细菌核糖体23 S亚单位基因芯片在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的研究建立快速检测细菌DNA的方法,建立含有10种细菌探针的检测用基因芯片模型. 方法使用合成的扩增细菌核糖体23 S亚单位(23S rDNA)寡核苷酸探针,制备基因芯片;设计23S rDNA通用引物,应用PCR(聚合酶链反应)法,扩增细菌核糖体23S亚单位基因(23S rDNA),扩增后产物与芯片上的探针杂交,用荧光扫描仪检测信号;对23种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用本方法进行检测,并与常规细菌培养法比较. 结果基因芯片检测临床致病菌具有较高的特异性和灵敏性. 结论利用寡核苷酸探针基因芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力,比常规培养法快速、准确.     

运用23S rDNA芯片技术进行食源性感染常见致病菌的快速鉴定

[目的]应用23S rDNA芯片技术，建立食源性感染常见致病菌的快速鉴定方法。[方法]利用带正电荷尼龙膜为芯片载体，合成寡核苷酸探针，点样于载体制成寡核苷酸芯片，对食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段扩增产物进行杂交检测。[结果]获得扩增食源性感染常见致病菌23S rDNA基因片段的特异性引物，并在同一条件下扩增出14种细菌目标片段。在均一的杂交条件下与寡核苷酸芯片杂交，用地高辛酶联免疫法进行显色。结果表明，10种细菌杂交结果显示很好的灵敏度和特异性，4种细菌由于探针因素或杂交条件不合适未能显示预期的种(属)杂交结果。对于食源性感染模拟标本，本方法也可以获得预期的结果。[结论]建立的23S rDNA芯片技术在食源性感染常见致病菌鉴定上快速准确的优点，为食源性感染的诊治与预防提供了有效的技术手段和方法依据。     

通用引物PCR扩增创伤感染细菌16S-23S rDNA间区的研究

目的 探讨通用引物PCR扩增多种创伤感染细菌16S-23S rDNA间区的可行性,为开展常见创伤感染细菌基因诊断做好准备.方法 以细菌16S-23S rDNA间区为靶序列,在16S rDNA 3'端与23S rDNA 5'端保守区自行设计通用引物,筛选5种常见创伤感染细菌,提取其基因组DNA并进行PCR扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序.结果 5种细菌基因组DNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱与预期一致,经测序比对后得到了证实.结论 该通用引物可以实现对多种创伤感染细菌16S-23S rDNA间区进行PCR扩增,为下一步进行基因诊断打下了坚实的基础.     

通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

目的 建立快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法,用于生物恐怖病原体的快速筛检.方法 选择保守的细菌16 S rDNA序列,并针对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis,B.a)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,Y.p)、布鲁菌属(Brucella spp.,Bru)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,F.t)和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.p)等5种生物恐怖细菌设计种(属)特异性探针,经16 S rDNA通用引物341A、519B扩增基因组DNA,用基因悬浮芯片方法进行检测,并对方法的灵敏度、特异度、重复性、检测能力进行验证.结果 经16 S rDNA通用引物扩增,特异性探针杂交检测,能将样本细菌鉴定到属水平,同属菌出现交叉反应;检出限分别为类鼻疽伯克霍尔德菌1.5 pg/μl,布鲁菌属20 ps/μl,炭疽芽孢杆菌7 pg/μl,土拉弗朗西斯菌0.1 pg/μl,鼠疫耶尔森菌1.1 pg/μl;15次重复检测各探针变异系数(CV)为5.18%～17.88%,具有较好的重复性;方法可正确检出模拟白色粉末样本中炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森菌.结论 建立了通用型基因悬浮芯片检测体系快速高通量筛查生物恐怖细菌的方法.     

纳米金基因芯片结合通用引物1次PCR法同时检测多个病原菌的研究

目的基于基因分型技术构建通用引物1次PCR法的样品制备技术,并结合纳米金基因芯片检测系统实现1次对多个病原菌的检测分析。方法针对rDNA保守序列设计通用引物,实现1次PCR完成对各靶细菌ISR序列的扩增;设计针对各靶细菌的特异探针,构建纳米金新型基因芯片,并用芯片进行实际检测。结果设计的通用引物可实现对12种待检靶细菌的正确扩增;选用的各探针特异性强、可靠性好;芯片具有较好的灵敏度、特异性及可靠性;检测敏感性达到50 fmol/L;临床检测显示本方法准确可靠。结论与多重PCR样品制备法芯片比较,本芯片检测的步骤和复杂性大为减低,且有较好的检测性能,可用于各靶病原菌的检测。     

导流杂交基因芯片技术在肠道致病菌检测中的应用研究

目的建立导流杂交芯片技术检测粪便标本中8种肠道致病菌。方法以细菌16S rDNA和23S rDNA序列设计通用引物和寡核苷酸探针,将活性氨基标记的探针依次固定在BiodyneC膜上,制成检测芯片,用标记生物素的引物进行PCR扩增,将扩增产物与检测芯片在核酸分子快速杂交仪上进行杂交,以POD和TMB进行显色,判断结果;应用该方法检测8种肠道致病菌标准菌株和120份腹泻患者粪便标本,通过细菌培养结果比较该方法的有效性。结果120份临床粪便标本中,采用导流杂交芯片共检出68份（56.67%）携带肠道致病菌;细菌培养鉴定出63份（52.50%）携带肠道致病菌,其中58份导流杂交芯片与细菌培养结果一致,准确率为85.29%。结论导流杂交芯片技术能够快速准确检测8种常见肠道致病菌,而且适用于流行病学调查研究。     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立

目的 探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价.方法针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR( FQ-PCR)反应体系;提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本;以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV).结果靶向Mtb 16S rDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA) 1.2 pg/μL,即(38.9 +3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27％和1.26％.结论以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测.     

寡核苷酸微阵列快速检测常见食源性致病菌初步研究

目的:探索运用寡核苷酸微阵列技术建立一种快速、简便的检测食源性致病菌方法。方法:基于细菌16s rDNA序列设计并合成寡核苷酸探针,制备寡核苷酸微阵列,对7种常见细菌进行检测。同时,采用培养和微阵列对40份腹泻患者粪便进行了检测。结果:7种食源性致病菌用细菌16s rDNA序列通用引物扩增后,均得到900 bp左右的PCR产物,产物分别在寡核苷酸微阵列上进行杂交时,均只和相对应的检测探针产生明显的杂交信号。在模板为1.0 pg/ml时,PCR未能扩增出明显的条带,然而该产物经微阵列杂交后可见较明显的检测信号。40份腹泻患者粪便采用培养法结合血清凝集试验和寡核苷酸微阵列进行检测比较,发现大肠埃希菌与志贺菌属检测探针也能杂交,霍乱弧菌与副溶血性弧菌检测探针也能杂交,其余5种细菌检测符合率为为100%。结论:基于细菌16s rDNA序列的寡核苷酸微阵列技术检测食源性致病菌,方法简单、实用、快速、高通量,并可以直接检测标本而不需培养,但是采用该技术部分细菌只能实现初步快速鉴定,仍需要结合培养等才能最后鉴定。     

16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

目的比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA 基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用。方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组 DNA,运用 16S rRNA、16S-23S rRNA 基因进行 PCR 扩增。扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心(NCBI)上进行比对分析,确定菌种。结果在所分析的 19 种临床血流感染常见细菌中,16S rRNA 基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA 成功鉴定 17 种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平。结论 16S-23S rRNA 基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标。     

PCR在血液病原菌16S rRNA基因检测的诊断价值

目的 为早期诊断败血症,探索一种能快速检测病原菌感染的新方法.方法 用PCR技术扩增实验室保留株10株的16S rRNA基因,以人类基因组DNA、HBV-DNA和白色假丝酵母菌为对照,检测该方法的特异性;采用10倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测.结果 对所测病原菌株均获得371 bp扩增产物,而与人基因组DNA、HBV-DNA和白色假丝酵母菌无交叉反应;PCR最低能检测1.5×104/L大肠埃希菌.结论 16S rRNA基因PCR检测方法具有快速,特异性和敏感性高等特点.     

寡核苷酸芯片技术检测肠杆菌科食源性感染常见致病菌的研究

目的：建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌的快速检测方法。方法：选带正电荷的尼龙膜作为寡核苷酸芯片载体，采用寡核苷酸芯片技术对肠杆菌科食源性感染常见致病菌进行检测和鉴定。结果：在同一条件下运用多重PCR扩增出14种（属）细菌的16SrRNA、23SrRNA基因片段，随后应用寡核苷酸芯片技术对致病菌进行检测得到了相应的特异性杂交图谱。结论：建立的寡核苷酸芯片技术可快速检测肠杆菌科食源性感染常见致病菌，为食源性感染的快速诊断与预防奠定了良好的基础。     

肠道常见病原菌检测基因芯片的制备与评价

目的建立并评价快速准确地检测肠道致病菌的基因芯片检测方法。方法在基因芯片制备基础上，通过对靶基因的扩增、杂交和对杂交结果的分析，对常见肠道致病菌的检测和鉴定效果进行评价。结果应用包含38种特异性探针的基因芯片，对涉及沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、致泻性大肠埃希菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌和单核细胞李斯特菌等8个菌属的16株致病菌进行检测，均得到特异性杂交图谱。结论制备的基因芯片能够同时检测多种重要的肠道致病菌，为肠道致病菌感染的快速诊断提供了准确、快速、灵敏的方法。     

布鲁菌16S rDNA基因遗传分析

目的通过分析临床分离的布鲁菌、其他盐杆菌科细菌以及临床常见致病菌的16SrDNA基因片段的差异并构建16SrDNA系统发育树,为进一步研究布鲁菌打下基础。方法 PCR扩增临床分离株的16SrDNA并测序;从EMBL下载常见盐杆菌科细菌和临床上常见致病菌的16SrDNA序列。利用CLUSTALX和MEGA程序进行16SrDNA比对并构建系统发育树。结果成功扩增了临床分离菌株的16SrDNA,得到测序结果,比对临床分离菌株和相关菌株后,发现了特异序列5′-ATCCCGGTCGCGGTTAGTGG-3′;系统发育树表明不同种的布鲁菌间的距离非常接近;布鲁菌和醋菌属的进化距离较近,但是和其他的盐杆菌的进化距离较远。结论在布鲁菌16SrDNA中存在特异序列5′-ATCCCGGTCGCGGTTAGTGG-3′,有可能作为探针来快速检测布鲁氏菌。     

宁波地区腹泻患者细菌性病原检测与分析

摘要：目的　了解宁波地区腹泻患者病原菌构成和耐药性,为防控感染性腹泻提供依据。方法　病原菌检
测采用直接分离与增菌分离相结合的方法;细菌筛检和鉴定采用生化和生化鉴定试剂条ＡＰＩ等法,鉴定到
种、群;病原菌血清分型采用血清凝集法;药敏试验采用Ｋ Ｂ法;耐药基因检测采用ＰＣＲ 法,统计学分析
采用ＳＰＳＳ１１．０软件包进行,率的比较采用χ
２ 检验和犉分析。结果　９２５６份标本中检出８类１６种３４７３
株病原菌,检出率为３７．５２％,其中,副溶血性弧菌、沙门菌和气单胞菌的检出率分别为１６．１３％ （１４９３／
９２５６）、３．９９％ （３６９／９２５６）和３．４４％ （３１８／９２５６）,副溶血性弧菌的检出率明显高于其他病原菌（χ
２＝
２１．６８,犘＜０．０１）;血清分型发现副溶血性弧菌的Ｏ３ 群（３４９／４８０）、沙门菌的甲型副伤寒菌（１６８／３６９）、
志贺菌的躈氏志贺菌（１１７／１７５）、致病性大肠埃希菌Ｏ１１９ （２８／６６） 为各病原菌的优势菌,检出了躈氏
１Ｃ、２Ｃ 和４Ｃ 志贺菌新亚型;药敏试验显示病原菌对大多数抗生素敏感,但有４５株为多重耐药菌,其中
气单胞菌２３株、志贺菌８株、致泻性大肠埃希菌８株、金黄色葡萄球菌３株、变形杆菌２株、沙门菌１株,
占总菌数的２．４５％,检出了犫犾犪 犜犈犕、狊狌犾犾和犪犪犮犮等３种耐药基因。结论　宁波地区感染性腹泻病原构成
复杂,副溶血性弧菌是最主要的流行病原菌;检出躈氏Ｃ 型志贺菌提示其血清型可能或正在转换,需加强
对志贺菌变迁的监测,以预防疾病的暴发;致病性不强的气单胞菌和类志贺邻单胞菌检出率较高,应引起
关注;耐药菌株中有２．４５％的病原菌为超广谱β 内酰胺酶（ＥＳＢＬ） 菌株,涉及多个菌属,提示临床治疗
中合理用药是减少耐药菌的传播和扩散的关键。
关键词：感染性腹泻;病原菌;分离鉴定;药敏
中图分类号：Ｒ５１２．５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０２ ００９６ ０６     

一株病原菌的API生化鉴定及其16S—23S rDNA间区序列分析

目的建立针对在生化鉴定结果不准确的情况下,利用分子生物手段对病原菌进行鉴定的方法。方法将分离出的一株细菌经过普通的形态学观察和氧化酶试验,用肠杆菌科生化试纸条(API20E)做生化鉴定。并利用细菌通用引物对细菌的16S—23S rDNA间区进行PCR扩增,测序,利用BLAST在线同源性查询软件查询所测片段的属性。结果 API20E生化鉴定结果可能是河流弧菌,BLAST比对结果为嗜水气单胞菌(GenBank accession No:FJ013143)。结论传统的表型分类在细菌鉴定中已逐步与各种基因型分类水平的细菌鉴定方法相结合,在实际工作中应注意有效使用。     

16S rDNA序列分析法在国际船舶压载舱沉积物病原微生物检测中的应用

〔目的〕探讨16S rDNA序列分析法在国境口岸监测外来病原微生物的可行性。〔方法〕按照0.5 mg/0.5 ml样品接种10 ml增菌液的比例将压载舱淤泥样品分别接种到营养肉汤和碱性蛋白胨水中,37℃过夜,震荡摇匀。增菌后划线接种在选择培养基上,过夜培养后挑取阳性菌落纯培养,按照试剂盒说明提取细菌基因组,扩增细菌基因组16S rDNA片段,将扩增产物纯化后进行序列分析。〔结果〕从48份样品中共检测12种细菌,其中检测到的霍乱弧菌有1株为B33株。这株霍乱弧菌最早在2004年分离自非洲东南部国家莫桑比克的贝拉港,是O1群霍乱弧菌的经典型与Eltor型杂交后产生的菌株,O139群霍乱弧菌尚未检测到。〔结论〕16S rDNA序列分析法可用作国境口岸外来微生物的监测和分析。     

烟台市食品行业从业人员肠道致病菌的检测及意义

目的:对烟台市从事食品行业人员的肠道致病菌进行检测,为当地食品安全的危险性评估提供依据。方法:检测2009年-2011年烟台市25600名从事食品行业的服务人员的肠道致病菌;检测方法按照国家标准GB/T4789-2003《食品卫生检验方法微生物学部分》的规定;检测菌群范围包括:沙门菌、志贺菌、豚鼠气单胞菌、致泻性大肠杆菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、霍利斯弧菌、非O1群霍乱弧菌、副溶血弧菌。结果:(1)根据生化鉴定结果表明其生化谱线符合率为93.8%～99.9%;(2)检出肠道细菌254份,阳性率为0.99%,其中弧菌科细菌为144株(含117株副溶血弧菌,12株溶藻弧菌,6株温和气单胞菌,5株非O1群霍乱弧菌,2株豚鼠气单胞菌,1株嗜水气单胞菌,1株霍利斯弧菌),占检出肠道细菌的56.69%;肠道杆菌细菌为110株(含76株沙门菌6,株志贺菌,9株致病性大肠杆菌,14株侵袭性大肠杆菌,5株产毒性大肠杆菌,占检出肠道细菌的43.30%。肠道致病菌的阳性率呈现出逐年下降的趋势,差异有显著的统计学意义;(3)检出的肠道致病菌中,以副溶血弧菌(46.06%)和沙门菌(29.90%)阳性率为最高。结论:食品行业服务人员病原菌携带的肠道致病菌以肠道弧菌为主要的病原菌。对该人群进行健康携带病原细菌调查,有利于找出微生物引起食源性疾病的关键控制点,从而采取针对性措施来规范相关人员健康检查的工作以保障食品卫生安全。     

应用PCR-DGGE技术快速检测病原微生物的研究

目的:建立临床病原微生物的快速检测方法。方法:采用PCR-DGGE技术,PCR扩增标准菌株和检验样品的16S rDNA中的V3可变区序列,通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术来进行检测,并将电泳检测结果同传统分离培养结果进行对比。结果:PCR-DGGE技术检测样品结果同传统分离培养结果一致。结论:应用PCR-DGGE技术检测病原微生物,快速高效可行。     

Typing of Vibrio vulnificus strains by variability in their 16S-23S rRNA intergenic spacer regions

Amplification of the 16S-23S rDNA spacer region (ISR1) is a simple and rapid procedure for subtyping bacteria, especially those with several ribosomal operons including Vibrio vulnificus. V. vulnificus contains nine ribosomal operons with four or five ISR1 classes that differ in size and sequence. In the present study, 47 V. vulnificus strains of both shellfish and clinical origin were subtyped by their ISR1 patterns using "universal" primers, which target conserved sequences located in the 16S and the 23S rRNA genes. Sixteen different ISR1 patterns were observed that were grouped into two major clusters. Most (21/27, 77.8%) clinical isolates examined in this study grouped into a single cluster containing ISR1 patterns I, V, XI, and XII and these were highly similar (75%). This cluster was restricted to strains carrying the type B 16S rDNA (rrs) sequence which has been associated with human illness in previous studies. The remaining cluster consisted primarily of shellfish isolates. The highest variability in the ISR1 patterns was observed among shellfish isolates. Sequence analysis of the ISR1 region of selected strains demonstrated that all of them possess five ISR1 classes, with two "conserved sequence blocks" at the 5' and 3' end of the ISR1. All of these strains carried at least one tRNA gene and different classes differed in their tRNA gene composition. Some of the same ISR1 classes differed in size mainly due to an insertion of 35 bp in either of the conserved sequence blocks. These results demonstrate the feasibility of the ISR1 technique for V. vulnificus subtyping and suggest that ISR1 patterns appear to be linked to rrs sequence types and perhaps with virulence.