超声微泡介导CNTF基因眼内转染对视神经损伤大鼠作用的研究

背景选择理想的基因载体是当前基因研究和治疗的前提与关键,超声微泡造影剂作为一种新型的基因载体,可安全、快速、有效地增强目的基因的转染和表达。目的观察超声微泡造影剂介导睫状神经营养因子（CNTF）基因转染视神经损伤大鼠对视功能及视网膜神经节细胞（RGCs）存活的影响。方法SD大鼠60只随机分为正常对照组、假伤组、单纯损伤组、单纯质粒组、质粒＋超声组、超声微泡组。采用钳夹大鼠右眼视神经法制作视神经损伤大鼠模型,然后各处理组大鼠分别接受相应的干预处理。质粒采用玻璃体腔注射法注入,超声则采用辐照法进行干预。造模前1d和损伤后第7天检测每组大鼠闪光视觉诱发电位（F—VEP）,并于第7天处死各组大鼠。应用荧光金逆行标记法计数各组大鼠RGCs存活数,采用实时定量聚合酶链反应（real—timePCR）检测大鼠视网膜中CNTFmRNA的表达量。结果损伤后第7天,单纯损伤组大鼠F—VEPP．波的隐含时较单纯质粒组、质粒＋超声组和超声微泡组明显延长,超声微泡组P,波的隐含时短于单纯质粒组和质粒＋超声组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。单纯质粒组、质粒＋超声组和超声微泡组F—VEPP,波的振幅均高于单纯损伤组,超声微泡组高于单纯质粒组和质粒＋超声组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。超声微泡组大鼠与正常对照组比较P,波振幅降低,差异有统计学意义（P〈0．05）。单纯质粒组、质粒＋超声组和超声微泡组平均RGCs数目均明显高于单纯损伤组,超声微泡组平均RGCs数多于单纯质粒组和质粒＋超声组,但少于对照组及假伤组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。超声微泡组CNTFmRNA表达量高于正常对照组、假伤组、单纯损伤组、单纯质粒组和质粒＋超声组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论超声微泡能增强CNTF基因在眼内的转染及表达,对视神经损伤大鼠RGCs早期有明显的保护作用,可有效促进视功能的恢氪．     

KAI1对HXO—Rb44细胞同质性黏附、迁移和侵袭能力的影响

目的研究肿瘤转移抑制基因KAI1对人视网膜母细胞瘤HXO．Rb44细胞黏附力、运动力和侵袭力的影响。方法实验研究。应用脂质体转染法将含KAI1的真核表达质粒pCMV—KAI1转染人HXO—Rb44细胞株,命名为HXO—Rb44-KAI1,使其KAI1蛋白过表达。以转染空载体质粒pcDNA3．1（＋）及未转染质粒的HXO—Rb44细胞作为对照,分别命名为HXO—Rb44．KAI1／zero及HXO—Rb44。质粒转染48h后,吹散细胞,显微镜下观察三组细胞的同质性黏附情况;应用Transwell小室及其联合Matrigel分别进行迁移和侵袭实验。100倍光镜下观察进入Transwell下室的细胞并随机选取5个视野进行细胞计数,采单因素方差分析对三组细胞的迁移和侵袭能力进行比较。结果质粒转染48h后,PCR及WesternBlot显示HX0-Rb44-KAI1细胞的KAI1表达明显强于HXO-Rb44-KAI1／zero及HXO—Rb44细胞。HXO—Rb44-KAI1细胞的同质性黏附力明显强于HXO-Rb44-KAI1／zero及HXO—Rb44细胞。Transwell迁移实验显示,100倍镜下下室中平均每视野细胞数,HXO—Rb44-KAI1组为（20．4±4．0）个,HXO-Rb44-KAI1／zero组为（46．0±4．5）个,HXO-Rb44组为（52．1±3．6）个,差异有统计学意义（F=256．71,P〈0．01）。侵袭实验显示100倍镜下下室中平均每视野细胞数,HXO—Rb44-KAI1组为（16．7±3．3）个,HXO—Rb4J4．KAI1／zero组为（42．5±3．7）个,HXO—Rb44组为（47．3±5．2）个,差异有统计学意义（F=235．12．P〈0．01）。结论KAI1可显著增强HXO—Rb44细胞同质性黏附力,抑制其运动力和侵袭力。     

NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞对视网膜母细胞瘤细胞的特异性

背景目前用细胞免疫的方法治疗视网膜母细胞瘤（RB）成为新的研究热点,肿瘤-睾丸抗原是最具免疫原性的人类肿瘤抗原之一,已用于全身一些肿瘤的免疫治疗,但其对RB治疗作用的研究报道较少。目的探讨肿瘤-睾丸抗原的NewYork—esophageal-1（NY—ESO-1）致敏树突状细胞（DCs）诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对RB细胞株HXO—RB44的杀伤作用。方法用聚合酶链反应（PCR）技术对NY—ESO-1质粒的目的基因片段进行扩增,使用SalⅠ限制酶和EcoRI限制酶进行双酶切,切胶回收DNA片段。将其连接入pDC316质粒,构建pDC316／NY—ESO．1真核表达载体并再进行酶切鉴定。免疫荧光及Western blot法检测NY—ESO-1蛋白在HXO．RB44细胞株中的表达。Ficoll法分离血获得单个核细胞,通过RPMI1640重悬,调整细胞密度为1×10。个／ml,通过重组人集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素4（rhlL-4）诱导培养外周血来源的DCs,通过重组质粒转染DCs,以脂多糖诱导DCs成熟,DCs与淋巴细胞数量比为1：25的比例混合培养HXO．RB44细胞,通过MTT法检测CTL的增生情况。在培养液中同时加入CTL细胞,MTT法检测HXO—RB44细胞的活力。结果重组质粒pDC316／NY—ESO-1的目的片段序列与NY-ESO-J基因序列完全相同,酶切鉴定结果与预期一致。Western blot法以及免疫荧光检测结果显示,NY—ESO．1在细胞株HXO．RB44中呈强阳性表达。经rhGM．CSF和rhlL-4成功诱导出的外周血DCs,重组质粒转染后其表型分子分别是HLA—DR为42．1％,CD80为54．2％,CD83为39．7％,CD86为94．8％。MTT法检测表明,pDC316／NY—ESO-1质粒转染的DCs诱导的CTL组的增生能力强于未转染组,致敏的DCs与淋巴细胞比例为1：100时诱导CTL效果最为显著,与未转染组比较差异有统计学意义（P〈0．05）,CTL对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于未转染组和无DCs组,且效靶比为75：1时杀伤率最强,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NY—ESO-1质粒转染DCs诱导的CTL对RB细胞具有特异性杀伤作用,为RB免疫治疗提供了一种新的方法。     

Kruppel样因子6抑制人晶状体上皮细胞增生的研究

背景 研究表明,Kruppel样因子6（KLF6）与生长发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程有关.在眼科领域,关于人晶状体上皮细胞（LECs）中KLF6蛋白表达水平及KLF6对LECs增生的影响报道较少. 目的 探讨KLF6对LECs株（HLE-B3）增生的抑制作用. 方法 首先用逆转录PCR（RT-PCR）法构建真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6,并用双酶切法和PCR法对表达质粒进行鉴定.用含体积分数10％胎牛血清的低糖DMEM对HLE-B3进行培养和传代,按照干预方法的不同将培养的HLE-B3分成4个组,各组均给予KLE-B3转染试剂,空白对照组不加入任何外源质粒及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）;单纯IGF-1刺激组仅给予IGF-1刺激;空质粒转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2质粒空载体,同时给予IGF-1刺激;pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒,且给予IGF-1刺激.细胞干预24 h后,采用水溶性四唑盐-1（WST-1）实验检测各组细胞的吸光度（A450）值;采用Western blot法测定各组细胞中KLF6蛋白的表达水平.以1＆#215;104个/片的密度将HLE-B3细胞爬片培养24 h,并分别将0、0.10、0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染到各组铺片细胞中,用终质量浓度为50 μg/L的IGF-1刺激24 h,然后应用免疫细胞化学技术检测各组细胞中Ki-67蛋白的相对表达量;采用荧光半定量PCR法检测各组细胞中Ki-67 mRNA的表达变化.结果 扩增得到的PCR产物反应条带与KLF-6基因长度相符,PCR和EcoR I、Sal I限制性内切酶双酶切法鉴定条带大小与预期相符,成功构建pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒.WST-1实验显示空白对照组、单纯IGF-1刺激组、空质粒转染＋IGF-1组和pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞A值分别为0.86±0.00、2.10±0.01、2.24±0.12和1.06±0.02,4个组间差异有统计学意义（F=38.322,P＜0.05）,其中pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组A值明显低于单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组,差异均有统计学意义（q=6.42、7.31,P＜0.05）.Western blot法检测显示,4个组间细胞中KLF6蛋白相对表达量的差异有统计学意义（F=591.858,P＜0.05）,pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组KLF6蛋白相对表达量分别是空白对照组、单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组的1.47、2.04、3.27倍.Ki-67蛋白在pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞中的表达强度随质粒转染剂量的增加而逐渐减弱,0.10 μg和0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染后细胞中Ki-67 mRNA相对表达值分别为0.15±0.08和0.11±0.03,明显低于0μg pEGFP-C2-KLF6转染的细胞0.77±0.12,组间的总体差异有统计学意义（F=54.825,P＜0.05）. 结论 KLF-6能够抑制IGF-1诱导的HLE-B3的增生,是HLE-B3细胞增生的调控因子.     

转染Smad7基因的人眼球筋膜囊成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白及纤维连结蛋白表达的改变

目的观察转染Smad7基因的人眼球筋膜囊成纤维细胞（HTFs）Ⅰ型胶原蛋白和纤维连结蛋白表达的改变。方法用Nucleofector^TM核酸转染仪将含有Smad7的真核表达质粒转染至HTFs。采用实时定量逆转录聚合酶链反应法检测Ⅰ型胶原蛋白及纤维连结蛋白mRNA表达的改变。采用放射免疫法检测Ⅰ型前胶原羧端肽原（PICP）在培养液中浓度的改变,检测经转化生长因子β2（TGF-β2,10ng／ml）作用后以上指标的改变。以未转染HTFs和转染空质粒的HTFs作为对照。结果成功将含有Smad7基因的质粒转染至HTFs,并证明其Smad7基因mRNA表达明显升高。转染Smad7的HTFsⅠ型胶原蛋白mRNA表达率为（89．53±9．37）％,分别是对照组HTFs的40．47％和pCMV5-HTF8的37．94％。培养液中PICP浓度为（15．29±2．18）ug／L,分别是对照组HTFs的52．10％和pCMV5-HTFs的57．35％。转染Smad7的HTFs能够明显拮抗由TGF-β2作用引起的Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达和PICP浓度升高（P〈0．01）;无论是否有TGF-β2作用,转染Smad7的HITs纤维连结蛋白mRNA的表达与对照组相比,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论Smad7能降低HTFsⅠ型胶原蛋白mRNA表达和Ⅰ型胶原蛋白的合成,但对纤维连结蛋白mRNA表达无明显作用。     

质粒介导RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮生长因子表达

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shRNA）表达质粒稳定转染对视网膜母细胞瘤（RB）细胞中VEGF表达的作用。方法构建VEGF shRNA表达质粒p4．1CMV—VEGF shRNA,以脂质体介导其转染两种RB细胞系SO—RB50和HXO—RB44,新霉素筛选结合梯度稀释法获得p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞单克隆,继续培养扩增建立p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞,用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测RB细胞中VEGF基因的表达,并用酶联免疫吸附（ELISA）法检测RB细胞上清中VEGF蛋白的表达;以与哺乳动物基因组无同源性的shRNA表达质粒p4．1CMV—Neg shRNA作为阴性对照,同时以未做任何处理组作为空白对照。结果成功构建p4．1CMV—VEGF shRNA并获得其表达阳性的RB细胞克隆。阴性对照组和空白对照组SO-RB50细胞的VEGF基因表达量分别为实验组的5．02倍和6．32倍;阴性对照组和空白对照组HXO—RB44细胞分别为实验组的5．70倍和4．86倍。实验组SO—RB50细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（187．69±83．89）μg/L,显著低于阴性对照组（822．98±187．98）μg/L和空白对照组（865．76±170．33）μg／L,差异有统计学意义（均P〈0．01）;实验组HXO—RB44细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（162．20±66．33）μg／L,与阴性对照组（764．33±164．79）μg／L和空白对照组（828．22±145．94）μg／L比较,差异也有统计学意义（均P〈0．01）。结论VEGF shRNA表达质粒稳定转染可高效抑制RB细胞中VEGF的表达,靶向VEGF的RNA干扰可作为拮抗VEGF并治疗RB的有效手段。（中华服科杂志,2007,43：493-498）     

视网膜母细胞瘤基因对视网膜母细胞瘤移植瘤细胞周期的影响

目的 观察外源性视网膜母细胞瘤基因(Rb基因)对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)移植瘤细胞周期的影响。 方法 在建立裸鼠眼玻璃体腔RB移植瘤模型及构建Rb基因的逆转录病毒表达载体PBabe-Rb的基础上,用脂质体Dosper介导法将Rb基因导入裸鼠RB移植瘤,流式细胞仪检测RB移植瘤细胞周期变化。 结果 Rb基因在RB移植瘤内的表达使RB移植瘤G₁期细胞数明显增加,DNA指数及S期百分比值有所降低。 结论 外源性Rb基因可部分抑制RB移植瘤细胞周期的进程。（中华眼底病杂志,2000,16：1-70）     

视网膜新生血管形成过程中VEGF对TGF-β表达的影响——生长因子冗余性的初步探索

目的：研究早产儿视网膜病变新生血管形成过程中VEGF对TGF-β表达的影响。方法：体外培养人视网膜血管内皮细胞（HRCECs），分别转染重组腺相关VEGF病毒和VEGF的RNA干扰质粒到HRCECs，增高和抑制VEGF的表达，通过二氯化钴诱导HRCECs缺氧，观察TGF-β在不同VEGF水平下的mRNA表达变化，同时观察HRCECs增殖的变化。结果：高表达VEGF组（C组），低表达VEGF组（D组），阴性对照组（E组），阳性对照组（F组）的VEGF／actin分别为：1．15±0．77，0．36±0．31，0．28±0．16，0．83±0．72；而TGF-β／actin为：0．55±0．39，0．92±0．57，0．18±0．07，0．70±0．45，当VEGF高表达，TGF-β的mRNA表达下调；在VEGF低表达时，TGF-β的mRNA表达上调。结论：TGF-β能部分代偿VEGF的功能，视网膜新生血管形成过程中生长因子具有冗余性。     

全反式维甲酸诱导的Cx43基因在RB细胞中的过表达及其对RB生长的抑制作用

背景诱导细胞间隙连接蛋白（＆）基因在瘤细胞中过表达是全反式维甲酸（ATRA）抑制肿瘤细胞生长的重要机制。我们先前的研究已证实,ATRA抑制视网膜母细胞瘤（RB）细胞增生、分化作用的机制与诱导Cx43过表达有关,但药物作用位点及其对在体肿瘤组织生长的影响尚未明确。目的研究ATRA对RB细胞中Cx43基因及其蛋白表达的影响,探讨其作用机制。方法用无水乙醇将ATRA溶解并配制成浓度为1×10^-2mol／L的溶液,使用前再用细胞培养液配制成不同浓度ATRA液。用含体积分数10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液常规培养人RB细胞株HXO—RB44,将1×10^5-×10“和1×10^-2mol／L的ATRA分别加至培养基中,分别于添加后2、4、6d采集细胞,分别采用Westernblot法和逆转录PCR法检测细胞中Cx43蛋白及mRNA的表达变化。选取15只BALB／c裸鼠,将RB细胞悬液1恤l（含5×10^5个细胞）进行裸鼠右眼前房注射,建立裸鼠眼前房RB模型。将造模成功的11只裸鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和1X10。mol／LATRA组,阴性对照组和1×10^-5mol／LATRA组裸鼠分别行0．5％无水乙醇的生理盐水或1×10^-5mol／LATRA前房注射,每3天1次,共注射3周,裂隙灯显微镜下观察各组裸鼠肿瘤生长情况;实验结束时摘除实验眼,用苏木精-伊红染色法进行组织病理学检查。结果Westernblot法检测结果显示,随ATRA作用时间的延长,各组Cx43蛋白表达量（Acx43／AGPDH）均逐渐增加,总体比较差异有统计学意义（F时间=71．31,P=0．00;F分组7．66,P=0．00）;药物作用后2d1×10^-5mol／LATRA组、作用后4d1×10^-6mol／LATRA组、作用后6d1×10^-7mol／LATRA组Cx43蛋白表达量均明显高于空白对照组,差异均有统计学意义（t=3．34,P〈0．叭;t=2．33,P〈0．05;t=3．12,P〈0．01）。逆转录PCR检测结果显示,随ATRA作用时间的延长,各组Cx43 m     

人转化生长因子β诱导基因真核表达载体的构建及其对人角膜上皮细胞增生的影响

背景人转化生长因子-β诱导（TGFBI）基因是第一个被确定的角膜营养不良的致病基因,而TGFBI引起角膜营养不良的机制目前尚不清楚,研究TGFBI的功能对于揭示角膜营养不良的发病机制及了解角膜生理及病理功能都具有重要意义。目的构建人TGFBI基因的真核表达载体并将其转染于人角膜上皮细胞,探讨其对角膜上皮细胞增生及相关基因表达的影响。方法从角膜移植后剩余的供体角膜中提取人正常角膜组织总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）合成TGFBI cDNA,将TGFBI胶回收产物与载体pCMV—N-HA分别进行双酶切,取连接产物10μl转化100μl大肠杆菌感受态DH5α克隆入真核表达载体pCMV—N—HA,以菌落PCR和EcoRV、XhoI双酶切法测序鉴定。设置重组质粒pCMV—N—HA—TGFBI转染组、空质粒pCMV—N—HA转染组、阴性对照组及pGFP—C2转染对照组,以测定重组质粒转染率。重组质粒pCMV-N—HA—TGFBI转染人角膜上皮细胞,激光共焦显微镜下观察转染pGFP—C2后增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达,用细胞计数试剂盒8（CCK-8法）检测转染细胞的增生情况,SYBR荧光实时定量PCR和Western blot法检测TGFBI、基质金属蛋白酶（MMPs）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）蛋白及其mRNA在转染后角膜上皮细胞的表达。结果pCMV—N-HA—TGFBI阳性克隆质粒进行经EcoRV和XhoI双酶切鉴定测序结果显示,扩增的TGFBI cDNA以正确序列和方式插入载体,pGFP—C2载体转染人角膜上皮细胞后48h共焦显微镜下可见EGFP的表达,转染效率为70％。重组质粒pCMV—N—HA-TGFBI转染组TGFBI mRNA的表达明显高于空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组,TGFBI蛋白仅在pCMV—N-HA．TGFBI转染组表达。CCK-8法显示重组质粒pCMV—N-HA-TGFBI转染组、空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组间角膜上皮的吸光度（A450）值的差异无统计学意义（F=3．34,P〉0．05）。荧光实时定量PCR结果显示,重组质粒pCMV-N—HA-TGFBI转染组中MMP,mRNA、MMP,mRNA转录水平比空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组均升高（P〈0．05）,而TIMP,mRNA则明显下降（P〈0．05）;Western blot结果证实MMP1、MMP3、TIMP1蛋白表达规律相同（P〈0．05）。结论人TGFBI基因真核表达载体可被成功构建并在人角膜上皮细胞中呈过表达。TGFBI可能是通过MMP1、MMP3及TIMP1的表达变化来增加细胞外基质的降解,从而参与角膜的某些生理病理过程。     

裸鼠视网膜下注射HXO-Rb_（44）细胞建立视网膜母细胞瘤动物模型

目的建立一种生物学行为更接近临床的视网膜母细胞瘤（Rb）动物模型。方法 Rb细胞取HXO-Rb44细胞系,培养于含质量分数10%胎牛血清的改良型RPMI-1640培养基内,细胞悬液密度调至（5.0～6.0）×106/mL备用。30只裸鼠,分为视网膜下组和玻璃体腔组,每组各15只鼠30只眼。2组注射HXO-Rb44细胞悬液后每天裂隙灯下观察裸鼠眼内Rb肿物生长情况,并于注射后21、28、35、42d,根据组织病理学检查统计成瘤情况,比较2组成瘤率。行Rb特异性标志神经元特异性烯醇酶（NSE）及酸性钙结合蛋白（S100）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学检测。结果视网膜下组和玻璃体腔组在注射后均观察到肿瘤在裸鼠眼内生长并逐渐增大。注射后21、28、35、42d,视网膜下组成瘤率高于玻璃体腔组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。免疫组织化学染色提示,Rb细胞质NSE表达较强,S100表达较弱,GFAP表达最弱。结论在同等条件下建立Rb动物模型,视网膜下注射的成瘤率高于玻璃体腔内注射者,且视网膜下注射建立的是原位肿瘤模型,生物学行为更接近临床。     

miR-101表达上调对视网膜母细胞瘤细胞的增殖及侵袭能力的抑制作用

目的　探究miR-101对视网膜母细胞瘤增殖及侵袭能力的影响。方法　收集31例视网膜母细胞瘤组织及7例正常视网膜组织。培养人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181及视网膜母细胞瘤系HXO-Rb44。Lipofectamine 2000转染HXO-Rb44细胞并分组:阴性对照（normal control,NC）1组［转染microRNA（miR）-101阴性对照物］、miR-101表达组（转染miRNA-101类似物）;NC 2组［转染组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶（EZH2）阴性对照序列］、siRNA-EZH2组（转染EZH2siRNA）、siRNA-EZH2+mimics组（转染EZH2siRNA和miRNA-101类似物）和EZH2+mimics组（转染EZH2表达载体和miRNA-101类似物）。正常HOX-Rb44细胞作为空白组。采用qRT-PCR检测miR-101、EZH2 mRNA表达,Western blot检测EZH2蛋白表达。MTT及Transwell实验分别测定细胞增殖及侵袭能力。荧光素酶报告基因实验确定miR-101和EZH2的靶向关系。裸鼠体内移植实验测定细胞体内增殖能力。结果　与正常视网膜组织和ACBRI-181细胞相比,视网膜母细胞瘤组织及HXO-Rb44细胞中miR-101的相对表达量均明显下调（均为P<0.05）。EZH2 mRNA及蛋白在miR-101表达组中的相对表达量均显著低于空白组和NC1组（均为P<0.05）。72~96 h,miR-101表达组的吸光度（A）值均显著低于空白组及NC1组（均为P<0.01）。miR-101表达组侵袭细胞数量（51±6）均显著低于空白组（97±11）及NC1组（92±8）（均为P<0.01）。EZH2是miR-101的靶基因。48~96 h,siRNA-EZH2组和siRNA-EZH2+mimics组的A值均显著低于空白组和NC2组（均为P<0.01）;72~96 h,siRNA-EZH2+mimics组的A值明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）;24～96 h,EZH2+mimics组的A值与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。siRNA-EZH2组侵袭细胞数量（48±4）和siRNA-EZH2+mimics组（38±3）均显著低于空白组（95±10）和NC2组（90±6）（均为P<0.01）,siRNA-EZH2+mimics组侵袭细胞数量明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）,EZH2+mimics组侵袭细胞数量与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。裸鼠体内移植5～7周,siRNA-EZH2组和siRNA-EZH2+mimics组的瘤体体积均显著低于空白组和NC2组（均为P<0.01）,siRNA-EZH2+mimics组的瘤体体积明显低于siRNA-EZH2组（P<0.05）,EZH2+mimics组的肿瘤体积与空白组和NC2组之间的差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　miR-101上调后可抑制HXO-Rb44细胞的增殖及侵袭能力,这可能是通过抑制EZH2表达实现的。     

8-Br-cAMP可上调人视网膜母细胞瘤HX O-Rb44细胞抑癌基因的表达

目的 探讨８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对人网膜母细胞瘤ＨＸＯ－Ｒｂ４４细胞抑癌基因表达的效应，方法 应用ＲＮＡ斑点印迹技术检测细胞ｐ１６、ｐ２１ｗａｆｌ、ｗｐ５３、ｍｐ５３和Ｒｂ的ｍＲＮＡ、应用免疫组化斑点印迷技术检测细胞Ｐ１６、Ｐ２１ｗａｆｌ、ＰＲｂ、ｃｄｋ２、ｃｄｋ４和ＰＣＮＡ蛋白质表达的免疫反应（ＩＲ）。结果 在斑点印迹标本上，人ＨＸＯ－Ｂｂ４４细胞ｐ１６、ｐ２１ｗａｆｌ、ｗｐ５３及Ｒｂ的ｍＲＮＡ信号     

视网膜母细胞瘤中NY-ESO-1、NY-SAR-35基因的表达及其临床意义

背景 视网膜母细胞瘤(RB)的免疫治疗因创伤小、针对性强而受到广泛关注,寻求相关免疫原性较强的肿瘤抗原是免疫治疗的基础.NY-ESO-I和NY-SAR-35是癌-睾丸抗原(CTA)中的两种基因,检测其在RB组织中的表达可为RB的免疫治疗研究提供依据. 目的 研究RB中NY-ESO-1 mRNA、NY-SAR-35 mRNA的表达情况,探讨将其用于RB特异性免疫治疗靶抗原的可能性. 方法 收集15例RB患儿组织为RB组、12例非肿瘤病变部位视网膜组织为非肿瘤病变组,及22例眼部因其他眼部病变进行手术治疗获取的正常相关眼组织标本为正常组.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测待测组织标本中NY-ESO-1mRNA、NY-SAR-35 mRNA的表达;并按随机数字表法抽取RT-PCR检测的阳性产物直接进行DNA测序,对检测结果与肿瘤病理分级、肿瘤大小、临床分期等临床指标进行分析.结果 15例RB组织中有6例标本表达NY-ESO-1基因,9例标本表达NY-SAR-35基因;在12例非肿瘤病变视网膜组织及22例眼部正常组织中均未见到NY-ESO-1基因和NY-SAR-35基因的表达.NY-ESO-1基因和NY-SAR-35基因的表达均与患者的性别(P=0.426、0.822)、年龄(P=0.180、0.464)、病理分型(P=0.744、0.582)、肿瘤大小(P=0.760、0.790)、临床分期(P=0.868、0.707)等临床相关指标无明显关联.结论 NY-ESO-1基因及NY-SAR-35基因均可特异性地高表达于RB组织中,其表达率明显高于其他全身肿瘤,有可能成为RB特异性免疫治疗的靶抗原.     

国产125I巩膜敷贴器治疗兔眼脉络膜黑色素瘤的有效性及安全性研究

背景 脉络膜黑色素瘤(CM)是成人眼内常见的原发性恶性肿瘤,巩膜表面敷贴放射治疗(EPRT)是一种近距离放射疗法,是多年来治疗CM最常用的方法之一.但该治疗方法的研究与应用目前在国内报道较少,大多数的CM患者需行眼球摘除术. 目的 通过观察兔CM模型眼、正常兔眼经敷贴放射后的反应以及兔全身免疫状态,评价国产125I巩膜敷贴器的有效性及安全性.方法 新西兰大白兔40只,按随机数字表法分成5个组,每组8只兔8只眼(均取右眼).其中放射治疗组1及模型对照组用于评价国产125I巩膜敷贴器的有效性;放射治疗组2、伪放射对照组、正常对照组用于评价国产125I巩膜敷贴器的生物安全性.有效性研究:利用B16F10鼠皮肤黑色素瘤细胞株植入兔眼制作动物模型,造模3周后放射治疗组1模型兔眼放置国产125I巩膜敷贴器进行放射治疗,肿瘤局部照射总剂量为100 Gy,模型对照组不进行治疗.每日间接检眼镜检查,每周行眼底照相、B型超声、彩色超声多普勒检查.安全性研究:放射治疗组2正常兔眼放置巩膜敷贴器,伪放射对照组正常兔眼植入不带放射粒子的敷贴器外壳,正常对照组不作任何干预.放射治疗组2、伪放射对照组于放置敷贴器前及敷贴器取出后3、7、15、30 d抽取外周血,用流式细胞术检测外周血CD4+、CD8+T细胞数量.于放射治疗组1、模型对照组肿瘤种植后6周,放射治疗组2、伪放射对照组、正常对照组观察30 d后耳缘静脉空气栓塞法处死实验兔,对实验眼进行常规组织病理学检查. 结果 放射治疗组1、模型对照组间放置敷贴器前肿瘤的平均高度差异无统计学意义(P=0.550).放置敷贴器1周后,放射治疗组1肿瘤高度明显小于模型对照组,差异有统计学意义(P=0.001);放射治疗组1放置敷贴器2周后肿瘤高度较敷贴前明显缩小,差异有统计学意义(P=0.007).常规组织病理学检查发现,与模型对照组比较,放射治疗组1虽然仍有肿瘤细胞残存,但肿瘤内部血管明显减少且管径较细,肿瘤细胞排列紊乱,部分细胞空泡样变性,色素外露,大量纤维结缔组织增生.安全性研究中,放射治疗组2、伪放射对照组在各时间点CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞流式细胞术结果比较,差异均无统计学意义(F分组=0.770、8.110、2.230;P=0.380、0.060、0.140;F时间 =0.770、3.220、4.230;P=0.550、0.170、0.004).放射治疗组2、伪放射对照组表现为角膜、结膜上皮下、巩膜表面慢性炎性细胞浸润,未见巩膜坏死、机化等表现. 结论 国产125I巩膜敷贴器对兔眼CM的疗效确切,对眼部其他组织以及兔全身免疫状态的影响较小.     

顺铂对视网膜母细胞瘤细胞B7-H1表达的影响

　　目的　观察顺铂对视网膜母细胞瘤（RB）细胞B7-H1表达的影响,并探讨其作用机制。方法　分别采用浓度为0.375、0.750、1.500、3.000、6.000 μg/ml顺铂处理人RB细胞HXO-Rb₄₄细胞,作为不同浓度实验组;以RPMI 1640细胞培养液处理HXO-Rb44细胞作为空白对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测HXO-Rb₄₄细胞B7-H1 mRNA的表达;免疫荧光染色和流式细胞术检测HXO-Rb₄₄细胞B7-H1蛋白表达。采用1.500 μg/ml顺铂处理HXO-Rb₄₄细胞0、15、30、60、120 min,蛋白免疫印迹（Western blot）检测细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化水平。结果　0.375、0.750、1.500、3.000、6.000 μg/ml组HXO-Rb₄₄细胞B7-H1 mRNA表达均较空白对照组高,差异有统计学意义（F=395.478,P=0.000）。0.375、0.750、1.500、3.000、6.000 μg/ml组HXO-Rb₄₄细胞B7-H1蛋白表达均较空白对照组高,差异有统计学意义（F=112.03,P=0.000）。 Western blot 检测显示,1.500 μg/ml顺铂激活HXO-Rb₄₄细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平;随时间延长,其磷酸化水平逐渐增高,至30 min达高峰,以后又逐步下降。结论　顺铂能促进RB细胞B7-H1 mRNA和蛋白的表达;ERK1/2信号通路可能参与了这一过程。      

白细胞介素17中和性抗体对角膜移植排斥反应的抑制作用

背景白细胞介素17（IL-17）是一种促炎性细胞因子,在多种器官移植免疫排斥反应和自身免疫性疾病中发挥致病作用。IL-17拮抗剂在器官移植排斥反应中的作用被广泛研究,但其对角膜移植后排斥反应防治作用的研究较少。目的探讨抗小鼠IL-17单克隆抗体对小鼠角膜移植排斥反应的抑制效果。方法选取8～10周龄C57BL／6小鼠25只和BALB／c小鼠50只,将直径2min的C57BL／6小鼠双眼中央角膜作为供体角膜移植到50只BALB／c小鼠右眼角膜植床上,11,0尼龙线间断缝合8针,建立小鼠角膜移植模型。将建立的40只角膜移植小鼠模型按随机数字表法随机分为2个组,术后腹腔内分别注射小鼠IL-17中和性抗体（IL-17中和性抗体组）或同型对照抗体（同型对照抗体组）,并于术后不同时间点根据Plskova等的标准对受体角膜植片的炎症反应情况进行评分,≥5分为发生排斥反应。应用免疫荧光组织化学法检测受体植片炎性细胞的浸润;用逆转录PCR法对植片中的炎性细胞进行定量;应用ELISA法分析两组受体小鼠Th1、Th2和Th17相关细胞因子在脾脏中的表达情况。结果与同型对照抗体组相比,IL-17中和性抗体可以提高角膜植片的存活率（P〈0．05）。IL-17中和性抗体组受体植片中性粒细胞、CD4＋T淋巴细胞和CD8＋T淋巴细胞mRNA含量分别为2．22±0．10、1．64±0．04、1．32±0．10,明显低于同型对照抗体组的3．61±0．08、2．69±0．06、2．17±0．04,差异均有统计学意义（P=0．000、0．000、0．000）。同型对照抗体组受体小鼠脾脏中γ-干扰素（IFN-γ）、IL-12p40和IL-17质量浓度分别为（741．48±10．51）、（1156．90±69．93）、（366．13±7．93）ng／L,明显高于IL-17中和性抗体组的（529．80±13．83）、（539．58±10．74）、（173．70±8．11）ng／L,差异均有统计学意义（P=0．000、0．001、0．000）。结论中和IL-17的生物学活性可以在一定程度上抑制同种异体角膜移植术后的免疫排斥反应。     

自微乳化释药系统对银杏内酯B在视网膜内药代动力学参数的影响

背景 银杏内酯B(GB)具有明确的神经保护和抗凋亡作用,可以有效拮抗视网膜内感光细胞的凋亡,达到治疗视网膜变性类疾病的目的,但GB的高疏水性和低生物利用度限制了其临床应用.自微乳化释药系统(SMEDDS)能有效提高难溶性药物的溶出度和生物利用度,因此可能提高GB在视网膜中的生物利用度. 目的研究自制GB-SMEDDS灌胃后在SD大鼠视网膜内的药代动力学及药时变化. 方法 采用随机数字表法将80只SD大鼠分为GB混悬液组和GB-SMEDDS组2个组,每组40只,分别给予40 mg/kg自制质量分数2.5％ GB-SMEDDS或GB混悬液(质量分数0.1％ DMSO溶解)灌胃,并于给药后15、30、45 min和1、2、4、8、12h分别处死5只大鼠,解剖显微镜下分离大鼠视网膜,制备大鼠视网膜上清液,经高效液相-电喷雾离子-质谱联用(HPLC-ESI-MS)法检测GB的质量浓度,并与标准曲线对比换算,药代动力学参数采用实用药物动力学程序3p87中的统计矩方法计算,计算出视网膜中的最大药物质量分数(Cmax,mg/g)、药物达峰时间(Tmax,h)、清除率(Ke/h)、吸收半衰期(t1/2)和药时曲线下面积[AUC0-∞,mg/(g·h)]. 结果 GB在1～ 32 mg/L时线性关系良好,线性回归方程为Y=0.0732X+0.056(r=0.992).GB-SMEDDS组和GB混悬液组大鼠灌胃后有着相似的药时曲线,但是除了给药后15 min视网膜中的药物质量分数两者一致外,其他各个时间点GB-SMEDDS组视网膜内药物质量分数均高于GB混悬液组.两组大鼠视网膜中Cmax分别为(15.83±1.84) mg/g和(2.65±0.10) mg/g,AUC0-∞分别为(15.30±0.11)mg/(g·h)和(6.42±0.19)mg/(g·h). 结论 HPLC-ESI-MS具有快速、准确、灵敏度高的特点,适合GB制剂在SD大鼠视网膜中药代动力学的研究.SMEDDS可以显著提高GB在视网膜中的含量,可能提高其生物利用度.