小鼠IL-18基因修饰瘤苗的抗白血病作用研究

我们在前期工作中成功制备了IL-18基因修饰的白血病疫苗,为了探讨IL-18基因修饰瘤苗的体内抗白血病作用,实验采用L1210小鼠淋巴细胞白血病模型,在小鼠体内接种IL-18基因修饰瘤苗,观察瘤苗对L1210细胞致瘤性的影响及免疫保护作用,并进一步对其抗白血病作用机制进行了探索。结果显示,IL-18基因修饰瘤苗能够明显延长荷瘤小鼠存活时间,大部分小鼠达到长期生存,且长生存小鼠用野生型L1210细胞二次攻击后大多数仍能长期生存,表明IL-18基因修饰瘤苗有显著的抗白血病作用,并可诱导小鼠产生免疫记忆和免疫保护。机制探讨发现,接种IL-18基因修饰瘤苗后,小鼠脾脏淋巴细胞对L1210肿瘤细胞的CTL及NK细胞杀伤活性明显高于对照组(P<0.05),提示IL-18基因修饰瘤苗能够显著增强抗肿瘤CTL和NK细胞反应。接种瘤苗可使小鼠IFN-γ水平升高,但与对照相比无统计学意义,提示IFN-γ可能在IL-18基因修饰瘤苗诱导的抗肿瘤免疫应答中作用不大。     

胃癌细胞总RNA修饰树突状细胞的肿瘤疫苗效果

目的应用肿瘤细胞RNA修饰小鼠树突状细胞(dendrticcell,DC)的肿瘤疫苗免疫小鼠,研究其抗肿瘤免疫作用.方法CD11c磁珠抗体标记小鼠脾单个核细胞悬液,磁性细胞分选器(MACS)分选出CD11c+的DC,短期培养,以肿瘤细胞总RNA脉冲DC,以此瘤苗皮下注射免疫615小鼠两次,间隔1周,最后1次免疫后7d,实验鼠皮下接种5×105小鼠前胃癌细胞(MFC).结果经免疫后的小鼠具有较强抗肿瘤免疫,RNA脉冲DC的瘤苗免疫后肿瘤生长受到明显抑制,其外周血和脾细胞中NK活性均明显升高,肿瘤特异性CTL也明显升高.结论以肿瘤RNA作为抗原脉冲DC可诱导较强的抗肿瘤免疫.     

树突状细胞在榄香烯复合瘤苗主动免疫效应中的作用

本实验以HCa F或L6 1 5榄香烯复合瘤苗 (H TCV或L TCV )、H TCV溶解物 (TH )、短小棒状菌 (CP )免疫小鼠 ,分离制备其脾脏DC ,在体外分别用相应瘤细胞溶解物 (H或L )和瘤苗溶解物 (TH或TL )冲激后 ,以MTT法检测其诱导同系小鼠脾不粘附细胞增殖的能力。结果表明用榄香烯复合瘤苗或其溶解物免疫DC供鼠和体外冲激DC ,可增强其诱导同系小鼠脾不粘附细胞增殖的作用 ,给DC供鼠注射CP可进一步增强DC的这一作用     

免疫重建小鼠抗红白血病的作用研究

目的:观察在免疫重建过程中应用白血病瘤苗对C57BL/6小鼠一般状况、抵御FBL-3细胞攻击及小鼠保护性免疫功能的作用.方法:用同系小鼠脾脏淋巴细胞对照射后的免疫缺陷鼠进行免疫重建,同时用灭活FBL-3细胞皮下注射免疫C57BL/6小鼠,7天后用FBL-3细胞皮下攻击小鼠,观察小鼠的一般状况、成瘤率、瘤块生长情况;通过ELISA法测定外周血IFN-γ含量,以评估细胞免疫作用的强弱;通过病理切片了解瘤块中心及周围细胞浸润情况.结果:免疫重建 瘤苗可以有效提高单纯应用瘤苗所产生的保护性免疫功能,IFN-γ含量明显升高;用FBL-3细胞攻击,成瘤小鼠瘤块生长缓慢,瘤周单个核细胞浸润明显,瘤块内肿瘤细胞坏死明显,生存期明显延长.结论:在免疫重建的同时应用瘤苗,可以加强瘤苗的保护性免疫作用,为临床应用瘤苗治疗时机提供实验依据.     

小鼠β-防御素2肿瘤疫苗的抗白血病作用研究

目的：探讨小鼠β-防御素2（MBD2）肿瘤疫苗的体内抗白血病作用及其机制。方法：小鼠体内接种转染MBD2的L1210小鼠白血病细胞（L1210-MBD2），观察细胞的致瘤性改变；对长期存活的小鼠用野生型L1210细胞进行二次攻击，探讨瘤苗的免疫保护作用；用照射L1210-MBD2瘤苗注射荷瘤小鼠，检测瘤苗的治疗效果。采用乳酸脱氢酶活性法测定接种瘤苗后小鼠脾脏细胞CTL及NK细胞毒活性，ELISA法检测脾细胞产生IFN-γ及IL-12含量。结果：转染MBD2使L1210细胞致瘤性明显降低（P〈0．05），80％小鼠长期生存；对照组小鼠全部死亡。用野生型L1210细胞二次攻击后100％dx鼠仍能长期生存。照射瘤苗能使50％的荷瘤小鼠长期生存，而对照组小鼠则全部死亡，两者之间具有显著性差异（P〈0．05）。接种MBD2瘤苗后，小鼠脾细胞对L1210的CTL及NK杀伤活性明显增强（P〈0．05），产生IFN-γ、IL-12水平显著升高（P〈0．05）。结论：L1210-MBD2瘤苗通过调节机体细胞免疫反应显示出较强的体内抗白血病作用，为淋巴细胞性白血病的免疫治疗提供了新策略。     

艾氏腹水瘤全细胞瘤苗诱导的特异性杀伤活性

目的研究艾氏腹水瘤全细胞瘤苗诱导的特异性杀伤活性。方法用40g/L的多聚甲醛处理的艾氏腹水瘤细胞作为全细胞瘤苗免疫Balb/c小鼠,建立瘤苗小鼠模型。用HE染色法对亲本肿瘤细胞皮下再次攻击形成的肿瘤结节进行病理学观察;用51Cr释放法测定瘤苗免疫组、荷瘤组、正常组小鼠脾细胞,对亲本艾氏腹水瘤细胞和Sp2/0细胞的杀伤活性。结果HE染色显示,经瘤苗免疫后亲本肿瘤细胞皮下再次攻击形成的肿瘤结节中,瘤细胞几乎完全坏死,同时在坏死部位有大量炎细胞浸润、纤维母细胞和小血管增生;而对照组则无以上现象。效靶比为200∶1时,免疫小鼠脾细胞体外杀伤亲本艾氏腹水瘤细胞的杀伤率(％)为(42.3±3.2)％,显著高于荷瘤组的(12.1±2.3)％、正常组的(6.1±1.1)％和对Sp2/0细胞的杀伤率(8.8±0.4)％(P均∨0.05)。结论艾氏腹水瘤全细胞瘤苗可诱导机体产生特异性杀伤活性。     

原位微波消融为诱导抗肝癌免疫反应提供有效抗原

目的： 研究微波消融（MWA）灭活的肝癌组织诱导抗肿瘤免疫反应的效能。方法: 建立C57L/J小鼠皮下肝癌MWA模型，观察MWA小鼠对抗Hepa1-6细胞冲击的效果，采用结晶紫染色分析法测定淋巴细胞的杀瘤活性。提取MWA灭活的肝癌组织与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-2（IL-2）缓释微粒配制成MWA瘤苗免疫小鼠，观察此瘤苗诱导保护性抗肿瘤免疫的效能。结果: 与对照组小鼠全部生长肿瘤相比，17％的MWA小鼠获得保护，荷瘤MWA小鼠的肿瘤生长受到显著抑制，小鼠的生存时间显著延长。MWA组无瘤小鼠的脾细胞能够特异性杀伤Hepa1-6细胞。MWA瘤苗保护免疫小鼠的效能比单用MWA灭活肝癌组织者高50％，与阳性对照的甲醛固定瘤苗相近。结论: 原位MWA能为诱导特异性抗肿瘤免疫提供有效抗原，细胞因子的使用加强了这一保护性免疫作用。     

过继肿瘤特异性淋巴细胞联合mIL-21瘤苗抗肿瘤效应研究

目的 在环磷酰胺(Cy)所致小鼠淋巴细胞急剧减少状态下,过继mIL-21转染的瘤苗细胞(mIL-21-Sp2/0)免疫致敏的同系小鼠淋巴细胞,联合mIL-21-Sp2/0瘤苗免疫,探讨过继免疫抗瘤效应机制.方法 用Cy 100 mg/kg预处理BALB/c小鼠2 d后,以灭活mIL-21瘤苗免疫的同系小鼠脾及淋巴结的淋巴细胞作为肿瘤抗原特异性淋巴细胞过继给Cy预处理鼠,同时用mIL-21瘤苗免疫,7 d后以野生型Sp2/0细胞攻击,观察小鼠的肿瘤生长情况.流式细胞仪(FCM)分析CD4+、CD8+、CD4+CD25+T细胞等亚群的变化,分别以CFSE和7-AAD标记,FCM检测淋巴细胞增殖能力和效应细胞的细胞毒活性,用ELISPOT检测分泌IFN-γ的淋巴细胞数量.结果 与对照组相比,Cy预处理小鼠接受过继效应细胞及mIL-21瘤苗免疫后,可有效地抵抗野生型Sp2/0细胞的攻击.过继的肿瘤特异性淋巴细胞的体内增殖能力和体外杀伤活性显著增强,分泌IFN-γ效应细胞的数量显著增高.结论 在小鼠淋巴细胞减少期,过继mIL-21瘤苗免疫致敏的肿瘤抗原特异性淋巴细胞并同时给予mIL-21瘤苗免疫,利于输入的效应细胞及自身免疫细胞的增殖和特异性抗肿瘤功能的形成与维持.     

新型佐剂SWZY对弱免疫原性小鼠黑色素瘤瘤苗的免疫增强作用

目的:评价佐剂SWZY对弱免疫原性黑色素瘤瘤苗的免疫增强作用。方法:C57BL/6小鼠分为6组,实验组分别用5种不同配方的佐剂(FCA,FCA IL-2 GM-CSF,FIA IL-2 GM-CSF,FIA SWZY,FIA SWZY IL-2 GM-CSF)和照射灭活的小鼠黑色素瘤细胞株D5制成瘤苗免疫小鼠,对照组免疫用不加任何佐剂的灭活D5黑色素瘤细胞。末次免疫后3d各组取半数动物检测DTH反应、脾细胞的杀伤活性以及免疫小鼠血清及脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-10的水平,剩余半数动物接种未灭活的D5黑色素瘤细胞,3周后再次检测上述各免疫学参数。结果:与对照组小鼠比较,各实验组小鼠的DTH反应及脾细胞的杀伤活性均明显升高(P<0.05),但成瘤后随着肿瘤的增大,则呈下降趋势。成瘤前各实验组小鼠血清及脾细胞培养上清中IFN-γ的水平均高于对照组小鼠(P<0.05),但IL-10的水平均低于对照组小鼠。成瘤后各实验组及对照组小鼠血清及脾细胞培养上清中IFN-γ的水平均下降,而IL-10的水平均明显上升,其中FCA瘤苗组和FIA SWZY瘤苗组免疫小鼠的血清及脾细胞培养上清中IFN-γ的水平仍高于对照组小鼠(P<0.05),IL-10的水平仍低于对照组小鼠(P<0.05)。结论:用5种佐剂配方制成的瘤苗免疫小鼠均能诱导对弱免疫原性肿瘤的细胞免疫应答,并增强Th1型细胞免疫的应答,但随着肿瘤的形成和逐渐进展,细胞免疫应答的效应逐渐减弱。其中佐剂SWZY与FCA的作用相当,但前者的毒副作用较小,有可能成为一种新型的人用肿瘤疫苗的佐剂。     

榄香烯复合瘤苗的HSP70表达及其主动免疫预防效应

为进一步阐明本室专利榄香烯复合瘤苗(EC-TCV)的主动免疫效应与其HSP70-肿瘤肽之间的关系,本文以42℃热休克(H)为对照,首先检测了榄香烯(E)、丝裂霉素C(MMC)、戊二醛(G)单独或复合处理时对小鼠HCa-F肝癌、L615白血病细胞膜HSP(HSP70、HSP90)表达的影响,发现只有膜HSP70的表达在两种榄香烯复合瘤苗中均升高,随后以E-MMC复合处理的HCa-F细胞中提纯的HSP70-肿瘤肽(HHSP70)为免疫原,以小鼠HCa-F肝癌细胞为模型,研究了HHSP70的主动免疫预防效应及其特异性。结果表明,E、MMC、G同H相似,也具有应激原作用,能诱导应激蛋白HSP70的表达;而且HSP70在HCa-F和L615两种肿瘤细胞均以E-MMC-G三者复合处理时为最高;HHSP70能诱发机体产生主动抗瘤效应,且这种效应有一定的肿瘤特异性。     

表达ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗免疫鼠伴发自身免疫损伤初探

初步探讨B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗诱导抗肿瘤免疫的同时伴发自身免疫相关毒性作用。采用Western blot方法检测B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗免疫小鼠自身抗体产生情况;采用免疫荧光技术检测瘤苗免疫小鼠血清对正常小鼠眼、睾丸、皮肤、肝及肾组织冰冻切片的反应;瘤苗免疫小鼠的生殖功能检测。结果显示B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗免疫会引起部分C57BL/6小鼠发生鼠毛色素脱失现象,其免疫血清可同皮肤、睾丸等组织正常成分发生抗原抗体反应,瘤苗免疫过的雌雄小鼠合笼后能够正常繁育子代小鼠。实验说明B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗诱发小鼠产生抗肿瘤免疫反应的同时,部分受试鼠可伴发自身免疫损伤,但对机体并未产生危及生命的严重病理反应。本实验为全面评估B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗应用价值奠定了基础。     

分泌粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子的重组痘苗病…

将小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子基因经过同源重组得到表达ＣＭ－ＣＳＦ的重组痘苗病毒，用此痘苗病毒转染小鼠黑色素瘤细胞，制备黑色素瘤瘤苗裂解物，Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下接种Ｂ１６－Ｆ１０细胞３天后在注射位注射瘤苗裂解物抗肿瘤一周后再注射一次。结果发现，ＧＭ－ＣＳＦＶＭＯ能够显著地抑制荷瘤小鼠肿结节的生长并明显延长荷瘤小鼠的存活期。用此瘤勒裂解物免疫小鼠两次，间隔一周，免疫一周后给Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮     

分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组痘苗病毒转染的瘤苗裂解物抗肿瘤作用

将小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因经过同源重组得到表达ＧＭ－ＣＳＦ的重组痘苗病毒，用此痘苗病毒转染小鼠黑色素瘤细胞，制备黑色素瘤瘤苗裂解物（ＧＭ－ＣＳＦＶＭＯ），Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下接种Ｂ１６－Ｆ１０细胞３天后在注射部位注射瘤苗裂解物，一周后再注射一次。结果发现ＧＭ－ＣＳＦＶＭＯ能够显著地抑制荷瘤小鼠肿瘤结节的生长并明显延长荷瘤小鼠的存活期。用此瘤苗裂解物免疫小鼠两次，间隔一周，免疫一周后给Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下接种Ｂ１６－Ｆ１０细胞，结果肿瘤结节出现时间明显延长，部分小鼠肿瘤不再生长。经ＧＭ－ＣＳＦＶＭＯ治疗或免疫后小鼠的外周血和脾淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤活性明显升高，ＮＫ活性变化不明显。本结果提示，诱导机体特异性细胞免疫可能是瘤苗裂解物的抗肿瘤作用机理之一。     

用移植方法对L6565、SRS及L783三瘤株抗原性的研究

用移植方法对L6565、SRS及L783三瘤株的抗原性所作的实验研究表明,经丝裂霉素处理的SRS瘤细胞(SRSm)免疫的昆明种小鼠及经丝裂霉素处理的L733白血病细胞(L783m)免疫的SW1系小鼠,分别对SRS瘤细胞及L783白血病细胞的攻击能产生保护作用,提示这两株瘤细胞具有肿瘤相关性移植抗原(TATA);经L6565及L783白血病细胞免疫的昆明种小鼠,也能产生抗SRS瘤细胞攻击的作用,经L6565白血病细胞免疫的SW1系小鼠可保护其对L783白血病细胞的攻击,说明L6565、SRS及L783三瘤株间具有交叉性TATA。实验还发现L6565白血病组织的无细胞提取液及SRS瘤细胞的3M KC1提取物也具有一定的TATA活性。     

615系小鼠脾LAK细胞及LAK一88/DC细胞系抗癌作用的实验研究

本实验研究了转输615系小鼠脾LAK细胞和LAK—88/DC细胞系对615小鼠白血病(L615)的免疫防治效应,以及继承性化学免疫治疗作用。实验结果表明,攻击前二十一天转输LAK细胞或LAK—88/DC细胞系,并每日腹腔注射培养上清液一周,可以诱导正常受鼠产生对L615明显的免疫预防效应,分别使实验组80%的小鼠长期存活;单独注射培养上清液也有效,可使60%的小鼠长期存活。在攻击后五天,用环磷酰胺(CY:180mg/kg)进行化疗并转输LAK细胞或LAK—88/DC细胞系,则能延长晚期L615病鼠的平均存活时间,并可使实验组25%～28.6%的小鼠长期存活。     

B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗安全性及抗肿瘤效应研究

目的:评估B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗用于C57BL/6小鼠的安全性及其诱导的抗肿瘤免疫效应。方法:应用免疫荧光、FCM检测瘤苗细胞ESAT-6-GPI的表达情况;以Western blot方法检测瘤苗细胞IL-21的表达情况;动物实验检测瘤苗体内应用的安全性;制备荷瘤鼠术后免疫模型,评价瘤苗免疫效果。结果:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞表面有靶抗原ESAT-6-GPI表达,并分泌IL-21。于C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞,60天内未见致瘤,但能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。结论:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗致瘤性明显下降,低剂量应用具有安全性,能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。     

Hsp70L1增强肿瘤细胞疫苗免疫原性的研究

目的:考察Hsp70L1对肿瘤细胞免疫原性的增强作用。方法:用RT-PCR的方法,从小鼠黑色素瘤B16细胞和C57BL/6小鼠脾脏中获得TRP2153-243及Hsp70L1基因。分别插入pcDNA3.1/V5-His真核表达载体,构建pHSP70L1、pTRP和pTRP2-Hsp3种表达载体。分别转染B16肿瘤细胞并制备坏死或凋亡瘤苗,免疫C57BL/6小鼠后移植B16肿瘤细胞,观察肿瘤生长曲线,采用流式细胞术(FCM)或微量细胞毒的方法检测荷瘤小鼠细胞因子INF-γ和CTL活性。结果:将经过HSP70L1、TRP2及TRP2-HSP基因修饰的坏死或凋亡的B16肿瘤细胞免疫正常小鼠后,观察到Hsp70L1及TRP2-Hsp基因修饰的坏死瘤苗可显著抑制荷瘤鼠肿瘤的生长,并显著促进荷瘤鼠脾脏淋巴细胞CTL活性和IFN-γ产生(P0.05,P0.01);HSP70L1免疫刺激作用在坏死瘤苗中更明显。结论:Hsp70L1可明显提高B16瘤苗的免疫原性,且对坏死细胞瘤苗的作用更显著。     

IL—6基因转染的瘤苗体内诱导的抗肿瘤免疫功能与效果

经丝裂霉素C体外处理后,将IL-6基因转染的、高分泌的IL-6的B16黑色素瘤细胞制成瘤苗。结果发现,体内注射IL-6基因转染的瘤苗后,小鼠脾脏CTL活性、NK活性及IL-2诱导的LAK活性显著升高。经IL-6基因转染瘤苗体内治疗后,荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长显著减慢、肺转移结节数显著降低、存活期显著延长,若同时合用低剂量IL-2,则上述治疗效果更好。可见IL-6基因转染的瘤苗能有效地通过诱导机体抗肿瘤免疫功能而发挥抗肿瘤作用,与低剂量IL-2合用后,IL-6基因转染的瘤苗的抗肿瘤效果更佳。     

糖基化磷脂酰肌醇修饰的小鼠IL-21瘤苗抗肿瘤效应及其机制初探

目的 构建糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphafidylinositol,GPI)修饰的小鼠IL-21瘤苗,并对此瘤苗的抗肿瘤效应及其机制作初步探讨.方法 通过重叠PCR方法获得IL-21-GPI融合基因并将其插入空载体pcDNA3.1.将鉴定过的重组载体以脂质体法转染B16F10细胞制成瘤苗,细胞间接免疫荧光法及流式细胞仪检测转染瘤细胞膜表面IL-21的表达,通过对小鼠脾细胞的增殖作用鉴定表达的IL-21的生物学活性.将瘤苗接种小鼠后,通过观察小鼠肿瘤体积和生存率分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗免疫鼠的细胞免疫活性.结果 正确构建了pcDNA3.1/IL-21-GPI重组载体,膜表达的IL-21有良好的生物学活性,制备的瘤苗能发挥抗肿瘤效应,其机制与免疫鼠细胞免疫活性增强有关.结论 成功构建了具有抗肿瘤活性的GPI修饰的IL-21瘤苗,为其进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.     

可移植性小鼠淋巴肉瘤白血病(L7710)的实验研究

可移植性小鼠淋巴肉瘤白血病(L7710)是在615系小鼠上建立的一个新瘤株,现已传至107代,其生长特性已基本稳定,在615系小鼠中用瘤细胞移植,发病率为100％,无自行消退,平均存活时间为21.2±5.2天,为国内迄今所报导的细胞移植性小鼠白血病瘤株中平均存活期最长的。于局部皮下接种L7710白血病细胞后能长出较大的实体瘤,并向全身播散,逐渐发展为典型的白血病,故属肉瘤白血病。根据其病理形态特征、细胞化学和某些膜标志的观察,似乎可以将它初步定为T细胞性淋巴肉瘤白血病。L7710对抗癌药的敏感谱较广,