察培养的RF/6As形态,以辣根过氧化物酶（HRP）作为示踪剂用二室弥散系统检测RF/6As单层通透性的变化,应用免疫荧光法观察各组不同时间点细胞骨架的变化,采用Westernblot法检测ROCK1在5d、7d各组细胞中的表达量。结果第3、5、7天,高糖组RF/6As随时间延长逐渐变形,正常细胞数量明显减少,单层通透性逐渐增加;3个时间点HRP的A值分别为0.074±0.011、0.135±0.022、0.253±0.047,明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0.01）。LBP＋高糖组仅于7d时细胞形态略有改变,5d及7d时HRP的A值分别为0.069±0.004和0.114±0.009,较对照组明显增加,差异均有统计学意义（P〈0.01）;但明显低于高糖组,差异均有统计学意义（P〈0.01）。Westernblot检测显示,7d时LBP＋高糖组ROCK1灰度值为35849.47±1032.36,高糖组为21356.10±1566.66,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论高糖可引起RF/6As单层通透性增加和细胞骨架的重排以及ROCK1的高表达,而LBP可通过下调ROCK1的表达减轻高糖对RF/6As的损伤。     

曲安奈德对高糖培养RPE细胞ICAM-1和ILK表达的影响

目的 检测高糖诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和整合素连接激酶(integrin-)linked kinase,ILK)的表达,并观察曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)时二者表达的影响,探讨炎症在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)发病过程中的作用.方法 体外培养人RPE细胞,应用免疫荧光细胞染色法、Western-blot法,分别检测在低糖对照组(5.6 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)、高糖组(30.0 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)、TA组(0.1 mol·L-1TA+30.0 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养液)RPE细胞ILK和ICAM-1蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测二者mRNA的表达.结果 Western-blot和免疫荧光细胞染色都显示RPE细胞在高糖组培养6 h时ICAM-1表达量最高,为0.378±0.012,是对照组0.220±0.008的1.71倍,TA对其表达有抑制作用,抑制率为26.98%(P＜0.05);高糖组作用2 h ILK蛋白表达量最高,是对照组的1.45倍,TA组中虽然ILK表达量较高糖组减少(为高糖组的76.20%),但差异无统计学意义(P＞0.05),TA对其表达无明显抑制作用.而实时荧光定量PCR检测显示在在高糖组作用1 h后RPE细胞表达ICAM-1、ILK mRNA开始上升,ICAM-1 mRNA表达在2 h达到高峰,2 h时TA对高糖组ICAM-1 mRNA的抑制率为83.67%,差异具有统计学意义(P＜0.05).TA组ILK mRNA的表达与高糖组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RPE细胞在高糖环境下能高表达ICAM-1和ILK,高糖对RPE细胞表达ICAM-1的上调作用能被糖皮质激素TA抑制,而ILK的上调不受其抑制,提示炎症在早期DR病理过程中有重要作用,RPE细胞可能通过这两种因子的信号途径参与DR的病变.     

灯盏花素通过调节Bcl-2和Bax表达拮抗高糖诱导的RPE细胞损伤

目的:探讨灯盏花素对高糖环境下人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激的影响。方法:常规培养RPE细胞,分为对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为30mmol/L)、灯盏花素低浓度组(30mmol/L葡萄糖+1μmol/L灯盏花素)和灯盏花素高浓度组(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L灯盏花素)。细胞划痕实验观察RPE细胞的迁移性,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平变化,Hoechst染色法观察凋亡细胞比例,Western blot分析各组Bcl-2和Bax的变化。结果:细胞划痕实验结果显示,灯盏花素低浓度组和灯盏花素高浓度组RPE细胞形态较高糖组改善,细胞迁移性较高糖组增加;CCK-8结果显示,用1、10μmol/L浓度的灯盏花素处理后,RPE细胞存活率分别提高到61.06%±5.59%和79.81%±7.04%,与高糖组(40.63%±4.72%)比较有差异(P<0.05);2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)荧光探针染色结果显示,灯盏花素抑制了RPE细胞内ROS水平;Hoechst染色法显示,1、10μmol/L灯盏花素处理后发生凋亡的RPE细胞数量逐渐减少;Western blot结果显示,灯盏花素增强了Bcl-2蛋白的表达,降低了Bax蛋白的表达。结论:灯盏花素可以抑制高糖诱导的RPE细胞氧化损伤和凋亡的发生,为糖尿病视网膜病变的治疗靶点研究提供了理论支持。     

视黄酸对豚鼠离焦性近视眼视网膜色素上皮通透性的调控

背景视网膜视黄酸在离焦性近视形成中起重要作用,但目前尚不清楚其如何通过视网膜色素上皮（RPE）屏障向脉络膜传递近视信号。目的研究全反式视黄酸（atRA）对离焦性近视眼RPE屏障功能的影响。方法21日龄清洁级三色豚鼠30只,用随机数字表法分为正常对照组和离焦组,一6D凹透镜缝合于离焦组豚鼠左眼15d以制备离焦性近视模型,每天光照与黑暗周期为12h／12h。用角膜曲率计测量各组豚鼠的角膜曲率半径,行复方托吡卡胺滴眼液扩瞳检影验光以测量豚鼠眼球屈光度,应用A型超声法测量各组豚鼠的眼轴长度。于造模15d时处死动物并分离视网膜,体外培养RPE细胞并传代,将第3代RPE细胞用于实验,制备视网膜铺片,接种于Millcell—PET微孔滤膜插入式培养池,分别加入1×10-6、1×10-7、1×10-8和1×10-9mol／LatRA培养RPE细胞24h,以加入等体积atRA溶剂的培养孔作为阴性对照,以完全培养基加MTT溶液的无细胞孔作为空白对照。采用MTT比色法检测各组RPE细胞的存活率,用CN10一EVOM2型电阻测量仪测定单层细胞跨上皮电阻（TER）,计算RPE细胞的TER值,采用FM1-43型荧光染色技术检测得出RPE细胞FM1-43阳性荧光染色的相对强度值,评价RPE细胞膜泡运输变化。结果豚鼠模型眼屈光度为（-2．20±O．95）D,对照组为（＋1．15±0．30）D,差异有统计学意义（t=14．57,P〈0．01）;豚鼠模型眼的眼轴长度为（8．24±0．09）mm,明显长于对照组的（7．81±0．05）mm,差异有统计学意义（t=17．20,P〈0．01）。原代培养豚鼠近视眼的RPE细胞,取第3代细胞用于实验。RPE细胞接种于Millcell培养池1周后细胞长满滤膜,呈单层生长。加入atRA干预24h,RPE细胞的存活率随药物浓度的升高而逐渐降低,1×10^-9 mol／LatRA组RPE细胞存活率为93．3％,1×10-8mol／LatRA组为88．2％,1×10-6mol／LatRA组和1×10-7mol／LatRA组的RPE细胞大量死亡。不同浓度atRA组RPE细胞的TER值和RPE细胞FMl_43阳性荧光染色的相对强度值的总体比较差异均有统计学意义（F：43．89,P=0．00;F=26．13,P=0．00）,其中1×10-mo[／LatRA组RPE细胞的TER值为（107．32±9．58）Ω）／cm2,荧光染色强度为55．29±9．79,均明显高于1×10-、1×10-、1×10-mol／LatRA组,差异均有统计学意义（P〈0．05）,FMl_43荧光染色部位主要在RPE细胞的细胞膜和细胞质。结论AtRA能够通过增加豚鼠近视眼RPE的紧密连接功能及膜泡运输改变RPE细胞的屏障功能。     

SC79对高糖诱导RPE细胞凋亡的拮抗作用及其对AKT-XIAP信号通路的调控机制

目的探讨特异性AKT激活剂SC79对体外高糖诱导人视网膜色素上皮(ARPE)-19细胞凋亡的拮抗作用及其潜在机制。方法将体外培养的ARPE-19细胞分别置于含5、10、20 μg/ml SC79的高糖(30 mmol/L葡萄糖)培养液中培养6、12、24 h, 根据细胞增生率探索最佳的作用浓度和作用时间。将细胞分为4个组, 其中正常对照组、甘露醇组和高糖组、分别于含5.6 mmol/L葡萄糖正常培养液、含5.6 mmol/L葡萄糖和24.4 mmol/L甘露醇培养液、高糖培养液中培养48 h, 高糖+SC79组细胞于含10 μg/ml SC79正常培养液中培养12 h, 然后于高糖培养液中继续培养36 h。采用MTS法检测细胞的增生率, 采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率, 采用Western blot法检测磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、caspase-9、caspase-3及活化片段active-caspase-3的相对表达量。将细胞分为Neg-shRNA组、AKT shRNA组和空白对照组分别加入相应转染复合物和无血清培养基, 采用实时荧光定量PC...     

全反视黄酸对豚鼠视网膜色素上皮细胞分2泌TGF-β2及细胞内第二信使IP3和cAMP的影响

目的观察全反视黄酸（ATRA）对培养的豚鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖以及分泌转化生长因子p2（TGF—β2）的影响，并观察细胞内第二信使cAMP和IP3的含量变化。方法培养原代豚鼠RPE细胞，传2代后用于实验。实验分3组进行。第1组用不同浓度ATRA（5×10^-6、10×10^6、40×10^-6mol／L）作用于豚鼠RPE细胞，24h后用MTT法检测细胞增殖情况。第2组加入10×10^-6mol／L的ATRA．分别于2、4、6、8、16h后收集培养液，用ELISA方法检测RPE细胞TGF—β2的分泌量。第3组以10×10^-6mol／L的ATRA作用于豚鼠RPE细胞．分别于0min、5min、30min、2h、6h后收集细胞裂解液。行放射免疫和ELISA方法检测细胞内cAMP和IP3的含量变化。每组均以等量溶剂DMSO作为对照。对不同浓度ATRA组间MTT结果行方差分析，其余实验组与对照组间比较行配对t检验。结果5×10^-6、10×100、40×100mol／LATRA作用RPE细胞24h后，DD值分别为0．099±0．008、0．117±0．008、0．087±0．011。与对照组（0．103±0．017）比较，40×10^-6mol／LATRA作用时OD值显著降低，差异有统计学意2（P〈0．05），其他浓度组与对照组相比差异无统计学意义（p〉0．05）。10×10^-6／mol／L的ATRA作用RPE细胞后，TGF—β2的分泌量在作用2、4、6h时较对照组明显升高，差异均有统计学意义（P〈0．05）．8h时无明显变化，16h时降低（P〈O．05）。10×10^-4mol／L的ATRA作用于豚鼠RPE细胞后，IP3的含量在各时间点均较对照组显著下降，且随时间的延长下降越明显；cAMP的含量只有在作用30min和2h时升高．其他时间变化不明显。结论浓度为40×10^-6mol／L的ATRA对豚鼠RPE细胞的增殖有抑制作用。10×10^-6mol／L的ATRA作用RPE细胞后．TGF-β2的分泌量在6h内增加，之后随时间延长而降低。ATRA对RPE细胞的作用可能与IP3的下降有关。     

高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨高糖条件下促红细胞生成素（EPO）受体mRNA及蛋自在人脐静脉内皮细胞（UVECs）的表达差异。方法体外常规培养人UVECs细胞株,实验组分别给予22mmol／L葡萄糖作用12、24、48、72h,5．5mmol／L葡萄糖组（生理糖浓度）设为正常对照组,5．5mmol／L葡萄糖＋16．5mmol／L甘露醇组为渗透压对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫细胞化学法对高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白的表达进行检测。结果正常对照组和渗透压对照组相比,人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。人UVECs在22mmol／L高糖作用12、24、48、72h后,EPO受体mRNA和蛋白表达均显著高于正常对照组（P〈0．05）,且随着时间的延长,EPO受体mRNA和蛋白的表达均逐渐增加。结论高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达均增强,且呈时间依赖性。人UVECs在22mmol／L高糖条件下EPO受体mRNA及蛋白表达的增加与渗透压无关。     

高糖诱导的人晶状体上皮细胞葡萄糖关键代谢酶的表达

目的：探讨葡萄糖关键代谢酶在高糖诱导的人晶状体上皮(HLEB3)细胞中的表达情况。

方法：将体外培养的HLEB3细胞分为正常对照组(采用DMEM培养液培养,含葡萄糖5mmol/L)、氧化应激组(采用含H₂O₂ 200μmol/L的DMEM培养液培养)、高糖诱导组(采用含葡萄糖30mmol/L的培养液培养),培养24h后检测细胞凋亡情况和细胞活力及6种葡萄糖关键代谢酶(6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶、柠檬酸合成酶、α-酮戊二酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶)的mRNA表达情况。

结果：高糖诱导HLEB3细胞凋亡,高糖诱导组(63.43%±3.40%)细胞活力低于正常对照组(100.00%±0.00%)和氧化应激组(91.90%±5.11%),且高糖诱导组细胞6种葡萄糖代谢关键酶的mRNA表达水平均低于正常对照组和氧化应激组(均P<0.05)。

结论：高糖可以诱导HLEB3细胞葡萄糖关键代谢酶的表达水平降低,诱导细胞凋亡,影响细胞活性。     

线粒体靶向抗氧化剂SS31对人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响

背景老视是影响中老年视觉质量和生活质量的主要原因之一,主要与晶状体上皮细胞（LECs）随年龄增长而发生的氧化损伤有关。SS31是线粒体靶向的抗氧化剂,研究其对LECs氧化损伤的保护作用对老视的预防和治疗有重要意义。目的探讨SS31对叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导的人LECs氧化损伤的保护作用。方法用含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM低糖培养液对人LECs细胞株HLEB．3进行培养和传代,用200μmol／Lt-BHP处理HLEB一3细胞18h以构建细胞氧化损伤模型。培养的细胞分为空白对照组、t-BHP模型组、10nmol／LSS31±T—BHP组、100nmol／LSS31±T—BHP组、1μmol／LSS31±T—BHP组、10μmol／LSS31±T—BHP组和100μmol／Lt-BHP组,应用噻唑蓝（MTT）法检测各组细胞的存活率,以筛选SS31的最佳药物浓度。再将培养的细胞分为空白对照组、t-BHP模型组和1p~mol／LSS31±t．BHP共培养组。采用JC-1染色法并用流式细胞仪检测各组HLEB一3细胞线粒体膜电位的改变,用MitoSOX染色在荧光显微镜下检测各组活细胞线粒体中产生活性氧簇（ROS）的情况。结果200μmol／Lt-BHP加入培养液作用HLEB一3细胞18h后,与空白对照组的细胞存活率（100±0）％比较,模型组细胞存活率下降至（53．424-2．52）％,不同浓度的SS31组细胞存活率均较模型组明显升高,各组细胞存活率的差异有统计学意义（F=58．349,P〈0．01）,其中以1μmol／LSS31组细胞存活率最高（82．134-3．15）％,明显高于t-BHP模型组,差异有统计学意义（t=28．710,P〈0．05）。各组HLEB-3细胞线粒体膜电位检测结果提示,正常对照组红／绿荧光强度比值为7．07±0．06,t-BHP模型组为4．46±0．14,1μmol／LSS31±t—BHP共培养组为5．76±O．26,3个组间差异有统计学意义（F=172．332,P〈0．01）,空白对照组和1Izmol／LSS31±t—BHP共培养组红／绿荧光强度比值均明显高于t-BHP模型组,差异均有统计学意义（扛2．609、1．303,P〈0．001）。荧光显微镜下显示正常对照组HLEB一3线粒体内仅可见微弱的ROS红色荧光,t-BHP模型组细胞线粒体内ROS荧光明显增强,红色荧光染色的细胞明显增多,而1μmol／LSS31±t—BHP共培养组细胞线粒体内ROS荧光明显弱于t-BHP模型组。结论SS31能有效预防t,BHP诱导的HLEB-3细胞的氧化损伤,可能是治疗老视和其他年龄相关性晶状体疾病一个潜在的靶向治疗手段。