HPLC指纹图谱评价何首乌和制何首乌不同提取部位肝毒性

目的 HPLC指纹图谱评价何首乌和制何首乌不同提取部位肝毒性。方法基于内毒素(脂多糖,LPS)的特异质肝损伤动物模型,HPLC法测定何首乌和制何首乌不同提取部位信噪比(S/N)大于10的指纹峰总面积,并以大鼠ALT、AST水平为评价指标,从而获得特异质肝损伤评价。结果何首乌与制何首乌3种提取部位的S/N比值大于10的指纹峰总面积从大到小依次为50%乙醇、75%乙醇、水,何首乌联合LPS给药组的肝损伤严重程度从重到轻依次为LPS+50%乙醇-何首乌、LPS+75%乙醇-何首乌、LPS+水-何首乌,制何首乌联合LPS给药组的肝损伤严重程度从重到轻依次为LPS+50%乙醇-制何首乌、LPS+75%乙醇-制何首乌、LPS+水-制何首乌。结论何首乌、制何首乌50%乙醇提取的部位毒性最大,HPLC总峰面积也最大,能更好的体现毒性成分信息。     

何首乌水提物对大鼠肝脏CYP1A2,CYP2E1酶活性及mRNA表达抑制作用研究

大鼠连续灌胃不同剂量的何首乌水提物(1,10g·kg-1)7 d,取肝脏制备肝微粒体,分别用Cocktail体外孵育法和实时荧光定量PCR技术观察何首乌水提物对大鼠肝脏主要CYP450酶活性及mRNA表达的影响.与空白对照组相比,1,10g·kg-1何首乌水提物组大鼠肝脏CYP2E1酶活性和mRNA的表达均受到明显抑制(CYP2E1酶活性,P＜0.01;CYP2E1的mRNA表达1 g·kg-1组P＜0.05,10 g·kg-1组P＜0.01),CYP3A1酶活性虽显示明显升高(P＜0.01),但mRNA的表达没有显著变化;10 g·kg-1何首乌水提物组大鼠肝脏CYP1A2酶活性和mRNA的表达受到明显抑制(P＜0.01).     

何首乌配伍茯苓对大鼠肾脏和股骨的影响

目的 研究陕产野生何首乌配伍茯苓对大鼠肾脏以及股骨的影响.方法 将SD大鼠分为7组,每组每天灌服给药30 g·kg-1,连续给药90 d及停药恢复20 d.分别于90 d、110 d处死,采血及取股骨进行检测.结果 制何首乌组显著降低大鼠血清肌酐、尿素氮,对大鼠股骨抗骨折力及压碎力有显著的增强作用(P<0.01).制何首乌配伍茯苓组均能降低血清肌酐、尿素氮,对大鼠股骨抗骨折力及压碎力有一定的增强作用(P<0.05),何首乌组及何首乌配伍茯苓组大鼠的血清肌酐显著降低(P<0.01),何首乌组及何首乌配伍茯苓组对大鼠股骨的抗骨折力和压碎力无增强作用.结论 制何首乌、制何首乌配茯苓可能具有改善肾脏功能,增强股骨的抗骨折和压碎的作用.     

何首乌不同炮制品对大鼠血虚模型的补血作用

目的:考察何首乌不同炮制品对大鼠血虚模型的补血作用并探讨其最佳炮制方法。方法:140只SD大鼠,随机分为空白组、模型组、阳性药物组和11个不同何首乌炮制品组,每组10只,分别灌胃给予蒸馏水、血宝补血冲剂(阳性对照药)和不同何首乌炮制品(剂量均为生药含量2 g·kg-1),每天1次,连续10天,于第10天时取血检查各组动物红细胞、红血球蛋白、红细胞压积、全血和血浆黏度和凝血酶原时间等指标。结果:何首乌常压豆制24 h、常压酒豆制24 h、高压清蒸4 h和8 h、高压豆制6 h和8 h组、高压酒制6 h以及高压酒豆制8 h组能显著增加血虚大鼠模型的红细胞数量和血红蛋白数量,其中高压豆制何首乌8 h组红细胞和血红蛋白数增加效果最佳(P<0.01)。生何首乌、常压豆制24 h、酒制24 h、酒豆制24 h,高压清蒸4 h和8 h、高压豆制6 h和8 h以及高压酒制6 h能够改善血虚大鼠模型的血流变功能紊乱(P<0.05或P<0.01)。结论:何首乌以黑豆汁或酒为辅料,高压蒸制6~8 h,补血效果更好。     

制何首乌对大鼠造血祖细胞增殖及骨髓细胞黏附分子表达的影响

目的探讨制何首乌含药血清对造血祖细胞CFU-GM增殖的影响及制首乌对贫血大鼠骨髓细胞黏附分子表达的影响。方法制备制何首乌大鼠含药血清,体外半固体培养骨髓CFU-GM细胞;建立大鼠血虚动物模型,用流式细胞仪检测给药后大鼠骨髓单个核细胞CD44、CD54的表达水平。结果含药血清组大鼠骨髓CFU-GM集落数明显增多,与空白血清组比较差异显著(P<0.05);给药组CD44的表达与模型组无明显差异(P>0.05),但给药组CD54的表达显著低于模型组(P<0.05),且接近正常。结论制何首乌能促进造血祖细胞CFU-GM的增殖,并可改善贫血大鼠骨髓细胞黏附分于CD54的表达水平。     

制何首乌高效液相指纹图谱分析

目的:采用HPLC/UV建立制何首乌指纹图谱,探讨主成分含量与指纹图谱的关系.方法:指纹图谱分析应用Dia-mond C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,甲醇和水梯度洗脱,流速1.2mL·min-1,柱温40℃,检测波长280 nm.2,3,5,4‘-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷)含量测定采用Waters Novapak C18(3.9mm×150mm,5μm)色谱柱,乙腈-水(13:87)为流动相,流速1.0 mL·min-1,检测波长320nm,柱温40℃.结果:样品间指纹谱的相似性与二苯乙烯苷含量之间呈正相关.结论:为制何首乌的鉴定和质量评价提供了依据.     

何首乌炮制前后对大鼠肝脏的损伤比较及敏感指标筛选

比较何首乌生品和炮制品对大鼠肝脏损伤作用的差异。以生何首乌、制何首乌75%乙醇提取物按可比生药量(50 g·kg-1),连续灌胃给药6周,动态检测血清生化指标,6周后检查肝脏组织病理学改变,并采用主成分分析筛选何首乌肝损伤的敏感指标。实验结果显示生何首乌组大鼠血清ALT,AST,ALP,DBIL,TBIL显著性升高(P<0.05或0.01);IBIL,TBA显著性降低(P<0.05或0.01);制何何首乌组血清各项指标变化不明显。病理组织分析显示生何首乌组肝组织结构破坏明显,局部可见肝细胞坏死;制何首乌组可见肝脏组织基本正常,未见明显病变现象。该研究发现制何首乌对大鼠肝脏的损伤作用显著低于生何首乌,提示炮制能有效降低何首乌肝毒性;转氨酶等传统肝功能指标对生何首乌肝损伤作用不敏感,血清DBIL,TBIL含量可早期反映出何首乌引起的肝损伤,且作为临床合理用药监测的敏感指标。     

何首乌、制何首乌对大鼠免疫球蛋白影响的实验研究

[目的]研究何首乌、制何首乌对SD大鼠免疫球蛋白的影响.[方法]将大鼠分为7组,每日灌胃主药30g/kg,连续给药90d,测定大鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgA的含量和胸腺质量.[结果]给药组与对照组比较,给药60d时大鼠血清中IgM含量,何首乌组、何首乌配大剂量茯苓组、何首乌配小剂量茯苓组、制首乌组、制何首乌配小剂量茯苓组均呈显著性升高(P<0.05).给药90 d时何首乌配大剂量茯苓组、何首乌配小剂量茯苓组、制何首乌配大剂量茯苓组呈显著性升高(P<0.05).lgG含量仅给药90 d的何首乌配小剂量茯苓组降低,以上各组均具有统计学意义.[结论]给药60d、90d何首乌、制何首乌各给药组可以显著增加大鼠血清中IgM的含量,有可能对肝脏的损伤造成有一定意义的影响.     

制何首乌对大鼠肝脏P450酶5种亚型mRNA表达的影响

考察制何首乌水提物作用后大鼠肝脏P450酶5种亚型的mRNA表达变化。SD大鼠随机分为正常对照组、制何首乌高、低剂量组(5.40,1.08 g·kg~(-1)),连续灌胃给药7 d。给药结束后,检测大鼠血清生化指标,并采用实时荧光定量PCR测定各实验组大鼠肝脏P450酶5种亚型mRNA表达。实验结果显示AST在高、低剂量组都显著下降;ALT在低剂量组显著降低,在高剂量组显著升高。高、低剂量组的大鼠肝组织P450酶5种亚型mRNA的表达均下调,且下调程度与给药剂量成一定的剂量性依赖。特别是高剂量制何首乌水提物能够显著抑制大鼠的CYP1A2和CYP2E1的mRNA表达。该研究发现大剂量制何首乌水提物具有肝毒性,且随着剂量增加其肝损伤程度增加。其中制何首乌水提物5.40 g·kg~(-1)对大鼠肝CYP1A2和CYP2 E1的mRNA的表达有明显抑制作用。     

不同产地制何首乌HPLC指纹图谱研究及5种成分的含量测定

目的:通过测定不同产地制何首乌中二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、五没食子酰葡萄糖、没食子酸5种指标性成分的含量,建立制何首乌HPLC指纹图谱分析方法。方法:采用高效液相色谱法,Agilent Eclipse XDB-C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱,流速1.0 mL/min,波长254 nm,柱温30℃,对13批制何首乌药材的HPLC指纹图谱进行分析。结果:通过使用中药指纹图谱相似度评价软件分析,确定了29个共有峰,指认了五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚5个化学成分。结论:本实验所建立的方法可为不同产地不同批次制何首乌药材质量评价提供参考。     

何首乌和夜交藤药材指纹图谱研究与评价

目的 建立何首乌、夜交藤药材指纹图谱分析方法,并依据指纹图谱对两种药材进行比较,为科学评价与有效控制何首乌、夜交藤药材质量提供新方法.方法 何首乌和夜交藤分别用甲醇和醋酸乙酯超声处理,提取液用HPLC进行测定.HPLC法采用C18色谱柱,乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱,检测波长分别为265和290 nm,体积流量1mL/min,柱温30℃.结果 建立了何首乌、夜交藤药材HPLC指纹图谱,并对不同产地何首乌、夜交藤药材进行了相似度比较.测定结果显示不同产地药材存在较大差异,化学成分组成及质量分数存在一定差异.结论 所建立的方法简便、可靠,可用于不同产地何首乌、夜交藤药材的指纹图谱测定和质量评价,为全面有效控制何首乌药材的内在质量提供了依据.     

赤首乌和白首乌的HPLC指纹图谱鉴定研究

目的建立赤、白首乌HPLC指纹图谱鉴定方法。方法用RP-HPLC(DAD)法,梯度洗脱,测定赤、白首乌、加工炮制品及其何首乌粉的指纹图谱,并作相似度比较分析。结果何首乌不同样品指纹图谱相似度较好,而何首乌与白首乌的指纹图谱具有明显区别,何首乌炮制前后、白首乌加工前后也有差异。结论HPLC指纹图谱具有重现性好、特征性强、方法简便等特点,可用于赤、白首乌药材的鉴别。     

斑马鱼模型筛选何首乌肝毒性的物质基础

目的:用斑马鱼模型探索何首乌肝毒性物质基础,为何首乌肝毒性作用机制研究提供一定的理论依据。方法:将对实验前期所筛选出来的大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷(质量浓度分别为0. 000 73,0. 002 22,0. 015 05,0. 002 36,0. 198 95,0. 072 73 g·L~(-1))这6种何首乌中的化学成分,继续使用肝脏荧光转基因斑马鱼为动物模型,对受精后72 h的幼鱼连续给药3 d。分别测定给药后1,2,3 d的斑马鱼体内丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),谷胱甘肽(GSH)的活力和总胆红素(TBIL)的含量,分别对其进行切片分析,观察斑马鱼肝脏组织病理学改变。结果:大黄素、大黄酸、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷对斑马鱼体内ALT,AST,GSH的活力和TBIL的含量无明显影响,其斑马鱼肝组织显示正常;芦荟大黄素能显著降低斑马鱼体内ALT,AST,GSH的活力(P 0. 01),显著升高TBIL含量(P 0. 01);芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷能显著降低斑马鱼体内ALT,GSH的活力(P 0. 01),明显升高TBIL含量(P 0. 05,P 0. 01),对斑马鱼体内AST的活力无明显影响,同时此二者的斑马鱼肝组织均出现大片片状坏死,肝组织细胞发生明显形态改变,肝细胞排列不规则等。结论:何首乌中的芦荟大黄素和芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷可对斑马鱼肝脏产生毒性作用,提示芦荟大黄素和芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷可能是何首乌的肝毒性物质基础。     

制首乌辅料黑豆的质量控制研究

目的:建立制首乌辅料黑豆原料及其在炮制品中的质量控制方法。方法:通过比较黑豆、豆制何首乌和清蒸何首乌HPLC色谱图差异,确定制何首乌辅料黑豆的质量控制指标,在此基础上,建立豆制何首乌中黑豆的检测方法和黑豆原料的质量控制方法。结果:通过HPLC色谱图比较,检测到豆制何首乌中的微量大豆苷元。建立了制何首乌中黑豆的TLC色谱检测方法。采用HPLC,建立了黑豆原料中大豆苷元含量测定方法,测定了12批不同产地黑豆,以广东产黑豆大豆苷元含量最高。结论:本方法可作为制首乌辅料黑豆原料及其在炮制品中的质量控制方法。     

基于转运体的何首乌致肝损伤作用机制探讨

目的 阐明长期给药何首乌醇提物（PME）和水提物（PMW）致大鼠肝损伤的可能机制。方法 分别制备PME和PMW。雄性SD大鼠随机分为对照组、阳性对照异硫氰酸α-萘酯（ANIT 100 mg·kg^–1）组、PMW组（15 g·kg^–1）、PME组（12 g·kg^–1）。PME、PMW组大鼠给药剂量相当于60 g·kg^–1生药量,约为临床最大量的110倍,灌胃给药42 d,每日给药1次。ANIT组于第40天灌胃给药1次。采用试剂盒方法检测大鼠血清生化指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆汁酸（TBA）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）水平;采用苏木素-伊红（HE）染色法检测大鼠肝脏病理变化;采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定给药后大鼠肝脏组织中胆汁酸、胆红素代谢相关转运体有机阴离子转运多肽1a1（OATP1a1）、OATP1b2、多药耐药相关蛋白2（MRP2）、MRP3、胆盐外排泵（BSEP）、Na⁺-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、P-糖蛋白（P-gp）mRNA表达水平。结果 与对照组比较,PMW组大鼠血清中AST水平显著降低（P<0.05）,ALT和ALP水平显著升高（P<0.05）;PME组大鼠血清中AST水平显著降低（P<0.05）,ALT、TBA和ALP水平显著升高（P<0.01）;PMW组于PME组TBIL水平差异无统计学意义。病理结果显示,PME、PMW给药后均可引起不同程度的肝损伤,并且PME组表现更为严重。qRT-PCR结果表明,PMW和PME可同时影响胆红素和胆汁酸代谢过程中摄取和外排转运体的表达,均可显著下调外排转运体MRP2、BCRP mRNA表达水平,上调摄取转运体OATP1a1、OATP1b2 mRNA表达水平;PME可显著下调BSEP、P-gp、NTCP mRNA表达水平;PMW可显著上调NTCP、BSEP、P-gp mRNA水平;两者对MRP3 mRNA表达水平影响差异无统计学意义。结论 经过长期诱导后,PME、PMW均可引起大鼠肝损伤,其作用机制与影响胆红素和胆汁酸相关转运体相关,PME和PMW引发肝损伤程度存在差异,可能与两者对具体转运蛋白的作用不同相关。     

何首乌醇提物对人正常肝细胞L02的毒性作用及其机制

目的:探究何首乌醇提物(PME)对人正常肝细胞L02的毒性损伤和作用机制,为何首乌合理安全用药提供依据。方法:以PME(5,10,20 g·L^-1)作用于L02细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性;Hoechst 33342染色法观察细胞核形态;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡率;相关试剂盒检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)释放率、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;JC-1法检测细胞线粒体膜电位(MMP)变化;流式细胞术检测活性氧(ROS)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前体(pro Caspase-9)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3前体(pro Caspase-3)的表达水平。结果:与空白组比较,L02细胞在PME作用下存活率下降,呈时间浓度依赖性;Hoechst 33342染色后荧光下可见细胞核皱缩,碎裂,染色质凝集;Annexin V-FITC/PI双染法结果表明PME20 g·L^-1组凋亡率上升;PME 20 g·L^-1组LDH释放率显著增加(P<0.01),细胞内ROS水平显著上升(P<0.01),SOD活力显著下降(P<0.01),PME 5,10,20 g·L^-1组MMP明显降低(P<0.05)。与空白组比较,随着PME给药组浓度增加,PME 10,20 g·L^-1组pro Caspase-3,pro Caspase-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),PME 5,10,20 g·L^-1组Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),PME 20 g·L^-1组Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:PME对L02细胞存在毒性损伤作用,可一定程度破坏肝细胞的结构,促进ROS水平升高,诱导氧化应激,激活线粒体途径,活化凋亡通路相关蛋白引起肝细胞损伤,提示ROS介导的线粒体通路参与了PME诱导肝细胞凋亡的过程。     

《中华人民共和国药典》2020年版收载何首乌和制何首乌质量标准【鉴别】项的商榷

目的 讨论完善《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版何首乌及制何首乌的薄层色谱鉴别项。方法 考察超声及加热回流2种不同的样品制备方式,以及用二氯甲烷-甲醇-甲酸、乙酸乙酯-石油醚-甲酸展开系统代替原标准中三氯甲烷-甲醇展开系统的可行性,同时比较了不同显色条件。结果 2种制备方式制得的样品在相同的展开条件下展开结果并没有明显差异,超声提取操作更加简便;以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）和石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5.0∶1.0∶0.3）代替三氯甲烷-甲醇展开系统后,喷10%硫酸乙醇显色剂并在紫外灯365 nm下检视,薄层色谱板上斑点明显增多且分离效果好,较《中国药典》2020年版何首乌和制何首乌薄层色谱鉴别条件更理想。结论 改进后的方法毒性低、简便易行、可行性良好,为进一步完善《中国药典》2020年版何首乌和制何首乌质量标准提供参考。     

基于谱效相关的何首乌抗血小板聚集药效物质研究

应用体外抗血小板聚集生物活性检测方法,并结合化学指纹图谱进行谱效相关分析,探索何首乌抗血小板聚集的活性物质。采用体外抗血小板聚集法进行检测,何首乌50%乙醇提取物的抗血小板聚集作用强于10%或90%的乙醇提取物,超声提取优于回流提取。对正交试验的不同提取物进行抗血小板聚集活性评价,抑制率在32.03%~74.56%。谱效相关分析结果表明,反式二苯乙烯苷、顺式二苯乙烯苷、儿茶素与抗血小板聚集活性的相关系数较高且具有统计学意义,分别为0.963(P0.01),0.902(P0.01)和0.656(P0.05);进一步对上述3种与活性相关系数较高化合物的单体进行活性验证,均有较好的抗血小板聚集活性;最后根据3种单体化合物在何首乌中的含量差异计算相对活性贡献度可知,反式二苯乙烯苷是何首乌体外抗血小板聚集的主要活性物质。