不同剂量的X线对小鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的 探讨不同剂量的X线对小鼠成骨细胞增殖与分化的影响. 方法 将体外诱导培养的小鼠成骨细胞分为4组(n=3):对照组、0.1Gy组、0.5 Gy组、1.0 Gy组,4组细胞接种后24 h分别予以0、0.1、0.5、1.0 Gy剂量的X线照射,检测照射后l～3d细胞的增殖、细胞周期、凋亡情况,以及照射后7～14d碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节形成与成骨相关基因的表达. 结果 对照组、0.1 Gy组、0.5 Gy组、1.0Gy组成骨细胞的细胞周期和凋亡变化、细胞增殖比较差异均无统计学意义(P＞0.05).X线照射后培养7、10、14 d,0.5 Gy组和1.0Gy组细胞外ALP活性均较对照组高,差异均有统计学意义(P＜0.05).X线照射后14d,0.5 Gy组和1.0 Gy组矿化结节数目明显多于0.1 Gy组和对照组.1.0 Gy组骨钙素和核心结合因子α1 mRNA的表达较对照组增加,0.5Gy组和1.0 Gy组骨保护素mRNA/核因子-kB配体受体激活物mRNA比率均较对照组大,以上项目比较差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 一定剂量范围(0.5～1.0 Gy)的X线照射在不影响成骨细胞增殖的情况下,可以促进成骨细胞的分化.     

血清素对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化和矿化功能的影响

目的 探讨不同浓度血清素对体外培养大鼠成骨细胞(OBs)增殖、分化和矿化功能的影响. 方法 在新生SD大鼠颅骨OBs培养液中分别加入不同浓度血清素:0 mol/L组(空白对照组)、10-9 mol/L组、10-8 mol/L组、10-7 mol/L组、10-6 mol/L组、10-5 mol/L组,观察不同浓度血清素对OBs的增殖能力(CCK-8法)、分化能力(Western法检测碱性磷酸酶蛋白水平、pNPP法检测碱性磷酸酶活性和ELISA法检测骨钙素蛋白表达水平)和矿化能力(茜素红染色)的影响.并用荧光定量聚合酶链反应方法检测OBs分化早、晚期血清素受体亚型的mRNA表达水平. 结果 不同浓度血清素均可抑制OBs的增殖、分化和矿化,这种抑制作用在低浓度时具有时间依赖性,而在高浓度时作用减弱,呈现“V”形趋势.5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C等受体在OBs上均有表达,其中5-HT2A和5-HT1B受体是表达最多的两种受体亚型. 结论 体外OBs表达血清素受体,血清素可抑制OBs的增殖、分化和矿化,提示血清素能够调节骨代谢.     

三七总甙对成骨细胞增殖、分化及0PG表达影响的研究

目的 观察不同剂量的三七总甙对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化及OPG表达的影响，探索体外作用的机制和最佳剂量。方法 第2代培养的成骨细胞分别加入终浓度为0μg／ml、10μg／ml、50μg／ml、100μg／ml的三七总甙，观察细胞生长、钙结节形成情况，碱性磷酸酶(ALP)染色、分泌量检测，骨钙素(OCN)检测，MTT法观察成骨细胞增殖，免疫组化SP法结合阳性细胞计数法检测成骨细胞OPG表达。结果 成骨细胞在7d可铺满瓶壁，30d可形成钙结节，三七总甙可促进成骨细胞的增殖ALP、OCN的分泌，以50μg／ml时作用明显。三七总甙可促进成骨细胞OPG的表达，在50μg／ml时作用明显。结论 三七总甙可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化，促进成骨细胞OPG的表达，以50μg／ml时作用明显。     

静磁场不同处理时间对体外培养成骨细胞增殖与分化的影响

目的:研究静磁场不同处理时间对体外培养成骨细胞增殖与分化成熟的影响。方法:原代培养大鼠颅骨成骨细胞,传代后随机分为9组,用磁场强度为3.9mT的静磁场,分别处理0(对照组)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h。倒置相差显微镜下观察细胞形态;48h后检测细胞增殖情况;第3、6、9、12天测定碱性磷酸酶活性和钙盐沉积量;第8天进行碱性磷酸酶染色;第10天进行茜素红钙化结节染色;在SMFs(static magnetic fields)处理0、24、48、72h后,Real-time PCR检测骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2),Runx-2,骨保护素(osteoprotegerin,Opg)的mRNA表达水平变化。结果:与对照组相比,磁场组均促进细胞增殖(P<0.01或P<0.05),也能明显促进其分化成熟,表现为提高细胞的ALP活性,促进钙盐沉积量,提高BMP-2、Runx-2和Opg的mRNA表达。结论:磁感应强度为3.9mT的静磁场处理体外培养成骨细胞2.5h时,其对成骨细胞的增值与分化效果最为明显。     

G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1的SHD结构域对成骨细胞内局部黏附激酶活性的影响

目的 探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GITl)的SHD结构域对成骨细胞内局部黏附激酶(FAK)活性的影响,并分析其机制.方法 取1～2dSD大鼠颅盖骨进行成骨细胞原代培养,传至第3代.体外构建野生型GIT1和删除了SHD结构域的GIT1的质粒并组成慢病毒.血小板衍生生长因子(PDGF)刺激成骨细胞后,采用免疫共沉淀法检测GIT1、删除了SHD结构域的GIT1与FAK的相互关系,采用免疫荧光法检测GIT1和FAK在成骨细胞内的位置、删除了SHD结构域的GIT1对成骨细胞内FAK位置和活性的影响.结果 PDGF刺激成骨细胞后,GIT1与FAK的相互结合明显增加,且随着时间的增加,结合量逐渐增加(F=293.105,P=0.000).免疫荧光染色结果表明:PDGF刺激后,成骨细胞局部黏附内活性形式的FAK(FAK酪氨酸397磷酸化)明显增加.PDGF刺激成骨细胞后,删除了SHD结构域的GIT1与FAK的结合明显被抑制,且随着时间的增加,二者的相互关系无明显变化(F=0.322,P=0.737);删除了SHD结构域的GIT1抑制成骨细胞局部黏附内FAK酪氨酸397的磷酸化,同时降低FAK在局部黏附内的表达.结论 删除了SHD结构域的GIT1通过降低与FAK的相互结合,从而抑制成骨细胞局部黏附内FAK酪氨酸397的磷酸化,影响成骨细胞的功能.     

依普拉芬对鸡胚成骨细胞的增殖和分化的影响

目的 建立鸡胚额骨成骨细胞的培养方法,研究依普拉芬对其成骨细胞增殖和分化功能的影响。方法 采用混合胶原酶和胰酶、两次消化的方法,获取成骨细胞,经培养传代,取状态良好的第3代细胞在96孔板上进行增殖率和碱性磷酸酶活性的测定。结果 消化培养的细胞具有明显的成骨细胞的特点:属于成纤维目细胞型、碱性磷酸酶黑染、基质前体红染,长期培养能形成矿化结节。应用依普拉芬后发现10-4mol/L IP可抑制成骨细胞增殖,而10-8moL/L对改善成骨细胞的增殖和分化有显著功效(P<0.01),小于10-10mol/L浓度的IP则对成骨细胞与对照组无差异。结论 酶混合消化可以得到较纯的成骨细胞,应用依普拉芬研究表明,适宜浓度的IP可促进鸡胚额骨成骨细胞增殖和分化,提高其碱性磷酸酶活性,增强成骨细胞矿化,促使骨形成。     

唑来膦酸对小鼠胚胎成骨细胞增殖和分化的影响

目的研究唑来膦酸对小鼠胚胎成骨细胞体外增殖和成骨分化的影响。方法将小鼠胚胎成骨细胞体外传代培养,使用含不同浓度（1.0、0.1μmol/L）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞,不含唑来膦酸的培养基作对照,培养1、3、5 d采用CCK-8试剂盒检测唑来膦酸对成骨细胞增殖的影响;培养14 d行碱性磷酸酶（ALP）染色;培养21 d行茜素红染色;培养7 d,实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测转录因子Runx2、成骨标志物Ⅰ型胶原（Collagen TypeⅠ）、ALP、骨钙素（OCN）基因的表达,免疫印迹法（Western Blotting）检测转录因子Runx2蛋白的表达。结果不同浓度的唑来膦酸干预细胞后,CCK-8实验检测吸光度值随天数增加而升高,各组之间差异无统计学意义（P〉0.05）。随着唑来膦酸浓度的升高,ALP染色和茜素红染色逐渐变浅,Runx2、Collagen TypeⅠ、ALP、OCN基因的表达量降低,Runx2蛋白的表达量降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论唑来膦酸在选定浓度（1.0、0.1μmol/L）下不影响成骨细胞的增殖,但对其分化功能的抑制作用随着浓度的增加而增强。     

异黄酮类药Genistein对原代培养大鼠成骨细胞增殖、分化、钙含量及矿化功能的影响

目的：了解异黄酮类药Genistein对体外培养成骨细胞的作用。方法：应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法，原子吸收分光光度法及茜素红染色方法观察Genistein对体外培养成骨细胞的增殖、ALP表达，基质钙含量及矿化结节形成的影响。结果：Genistein具有刺激成骨细胞增殖，提高ALP活性，细胞基质钙含量及矿化结节形成的数量的作用。结论：Genistein具有刺激体外培养成骨细胞增殖，分化成熟及促进矿化的作用。     

地塞米松对成人成骨细胞增殖和分化影响的实验研究

目的研究地塞米松对体外培养的成人成骨细胞增殖和分化的影响。方法取成人的髂骨松质骨,采用胶原-胰蛋白酶消化法,获得松质骨中的成骨细胞,进行纯化和培养。在此基础上,添加1×10-8mol/L的地塞米松,连续加药3d,置入CO2孵箱中培养,同时作不加药的空白对照。通过倒置相差显微镜和电镜观察增殖和分化情况,检测上清液中的碱性磷酸酶和骨钙素含量,并且对成骨细胞的凋亡情况进行测定。结果胶原-胰蛋白酶消化法得到的成人成骨细胞,生长情况良好,生化指标稳定可靠,细胞纯化效果佳,可以满足相关研究的需要。进一步研究结果显示,在地塞米松浓度为1×10-8mol/L,成骨细胞密度为10000/ml的条件下,上清液中碱性磷酸酶和骨钙素含量明显增高,骨结节形成加速,与未加药的对照组比较差异均有非常显著性意义,同时成骨细胞的凋亡情况无明显变化。结论地塞米松对体外培养的成人成骨细胞的增殖和分化有明显地促进作用,可以作为促进骨形成的阳性对照应用于抗骨质疏松药物的筛选研究。     

高铁培养环境对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化的影响

目的 观察高铁培养环境下小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1增殖、分化指标的变化趋势,探讨铁离子对 成骨细胞增殖、分化的影响。方法 小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10mmol/Lβ-甘 油磷酸和50μg /mL抗坏血酸的诱导分化的作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(50、100、 200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测成骨细胞分化基因成骨 相关转录因子(Runx2) 、锌指结构转录因子(Osterix) 、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨钙素(OC)的表达,碱性 磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果 MC3T3-E1细胞的增殖活性、成骨分化相关基因的 表达以及ALP水平随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05)。结论 高铁培养环境可明显抑制小鼠 前成骨样细胞MC3T3-E1的增殖和分化。     

痩素在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化早期的作用研究

目的 研究小鼠骨髓基质干细胞体外增生及向成骨细胞定向分化早期瘦素(Leptin)的作用。方法 取雄性6周ICR小鼠股骨骨髓基质细胞进行原代和传代培养，在传代细胞培养时加入Leptln(实验组)或保持基础培养条件(对照组)，分别检测两组的细胞增生情况。半定量RT-PCR方法检测成骨细胞相关基因Cbfal和Cbtb等在两组细胞分化过程中的表达。结果 实验组在细胞培养24和48h细胞数量明显少于对照组，显示时间与Leptin剂量依赖特性。Leptln在传代细胞培养中促进成骨细胞特异性转录因子Cbfal和Cbtb的表达。结论 Leptin抑制骨髓基质干细胞体外增生并促进早期成骨细胞相关基因的表达。     

人间充质干细胞外泌体通过p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路促进小鼠胚胎成骨细胞前体增殖和成骨分化

目的 观察人间充质干细胞(hMSC)分泌的外泌体对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)增殖和成骨分化的作用,并基于p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路探讨相关分子机制.方法 采用流式细胞术检测hMSC表面标志物;以成骨诱导液干预hMSC,通过茜素红染色检测钙化结节以反映其成骨能力;采用差速离心...     

腱骨愈合过程中富血小板血浆对细胞增殖与胞浆内钙离子浓度的影响

目的 研究富血小板血浆(PRP)在腱骨愈合过程中对肌腱细胞、成骨细胞的增殖情况及胞浆内钙离子浓度的影响.方法 用Transwell小室建立共培养模型,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,用激光共聚焦显微镜检测经钙离子荧光探针fluo-3/AM染色的胞浆内钙离子浓度的变化.单独培养成骨细胞组、肌腱细胞组,单独培养成骨细胞组、肌腱细胞组并各自加入PRP(加入小室上层),分别以成骨细胞和肌腱细胞为待测细胞建立共培养体系但不加入PRP组,分别以成骨细胞和肌腱细胞为待测细胞建立共培养体系并且加入PRP组. 结果 2种细胞共培养且未加入PRP两组生长速度和荧光强度均为最低,差异有统计学意义(P＜0.05),2种细胞单独培养且未加入PRP的2种细胞生长速度和荧光强度均为居中,差异有统计学意义(P＜0.05),加入PRP的各组生长速度和荧光强度均为最高,且同种细胞间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PRP可以去除2种细胞共培养时彼此的抑制效应,并提高细胞的增殖能力至同样高的水平,且胞浆内钙离子浓度也随之升高.     

miR-204通过Wnt信号通路对骨质疏松症小鼠成骨细胞增殖的影响及机制分析

目的探讨miR-204通过Wnt信号通路对骨质疏松症小鼠成骨细胞增殖的影响及机制分析。方法雌性昆明小鼠分为:对照组、假手术组和骨质疏松症组,采用双侧卵巢切除法建立去卵巢骨质疏松小鼠模型并进行鉴定;提取小鼠原代成骨细胞并鉴定;细胞转染并检测miR-204的表达水平;MTT检测各组细胞活力;各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的检测;Transwell检测各组细胞的侵袭能力;细胞流式术检测各组细胞凋亡情况;细胞流式术检测各组细胞Caspase-3活性;双荧光素酶报告基因检测miR-204和β-catenin、LRP-5间的相互作用;Western blot检测Wnt信号通路相关蛋白表达情况。结果骨质疏松症组小鼠骨密度较对照组和假手术组明显降低(P=0.007,P=0.057),表明骨质疏松症小鼠造模成功。miR-204的表达水平在miR-204模拟物组明显提高(P=0.072),在miR-204抑制剂组下降(P=0.031);miR-204模拟物组成骨细胞活力和ALP活性提高(P=0.007,P=0.043),miR-204抑制剂组成骨细胞活力和ALP活性下降(P=0.007,P=0.035);miR-204模拟物组成骨细胞的侵袭能力明显增强(P=0.006),miR-204抑制剂组成骨细胞的侵袭能力下降(P=0.036);miR-204模拟物组成骨细胞的凋亡能力和Caspase-3活性下降(P=0.041,P=0.045),miR-204抑制剂组成骨细胞的凋亡能力和Caspase-3活性增强(P=0.005,P=0.039);miR-204与β-catenin、LRP-5之间有靶向关系;miR-204模拟物组成骨细胞中β-catenin和LRP-5蛋白表达均上调(P=0.043,P=0.009),miR-204抑制剂组成骨细胞中β-catenin和LRP-5蛋白表达均下调(P=0.041,P=0.032)。结论miR-204可能促进成骨细胞的增殖,激活Wnt信号通路,对骨质疏松症有一定的保护作用。     

成骨与破骨细胞促红细胞生成素肝细胞受体B4/肝配蛋白B2双向信号通路

成骨细胞与破骨细胞以直接接触的方式共同调控骨重建平衡,这也决定了两者的不可分割性。最新研究表明前破骨细胞肝配蛋白(Ephrin)B2与成骨细胞膜上促红细胞生成素肝细胞受体(Eph)B4受体的直接接触来调控骨稳态平衡。具有EphrinB2配体的前破骨细胞可通过直接接触具有EphB4受体的前成骨细胞从而触发各自相应的下游信号转导分子。通过激活成骨细胞膜表面Eph受体而起正向作用,进一步去抑制下游信号转导分子RhoA活性促进前体细胞分化成熟。反之,EphrinB2配体的激活起到反向作用,抑制破骨相关转录因子的C-fos/NFATc1转录级联反应来抑制前破骨细胞的分化,磨损颗粒导致的骨溶解会使破骨细胞上EphrinB2配体表达明显升高,并且会促进NFATc1的高表达,可以通过这种双向信号的机制来减弱甚至是抑制磨损颗粒导致的破骨细胞的进一步分化。     

他克莫司对小鼠T_H17型细胞分化增殖的影响及其机制

目的 观察在T_H17型细胞极化环境下,他克莫司(Tac)对小鼠T_H17型细胞分化增殖的影响及机制.方法 将小鼠脾脏初始CD4+CD25+T淋巴细胞使用抗CD3抗体及抗CD28抗体进行活化,使用转化生长因子β_1,(TGF-β_1,)和白细胞介素6(IL-6)等细胞因子进行诱导,促使其向T_H17型细胞方向分化.将体外培养的T_H 17型细胞分为4组,分别用不同剂量的Tac进行干预,即:Tac0 ng/ml组(对照组)、Tac 0.1 ng/ml组、Tac 1 ng/ml组和Tae 10 ng/ml组.应用流式细胞术检测各组T_H 17型细胞亚群纯度,使用逆转录聚合酶链反应(RT.PCR)检测各组IL-17 mRNA相对表达量.结果 Tac可抑制小鼠T_H17型细胞亚群的分化增殖,降低IL-17 mRNA的表达量,且呈剂量依赖性,各组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 Tac通过抑制T_H17型细胞胞浆内的钙调磷酸酶,抑制T_H17型细胞亚群的分化增殖,抑制IL-17 mRNA产生并减轻炎症进程,从而抑制排斥反应.