甘草β-AS基因时空表达模式研究

目的:揭示甘草β-AS基因表达的时间特异性及空间特异性。方法:通过PCR扩增获得不同时间、不同部位甘草β-AS基因的cDNA序列,琼脂糖凝胶电泳后用Gel-Pro分析软件对电泳条带进行光密度分析,计算其相对表达量。结果:空间特异性实验显示β-AS基因在甘草的地上部分没有表达,地下组织中,新陈代谢最旺盛的根尖部分表达量高于根茎。时间特异性实验显示甘草β-AS基因在全年中的表达水平可分为4个阶段。12月至2月,β-AS基因表达低于检测水平;3月至5月,β-AS基因开始表达,表达量逐渐上升;5、6及8、9月,β-AS基因表达量保持较高水平;10、11月表达量开始下降。结论:在研究甘草β-AS基因时,应该选取转录水平较高的5、6及8、9月份;选取转录水平较高的根尖作为提取总RNA的部位。     

Real-time PCR分析锰对甘草β-AS基因表达的影响

目的探讨不同浓度的锰处理对甘草β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因表达量的影响。方法以一年生甘草移栽苗为试验材料,设置5个锰浓度水平,分别为0,1.81,18.1,36.2和54.3 mg/L,利用Real-time PCR(荧光实时定量PCR)方法对甘草β-AS基因的Ct值进行测定并计算其相对表达量。结果随着锰处理浓度的增加,甘草β-AS基因的相对表达量呈现先升高后下降的趋势,在18.1 mg/L浓度处理时达到最大值为12.43,分别是对照(0 mg/L),36.2 mg/L和54.3 mg/L处理的2.79,1.47,2.88倍,且差异极显著(P<0.01)。结论锰对甘草β-AS基因的表达具有一定的促进作用,适当质量浓度的锰处理能够显著提高甘草β-AS基因的相对表达量。     

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性与甘草酸含量的相关性分析

目的:揭示甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的多态性,并阐述HMGR基因多态性与甘草酸含量的相关性.方法:以甘草酸含量差异显著的甘草个体为材料,通过RT-PCR法扩增其HMGR基因编码区;与载体pMD19-T连接后克隆测序;通过多重比对进行HMGR基因多态性分析,及与甘草酸含量之间的关联分析.结果:HMGR基因编码区多态性包括整码突变、碱基置换突变、拷贝数多态性及等位基因杂合;HMGR编码氨基酸序列中存在以下4种类型变异,即-HSL,-HSV,GALLV,GALSV,其中-HSV型为甘草中普遍存在类型,-HSL型为甘草酸低含量甘草的特有类型,GALSV型为甘草酸高含量甘草特有类型.结论:甘草HMGR基因编码区具有丰富的多态性,和甘草酸含量之间具有相关性.     

道地产区甘草遗传多样性的ISSR分析

目的:对4个核心道地产区甘草的遗传多样性进行研究,分析其遗传变异程度,为探讨道地药材的遗传机制奠定基础。方法:采用ISSR分子标记技术研究来自4个产地155个甘草个体的遗传多样性。结果:8条引物共扩增出56条多态性条带,占总带数的75.68%,每条引物扩增多态位点百分率(PPB)在44.44%～100%。聚类分析显示,各产地野生品基本能够各聚一类,内蒙古、宁夏、甘肃甘草遗传特征较为稳定,陕西甘草的变异幅度较大。结论:不同道地产区甘草的遗传变异具有明显的地域性特征,甘草道地药材的形成具有遗传基础。     

甘草β-香树酯醇合成酶的多态性对其催化效率的影响研究

目的:分析与高、低甘草酸含量密切相关的β-AS(A-T)基因型和β-AS(G-C)基因型在酿酒酵母中异源表达的情况,比较这2种基因型对所生成的β-香树酯醇产量的影响,从而为甘草分子育种奠定基础。方法:将克隆的甘草β-AS基因亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pY26中,从大肠杆菌中筛选出含有目的基因的重组质粒PY-β-AS,用醋酸锂法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScI中,经半乳糖诱导后,收集菌体,用气相色谱/质谱(GC-MS)分析生成的β-香树酯醇的量。结果:甘草β-AS基因所编码的酶能催化酵母内源性2,3-氧化鲨稀生成β-香树酯醇,GC-MS分析显示甘草β-AS(A-T)基因型和β-AS(G-C)基因型所生成的β-香树酯醇的质量分数分别为19.08%,1.40%。结论:甘草β-AS(A-T)基因型的催化效率高于β-AS(G-C)基因型,可为甘草分子育种奠定基础。     

金银花及部分中药材黄酮合成酶Ⅱ基因多态性分析

目的揭示金银花及部分中药材黄酮合成酶Ⅱ(flavone synthasesⅡ)(FSⅡ)基因多态性,分析FSⅡ基因在种内及其不同品种、种间及科属间的差异。方法以相同生长环境下的金银花栽培品种及近缘种为材料,通过RT-PCR扩增基因编码区,测序比对,并将结果与GENBANK上大豆、甘草等部分中药材的相同基因片段进行比对。结果 FSⅡ基因编码区存在变异,部分变异会引起FSⅡ蛋白改变。结论金银花FSⅡ基因在本文所分析的编码区序列有多态性,基因在种内有一定差异,科属间差异大,与遗传学亲缘远近相关。     

甘草鲨烯合酶基因多态性对其编码酶催化效率影响的研究

目的:分析甘草鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因多态性及其对编码酶催化效率的影响,为揭示优质甘草形成的分子机制奠定基础.方法:提取甘草总RNA; PCR扩增其SQS基因编码序列;测序后分析SQS序列的多态性;将具有明显差异的4个甘草SQS序列(SQS1C,SQS1F,SQS2A,SQS2B)连入表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21;IPTG诱导蛋白表达,纯化后用于体外酶促反应;GC-MS鉴定产物并比较相对含量.结果:甘草SQS1基因存在单核苷酸多态性(single nuclear polymorphisms,SNPs)、插入与缺失多态性(InDel)、选择性剪接(AS)多态性;SQS2基因只存在SNPs.氨基酸序列分析显示,SQS1非保守替换占53.94％,结构域中有2个位点突变;SQS2非保守替换占60％,结构域中有1个位点突变.在4种编码酶的体外酶促反应中,利用GC-MS均能检测到产物生成;SQS1F编码酶积累鲨烯的能力高于其他序列.结论:甘草SQS基因具有丰富的多态性,其编码酶催化效率差异显著,这可能是优质甘草形成的分子基础.     

太空环境对甘草中甘草酸生物合成相关基因的诱变作用分析

目的:探讨太空环境对甘草酸相关基因的诱变作用分析.方法:利用返回式卫星搭载甘草,18 d后返回地球,搭载种子返回地面后与对照组同时种植于实验田中,采集三年生甘草叶子,对甘草酸形成相关基因ITS序列,β-香树酯醇合成酶基因的多态性以及基因表达差异进行了研究.结果:甘草经过卫星搭载后,甘草酸相关基因ITS序列没有发生变化,而甘草酸合成关键基因β-香树酯醇合成酶基因某些位点呈现了差异性,并且太空环境对甘草酸合成关键基因β-香树酯醇合成酶基因表达有一定影响.结论:太空环境对甘草酸相关形成和表达产生一定影响,这些变化对于揭示太空环境对甘草酸形成的基因机制具有重要意义,并且对于后期选育甘草优良种质奠定基础.     

竹节参β-香树素合成酶基因克隆及生物信息学分析

目的克隆三萜皂苷代谢关键酶竹节参β-香树素合成酶(β-AS)基因,采用生物信息学分析其序列及其结构与功能,为竹节参合成及调控机制研究提供基础。方法提取竹节参叶片RNA,扩增β-AS基因编码区序列,将序列连接至pMDTM18-T载体进行克隆、测序,并利用生物信息学分析比较移栽品和栽培品竹节参β-AS蛋白的特征,构建竹节参β-AS蛋白的系统进化树。结果克隆出移栽品和栽培品竹节参的β-AS基因编码区序列,开放阅读框(ORF)均为2 286 bp,编码761个氨基酸。2个品种β-AS蛋白在细胞中的基本结构和功能是一致的,但两者之间存在8个氨基酸差异,使两者的蛋白质二级结构、三级结构磷酸化位点以及理化性质存在差异,可能会导致两者的催化活性存在差异。结论克隆得到野生移栽品和栽培品竹节参的β-AS基因,并对2个品种β-AS蛋白进行了生物信息学分析和比较,为今后研究该酶的结构特征、功能以及其与皂苷含量的相关性提供参考,也为竹节参合成生物学研究提供了生物基因元件。     

甘草 HMGR, SQS1, β-AS 合酶基因 CNVs 检测体系的建立

目的:建立可用于甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs测定的稳定可靠的检测体系。方法:利用Real timePCR方法对甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs进行测定。结果:在HMGR,SQS1,β-AS合酶基因以及内标基因lectin的定量检测实验中,其定量反应的Ct值分别在25.82～25.88,29.01～29.08,15.52～15.56,19.06～19.08变化,SD分别是0.033,0.032,0.024,0.011,其CV分别是0.12%,0.22%,0.16%,0.06%。结论:所建立的Real time PCR体系重复性好,检测系统工作稳定可靠,可用于甘草HMGR,SQS1,β-AS基因的CNVs筛选。     

红树林植物杯萼海桑法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的 对杯萼海桑Sonneratia alba萜类化合物生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因的编码cDNA序列进行克隆,为研究杯萼海桑萜类化合物生物合成与基因调控奠定基础.方法 结合杯萼海桑根的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR方法克隆杯萼海桑FPS (SaFPS)基因的编码区cDNA.结果 PCR扩增了一个长1 029 bp的基因片段,该片段编码由342个氨基酸组成的SaFPS.同源性比对结果显示基因编码蛋白与甘草的FPS具有氨基酸一致性达86％.其具有异戊烯基转移酶的2个典型保守功能域.进化树分析结果显示,与甘草Glycyrrhiza uralensis、苜蓿Medicago truncatula、羽扇豆Lupinus albu具有较近的亲缘关系.实时荧光定量PCR结果显示SaFPS基因在花中表达量较高,果实、茎、叶中表达量相对较低.结论 首次从红树林植物杯萼海桑中克隆FPS基因获得其编码区序列,SaFPS基因具有组织表达特异性.本研究为分析基因表达特性及其在生物合成中的功能奠定基础.     

硼等4种元素对甘草酸生物合成关键酶基因表达的RT-PCR分析

目的研究B、Mn、Zn和Mo等4种微量元素对甘草酸生物合成关键酶鲨烯合成酶(SQS)和β-香树脂醇合成酶(β-AS)基因表达的影响。方法设置上述4种微量元素0,0.05%,0.1%,0.15%和0.3%5个不同浓度水培乌拉尔甘草幼苗,9天后,取其根部半定量PCR检测。结果能够促进SQS基因表达的是高和极高浓度的Zn元素(0.15%和0.3%)和中、高和极高浓度的Mo元素(0.1%,0.15%和0.3%);Zn元素所有处理浓度均可明显提高β-AS基因的表达,随着Mo元素处理浓度的提高,β-AS基因的表达量增加。结论 Zn和Mo两种元素对乌拉尔甘草甘草酸生物合成关键酶基因表达有明显的促进作用。     

环境对栽培甘草遗传多样性的影响研究

目的研究道地产区的甘草经过栽培后遗传多样性的变化,从分子层面探讨中药离其土,则失其味也的科学性,为栽培甘草选育优良品种提供依据。方法采用ISSR-PCR技术对6组24个栽培甘草样品进行遗传多样性分析。结果用6条引物对24个样品DNA进行PCR扩增,共得到43个条带,其中29个条带具有多态性,多态性百分比为67.45%。用NTSYS-pc2.10分析软件进行聚类分析,基本可将不同道地产区的栽培甘草较好的区分,但同一产区种子栽培的甘草与种苗栽培的甘草并不能较好的聚类。结论栽培甘草不同产地遗传多样性都很丰富,同一产地的甘草由于不同的栽培代数遗传多样性有所改变,说明甘草经过多代有性繁殖后遗传多样性会有部分丢失,这可能与环境的选择有关,为优质甘草的栽培育种提供理论基础。     

光果甘草CHS基因的克隆与多态性分析

目的:克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因并分析其基因多态性。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从光果甘草主根中扩增得到CHS c DNA序列,测序并运用生物信息学软件对测序结果进行分析。结果:克隆得到19条长度为1 175 bp的光果甘草CHS c DNA序列,测序结果显示其一致性99.10%,存在81个变异位点,可分为17种单倍型;氨基酸序列分析显示,这19条c DNA序列共编码14种氨基酸序列类型,一致性99.34%,存在25个变异位点。生物信息学分析表明光果甘草CHS c DNA序列编码蛋白为稳定性亲水蛋白,平均相对分子质量42.6 k Da,等电点5.75~6.21,不含信号肽,无跨膜区,保守结构域包含1个查尔酮合酶超家族结构域,二级结构以α螺旋和无规卷曲为主。同源性分析显示,光果甘草CHS c DNA序列与乌拉尔甘草G.uralensis以及胀果甘草G.inflata在进化关系上最近,与小立碗藓Physcomitrella patens在进化关系上最远。结论:成功克隆并得到了光果甘草CHS c DNA序列,且这些序列编码区具有丰富的多态性。     

中药中的霉菌毒素对细胞内基因修复系统的影响

目的 观察中药中霉菌毒素对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β(DNApolβ)表达量的影响,研究中药不良反应的机制和互隔交链孢酚致细胞变异的机制.方法 体外培养NIH/3T3细胞,用不同浓度的霉菌毒素——互隔交链孢酚(AOH)加入培养液影响细胞.用RT-PCR方法从细胞全RNA中扩增出DNA聚合酶β基因cDNA序列,同时扩增β-actin进行半定量分析了解其表达量的变化.结果 成功从NIH/3T3细胞中扩增了DNA聚合酶β基因cDNA,通过半定量分析发现随着药物浓度的增高,DNA聚合酶β表达量上调.结论 霉菌毒素可导致细胞中的DNA聚合酶β表达量上调从而影响基因修复系统的功能,AOH的作用浓度越高,DNA聚合酶β基因表达量越高.     

根据基因探讨药用植物的变异和生药基原

以检测RFLPs进行各种药用植物种内或种间变异的分析,并把生药中残存基因的特定区域扩增克隆,根据检测其碱基序列的差异,来探讨用DNA鉴定生药的可能性。 1.三岛柴胡地理变异的分析:三岛柴胡(Bupleurum falcatum)在日本各地均有分布,为多态性强的种,由于产地不同其体细胞染色体数目、叶序、柴胡皂甙含量等形状和性质有差异,对日本8个产地野生的样品,在基因水平上进行了地理系统之间的遗传关系分析。首先选用御种植物,用RFLP图谱对个体变异进行探讨,但调查范围内同一种群未见个体变异。用各种限制酶进行RFLP的检测,在以Dra Ⅰ,Kpn Ⅰ,Taq Ⅰ进行限制酶酶切     

基于鱼腥草 ISSR 扩增条带信息熵的一次投料量研究

目的:从中药多态性表达的另一种形式——中药基因多态性出发,应用DNA扩增的多态性条带所携带的信息熵探讨鱼腥草一次最小投料量。方法:采用ISSR分子标记对同一GAP产地鱼腥草进行多态性分析,将扩增的条带信息转化成信息熵,运用数学模型测算鱼腥草的最小一次投料量。结果:将筛选出的9条ISSR引物对同一GAP产地46株鱼腥草的DNA样品进行扩增,得到134条总条带,其信息熵H=0.365 6～0.978 6,RSD 14.75%,一次投料量W=11.22 kg(863株)。结论:从基因多态性角度测算出了鱼腥草的另一个"最小投料量",这个量与从指纹图谱角度得到的量存在较大差别,这为探索适宜临床疗效的、能真正指导临床合理用药的"一次投料量"奠定基础,最终实现单味中药剂型改革。     

金银花HQT基因变异类型与其绿原酸含量相关性

目的揭示金银花HQT基因的变异情况,并阐述HQT基因变异类型与绿原酸含量的相关性。方法以不同产地及品种的金银花为材料,通过RT-PCR法扩增其HQT基因编码区,直接测序,通过多重比对进行HQT基因变异类型分析,进而对其与绿原酸含量之间的相关性进行分析。结果 HQT基因编码区变异包括碱基置换突变、插入/缺失突变,部分变异会引起HQT蛋白的改变,并影响绿原酸的表达量。结论金银花HQT基因编码区具有丰富的变异,与忍冬种间分类及绿原酸含量之间具有一定的相关性。     

基于叶绿体基因序列黄精和多花黄精遗传多样性分析

目的 基于叶绿体基因联合序列分析不同地理居群黄精和多花黄精遗传多样性.方法 目的序列经PCR扩增、测序、拼接和比对后,DnaSP分析单倍型多态性,Permut计算遗传分化,Arlequin分析居群标准分子变异,最后构建基于遗传距离的系统发育树.结果 94条黄精序列存在2个多态性位点,得到3个单倍型,居群间总遗传多样性为...     

快速老化小鼠脑组织Aβ、CypD单核苷酸多态性及“三焦针法”对其作用的研究

[目的]研究快速老化小鼠SAMP8和同品系正常小鼠SAMR1海马、皮质神经元中淀粉样多肽蛋白(Aβ)、亲环蛋白D(CypD)差异表达是否与其基因CDS区DNA序列单核苷酸多态性(SNP)有关,以及"三焦针法"对Aβ、CypD基因CDS区DNA序列是否有干预作用。[方法]选取快速老化小鼠SAMP8为模型,采用PCR扩增、SNP一代测序等法比对小鼠皮质、海马组织中Aβ基因CDS区引物设计位点(17个)以及CypD基因CDS区引物设计位点(6个)的DNA序列,并观察"三焦针法"对Aβ、CypD基因CDS区DNA序列是否有干预作用。[结果]SAMR1正常对照组、SAMP8对照组小鼠皮质、海马Aβ和CypD基因CDS区引物设计位点DNA序列均未发生SNP,针刺组小鼠皮质、海马Aβ和CypD基因CDS区引物设计位点DNA序列未发生变化。[结论]Aβ、CypD mRNA及蛋白差异表达与其基因CDS区DNA序列SNP无关,"三焦针法"对Aβ、CypD基因CDS区DNA序列无干预作用,并推测AD的发生与Aβ、CypD基因CDS区DNA序列SNP无关,"三焦针法"并非通过改变Aβ、CypD基因CDS区DNA序列的途径实现对Aβ、CypD mRNA及蛋白含量的调节作用。