人生长分化因子-9(GDF-9)基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建人生长分化因子-9(GDF-9)基因真核表达载体并分离纯化获得重组GDF-9蛋白。方法:以cDNA克隆为模板,PCR法扩增出人GDF-9基因,将目的基因连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/GDF-9,脂质体法将重组质粒转染到HEK293T细胞,通过Western blotting检测GDF-9蛋白表达。结果:以双酶切及基因测序鉴定构建的重组真核质粒,Western blotting方法证实人GDF-9基因正确表达。结论:成功构建人GDF-9基因pcDNA3.1(+)/GDF-9重组质粒,并在真核细胞系表达,获得重组GDF-9蛋白,为进一步研究GDF-9基因提供便利工具。     

HBXIP真核表达载体及转基因人子宫内膜癌细胞系的构建研究

目的构建携带肝炎BX-相互作用蛋白(HBXIP)基因的重组pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP质粒,将其转染人子宫内膜癌HEC-1A,建立稳定表达HBXIP蛋白的细胞株,并检测HBXIP在人子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达。方法实验于2014—2015年于中国医科大学附属第一医院中心实验室进行。聚合酶链反应(PCR)逆转录c DNA扩增HBXIP基因全长,亚克隆到真核表达载体pc DNA3.1-myc-his A内,构建出重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP,酶切及DNA测序证实重组质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP正确插入HBXIP的核苷酸序列。证实HBXIP基因成功插入空载体pc DNA3.1-myc-his A,脂质体法将pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染HEC-1A细胞,并用Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌细胞HEC-1A中HBXIP蛋白表达。结果 (1)HBXIP总RNA在提取进程中没有发生明显的降解,说明获得的RNA和m RNA完整。PCR扩增后的产物在约276 bp处出现明显的特异性条带,与理论预计的c DNA片段长度一致。(2)HBXIP基因真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP成功构建,重组质粒经pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的HBXIP基因片段。(3)Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌HEC-1A细胞中HBXIP蛋白表达。pc DNA3.1-myc-his A组与pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP组HBXIP蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论 HBXIP基因片段被成功插入真核表达载体质粒pc DNA3.1-myc-his A的多克隆位点,成功构建了HBXIP基因的重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP。构建的HBXIP基因重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染HEC-1A细胞后,可在HEC-1A细胞中稳定表达,为进一步研究HBXIP基因奠定了基础。     

小鼠雄激素受体真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆小鼠雄激素受体(androgen receptor,AR)基因的cDNA,构建AR真核表达载体,并在睾丸支持细胞TM4中进行表达和鉴定。方法:应用RT-PCR法从小鼠睾丸中扩增AR,将测序正确的PCR产物克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体中,再将载体以脂质体方式转染至TM4细胞系中,通过G418筛选稳定转染AR的TM4细胞株,以RT-PCR法和Western blotting法检测转染前后AR在TM4细胞系中的表达情况。结果:RT-PCR法和Western blotting法检测的结果显示,转染pcDNA3.1(-)/AR质粒的细胞中AR基因的表达水平显著高于转染pcDNA3.1(-)质粒的对照组。结论:成功构建了小鼠AR真核表达载体pcDNA3.1(-)/AR和稳定转染的TM4细胞系,为进一步研究AR在睾丸支持细胞中的作用及其分子机制建立了细胞模型。     

NOSTRIN基因克隆及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的 :构建内皮型一氧化氮合酶运输介导物 (endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer ,NOSTRIN)基因的真核表达载体 ,通过质粒转染人脐静脉内皮细胞 (humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)获得高表达NOSTRIN基因的细胞克隆。方法 :构建真核表达载体pcDNA3.1 NOSTRIN ,采用脂质体介导将重组质粒导入体外培养的HUVEC ,Westernblot检测转染细胞和未转染细胞中NOSTRIN蛋白质的表达。结果 :成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NOSTRIN ,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达NOSTRIN的细胞克隆 ;Westernblot显示转染前后的细胞均有 5 8kD的蛋白质表达 ,转染后表达量明显增高。结论 :重组质粒pcDNA3.1 NOSTRIN经转染能在HUVEC细胞中高效表达 ,为进一步研究NOSTRIN对HUVEC的生物学影响奠定了基础     

人HoxA10基因真核表达载体构建和表达产物的鉴定

目的:克隆人子宫内膜容受性标志分子HoxA10基因的cDNA,转入真核细胞载体,并在293T细胞中进行表达和鉴定。方法:应用RT-PCR法从人子宫内膜组织中扩增HoxA10基因的cDNA编码区序列,将PCR产物克隆至pCMV-HA真核表达载体中,测序鉴定该载体。以LipofectamineTM2000将该载体转染入293T细胞中,Western blotting检测HoxA10蛋白的表达。结果:PCR扩增出的人HoxA10基因cDNA正确克隆到了pCMV-HA载体,成功构建了pCMV-HA-HoxA10重组载体;将其转染入293T细胞,用HoxA10和HA抗体进行Western blotting,均检测到了融合蛋白的表达。结论:携带有HA蛋白标签的人HoxA10基因的真核表达载体pCMV-HA-HoxA10克隆及表达成功,为进一步研究HoxA10与其它蛋白质的相互作用以及建立HoxA10的荧光素酶报告基因分析系统奠定了基础。     

小鼠富含半胱氨酸分泌蛋白-1真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建小鼠富含半胱氨酸分泌蛋白-1(Crisp-1)真核表达载体,并观察其在COS-7细胞中的表达。方法:从小鼠附睾组织中提取总RNA,RT-PCR扩增Crisp-1基因开放阅读框(ORF),将目的基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1上,经脂质体介导转染COS-7细胞,并利用间接免疫荧光和RT-PCR检测其在COS-7细胞中的表达。结果:酶切电泳鉴定结果显示Crisp-1基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与基因库(GeneBank)中的Crisp-1序列相符。脂质体转染后,间接免疫荧光和RT-PCR结果均表明重组质粒pcDNA3.1-Crisp-1能在COS-7细胞中表达。结论:成功获得了能在COS-7细胞中表达的小鼠Crisp-1DNA疫苗的真核表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1,为后续研究其生物学活性及免疫避孕效应奠定了基础。     

RNAi沉默STAT3基因对人宫颈癌SiHa细胞定植和侵袭的影响

目的：探讨信号转导因子与转录激活因子3（STAT3）短发夹RNA（shRNA）真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞定植和侵袭能力的影响。方法：针对人STAT 3的基因设计并合成编码小干扰RNA（siRNA）的寡核苷酸,克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,构建STAT 3基因shRNA真核表达质粒,脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）法分别检测STAT 3基因的mRNA及蛋白表达水平;软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测SiHa细胞的定植和侵袭能力。结果：构建的STAT 3基因shRNA真核表达载体成功地转染人宫颈癌SiHa细胞,细胞STAT3蛋白及mRNA表达均下降（P ＜0.05）;SiHa细胞在软琼脂中形成的克隆数和穿透Matrigel膜的细胞数均明显减少（P ＜0.05）。结论：STAT 3基因shRNA真核表达载体通过下调STAT 3基因表达,抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力。     

GRIM-19基因表达及沉默对宫颈癌细胞株SiHa细胞中核转录因子STAT3表达的影响

目的:构建pEGFP-C2-GRIM-19真核表达载体并设计GRIM-19siRNA干扰序列,以探讨GRIM-19表达水平的变化对SiHa细胞中核转录因子STAT3表达的影响。方法:用RT-PCR法从SiHa细胞中扩增出带HindⅢ、BamHI酶切位点的GRIM-19基因片段,将GRIM-19基因片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上。分别将pEGFP-C2-GRIM-19及GRIM-19siRNA通过脂质体转染入SiHa细胞48h后,通过Western-blot检测GRIM-19、STAT3的表达。结果:成功构建pEGFP-C2-GRIM-19真核表达载体,转染后可见GFP表达及STAT3表达降低,转染GRIM-19siRNA后可见GRIM-19表达降低及STAT3表达升高。结论:在宫颈癌细胞株中GRIM-19具有调控STAT3表达水平的作用。     

LV-EGFP-inhba过表达慢病毒载体转染大鼠卵巢颗粒细胞的实验研究

目的:构建inhba基因过表达的慢病毒载体(lenti-EGFP-inhba),观察体外转染大鼠卵巢颗粒细胞的有效性。方法:p LVX-EGFP-3FLAG质粒系统经EcoRI酶切使之线性化。inhba基因(NM_008380)PCR扩增后同源重组入线性化的表达质粒系统。Western blot法检测表达质粒目的基因表达。将构建成功的慢病毒载体(lenti-EGFP-inhba)转染大鼠卵巢颗粒细胞(MOI=20),检测目的基因表达。结果:PCR扩增产物与目的基因大小吻合,重组质粒系统经转化后获得阳性克隆,转染293T细胞可见EGFP-inhba融合蛋白表达。Western blot获得76k Da分子量大小阳性条带,与融合蛋白分子量大小一致。lentiEGFP-inhba体外转染大鼠卵巢颗粒细胞,倒置荧光显微镜下可见EGFP表达。结论:lenti-EGFP-inhba表达载体成功构建,并可在体外有效转染大鼠卵巢颗粒细胞。     

同源框基因HOXAll顺式作用元件具有启动子活性及孕激素应答元件功能

目的:探讨HOXA11基因顺式作用元件是否存在启动子及孕激素应答元件序列.方法:采用PCR技术以人基因组DNA为模板.扩增含HOXA11顺式作用元件序列的DNA片段;将扩增片段与无启动子的强化绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1多克隆位点连接,构建HOXA11基因顺式作用元件的表达载体pEGFP-HOXA11;用脂质体法将表达载体转染到Ishikawa细胞中,在荧光显微镜下观察重组HOXA11基因顺式作用元件的启动活性,以及转染细胞经孕酮处理后细胞内绿色荧光蛋白表达水平的变化.结果:成功地将HOXA11基因顺式作用元件克隆到报告基因载体pEGFP-1中,酶切和PCR鉴定以及DNA序列分析无误;转染pEGFP-HOXA11,表达载体的Ishikawa细胞能表达发出绿色荧光的报告基因蛋白,而且经孕酮处理后绿色荧光强度明显增强.结论:HOXA11基因顺式作用元件具有启动子活性和孕激素应答元件功能.     

同源框基因HOXA11顺式作用元件具有启动子活性及孕激素应答元件功能

目的:探讨HOXA11基因顺式作用元件是否存在启动子及孕激素应答元件序列。方法:采用PCR技术以人基因组DNA为模板,扩增含HOXA11顺式作用元件序列的DNA片段;将扩增片段与无启动子的强化绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1多克隆位点连接,构建HOXA11基因顺式作用元件的表达载体pEGFP-HOXA11;用脂质体法将表达载体转染到Ishikawa细胞中,在荧光显微镜下观察重组HOXA11基因顺式作用元件的启动活性,以及转染细胞经孕酮处理后细胞内绿色荧光蛋白表达水平的变化。结果:成功地将HOXA11基因顺式作用元件克隆到报告基因载体pEGFP-1中,酶切和PCR鉴定以及DNA序列分析无误;转染pEGFP-HOXA11表达载体的Ishikawa细胞能表达发出绿色荧光的报告基因蛋白,而且经孕酮处理后绿色荧光强度明显增强。结论:HOXA11基因顺式作用元件具有启动子活性和孕激素应答元件功能。     

精子蛋白SP22在毕赤氏酵母中的表达、纯化和鉴定

目的:克隆人睾丸精子蛋白SP22基因在毕赤氏酵母中表达,并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:RT-PCR克隆出睾丸SP22基因,导入pGEM-T克隆载体。再亚克隆到酵母真核分泌型表达载体pHIL-S1。电击转化将重组质粒pHIL-S1/SP22导入GS115酵母菌株。筛选出阳性克隆,以甲醇诱导分泌表达。镍离子亲和层析法从培养上清中纯化目的蛋白。结果:SP22编码序列与人致癌基因DJ1基本相同。重组质粒正确插入酵母基因组后,甲醇诱导SP22表达并分泌至培养上清中,表达量约占上清总蛋白的20%。纯化出的目的蛋白为糖蛋白,能被免疫印迹证实。结论:成功构建了酵母GS115/pHIL-S1/SP22重组型表达菌株,并纯化获得糖基化的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构及生理功能打下了基础。     

非融合膜外型猪卵透明带-3β蛋白在原核系统中的表达

目的:通过基因工程的方法在原核表达系统中表达去除了信号肽和跨膜区的膜外型猪卵透明带蛋白pZP3β。方法:设计适宜引物,采用PCR方法,在基因水平对膜外型pZP3β的翻译起始序列进行适当调整,获得的基因克隆入pET-3c载体,并进一步在大肠杆菌E.coli BL21(DE3) pLysS中表达。结果:得到表达率约10%的非融合膜外型pZP3β蛋白的表达,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:外源蛋白在不改变氨基酸序列条件下,在基因水平的适当调整可以有效提高其表达率。     

携带OPCML基因的慢病毒表达质粒的构建

目的:建立携带和表达OPCML基因的慢病毒(lentiviral viruses,LV)表达质粒。方法:用内切酶将OPCML基因从已构建的表达质粒pcDNA3-OPCML上切下,插入慢病毒载体pWPI-GFP中,构建慢病毒表达质粒pWPI-OPCML,通过酶切、测序和检测验证OPCML蛋白后,将pWPI-OPCML、pCMV-dR8.74和pMDG共转染包装细胞293T,获得重组慢病毒,再感染靶细胞A2780,通过检测标志蛋白-绿色荧光蛋白(GFP)和目的蛋白OPCML进一步验证pWPI-OPCML在细胞中OPCML的表达。结果:(1)pWPI-OPCML中携有正确的OPCML基因,并能在人类细胞中表达;(2)pWPI-OPCML共转染包装细胞293T能产生重组病毒;(3)目的基因OPCML能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞A2780,并达到稳定的表达,转导效率几乎达100%,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到OPCML和GFP蛋白在靶细胞中的表达。结论:pWPI-OPCML能在人细胞中表达OPCML蛋白,共转染包装细胞获得的重组慢病毒能感染人细胞,作为转基因的工具,具有高效性。     

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。     

猪卵透明带-3β蛋白核心片断在E.coli中的表达

目的:探讨通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达猪卵透明带蛋白pZP3b的核心片断。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第44-306个氨基酸的pZP3β核心片断的DNA序列,克隆入pET-3c载体进而在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中表达。结果:表达的pZP3β核心蛋白占菌体总蛋白的15%,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:pZP3β核心片断在大肠杆菌中获得较高的表达,有利于产物的纯化,为后续阐明pZP3β核心区域的性质和相关抗生育研究打下了基础。     

小鼠热休克蛋白10(HSP10)基因腺病毒载体的构建及在卵泡中的表达

目的:构建小鼠热休克蛋白(heat shock protein 10,HSP10)基因重组腺病毒载体,为更好地研究HSP10蛋白在PCOS发病中的作用。方法:用RT-PCR的方法从小鼠卵巢组织中扩增HSP10基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至AdEasy腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-HSP10。PmeI酶切pAdtrack-HSP10,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-HSP10转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。PacI酶切线性化重组质粒AdCMV-HSP10后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。通过GFP报告基因观察重组病毒的产生。用获得的重组腺病毒感染小鼠卵泡,Western blotting方法检测HSP10基因的表达。结果:从小鼠卵巢组织中扩增出309bp的cDNA,PCR和测序分析证实为小鼠HSP10基因。构建的小鼠HSP10基因的重组腺病毒载体,PacI酶切重组质粒见30000bp和4500bp的特征性条带。制备出高滴度重组腺病毒,病毒上清PCR反应同样扩出309bp的目的条带。分离并培养小鼠卵泡,感染重组的腺病毒,Western blotting检测到显著的HSP10条带。结论:本文成功构建了小鼠HSP10基因重组腺病毒载体,并且在小鼠卵泡中有效表达。     

肿瘤抑制基因Nm23-M1原核表达载体的构建和表达

目的:构建鼠Nm23-M1基因的原核表达载体并进行表达。方法:应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术扩增Nm23-M1基因,将其克隆于pQE30质粒中,测序正确后,构建重组体pQE30-Nm23-M1,在大肠杆菌中诱导NM23-M1蛋白表达。结果:SDS-PAGE凝胶电泳分离显示,在分子量大约17.5kD处有一诱导表达蛋白带,表达蛋白量占菌体蛋白量的15%,通过Westernblot证实,表达产物与抗人Nm23-H1单克隆抗体有特异性免疫反应。经Ni-NTA柱纯化,获得电泳均一性为92%的重组蛋白。结论:成功构建Nm23-M1表达载体,并获得了重组NM23-M1蛋白。     

重组早孕因子(EPF)的表达、纯化及鉴定

目的:获取大量具有良好生物活性的早孕因子(EPF)重组蛋白。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EPF cDNA,将该cDNA插入载体pGEX-5X-1,获得重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF,将重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF转化大肠杆菌BL21后通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析方法,分离纯化得到纯重组GST-EPF融合蛋白(rEPF)。再用Xa酶切GST,得到纯化的EPF重组蛋白。用SDS-PAGE鉴定其纯度,用Western blotting鉴定其特异性,用玫瑰花环抑制试验(RIT)检测其生物学活性。结果:HeLa细胞总RNA中有效扩增出EPF cDNA。EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pGEX-5X-1,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白。Western blotting表明其与抗EPF抗体有特异性结合,RIT检测结果显示目的蛋白具有良好的EPF生物学特性。结论:成功构建了EPF的原核表达载体,并纯化获得了具有生物学特性的重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究奠定了基础。