HSF1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化

目的：建立HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维永生化细胞系，为HSF1的功能研究提供实验模型。方法：用脂质体介导的基因转染法将pSV3neo质粒导入HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养，建立永生化细胞系；用PCR检测两种细胞株中目的基因的整合，用RT—PCR法鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达；用Western blot检测所建细胞株的诱导型热休克蛋白70的表达情况。结果：有3个细胞克隆已扩大培养稳定传代达6个月，经鉴定SV40T抗原已整合到两种细胞中且稳定表达，HSF1^-/-胚胎成纤维细胞热休克蛋白70的诱导表达消失。结论：成功建立永生化HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞。     

SV40T基因介导的永生化对细胞生物学特性的影响

目的研究SV40 T基因对其诱导的永生化细胞系细胞表型的影响。方法以手术切除的卵巢肉瘤样癌腹壁转移组织为材料,进行体外培养。将永生化基因———SV40 T抗原基因转染第10代细胞,经筛选,抗性克隆扩大培养,得到永生化细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、双层软琼脂培养、裸鼠接种、免疫组化等,研究转染与未转染细胞的生物学特性,通过四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)在相同条件下检测转染与未转染细胞对顺铂、阿霉素、足叶乙甙、拓扑替康四种化疗药物的敏感性。结果建立人卵巢肉瘤样癌细胞系,命名为BUPH:OVSC-1。经SV40 T抗原基因转染,建立人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系,命名为BUPH:OVSC-2,两者均已长期稳定传代。通过比较,两者的生物学特性无明显差别,对不同化疗药物的敏感性无明显差别。结论SV40 T基因永生化的细胞保留了原细胞的分化表型,SV40介导的永生化细胞系可作为体外研究的模型。     

永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性

目的:构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究. 方法:利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞,使其永生化,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能. 结果:经G418 700～300 mg/L筛选,40 d后获得一株阳性克隆. 形态学观察发现,该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征. 永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%,染色体核型分析表明细胞核型无明显异常,软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长,免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞,而且该细胞具有合成白蛋白的功能. 结论:新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能,可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.     

Cre/LoxP 系统联合SV40 LTag 诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立

 目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体（SSR69）转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag 的永生化成纤维细胞;用表达Cre 重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin 在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag 的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞（P < 0.05）,在体外培养传代>25 代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异（P > 0.05）,无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag 可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系     

SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的：研究SV40大T抗原（LT）基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用，以及转化后细胞生物学特性的改变。方法：采用脂质体介导的方法。利用含有LTcDNA的质粒psv3-neo转染人正常皮肤成纤维细胞。G418筛选后，挑选阳性克隆扩大培养，观察基因及蛋白在细胞内的表达。以及对细胞增殖等生物学特性的改变情况。结果：分离获得转化细胞克隆，原位杂交显示LTmRNA在转染细胞质中表达。免疫组化结果显示，细胞质中有SV40大T抗原表达。细胞计数，BrdU，流式细胞仪检测表明，经过一段时间的旺盛生长，在转染后第16代，细胞即进入危机期，以一种比衰老细胞更快的速度死亡。结论：LT可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖，但这种能力是有限的，在转染后期甚至会促进细胞死亡，所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化，单纯利用LT的转染是不够的，还需要结合其它的转化方式。     

hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征

目的 探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用RT-PCR 法检测 hTERT mRNA 的表达.采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代.检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性.结论 hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征.     

永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立

目的：建立永生化人成牙本质细胞系．方法：采用脂质体转染法，将人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因导入原代人成牙本质细胞样细胞．培养液加G418筛选约1mo后，抗性细胞克隆形成，滤纸片法转移、扩增并连续培养．检测转染细胞内hTERT的基因整和和表达，初步分析细胞系的生物学特征．结果：hTERT稳定转染入目的细胞，表达mRNA及其蛋白．转染后共获得5个细胞克隆，克隆5b来源的细胞在体外长期连续培养下生长良好，具有较高碱性磷酸酶活性，在转录水平表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白，细胞核型正常．该细胞系至今传代56代，约6mo，命名为hTERThOd-L结论：建立起永生化人成牙本质细胞样细胞系．     

1种新型功能性杂交胰岛β细胞系的建立

 目的通过应用基因转染及细胞融合技术构建永生化细胞,建立1种功能良好、无致瘤性、增殖可控的杂交胰岛β细胞系。方法通过脂质体介导逆转录病毒载体SSR69转染至原代成纤维细胞中,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化细胞。提取大鼠胰岛,通过胰蛋白酶及DNA酶裂解成单胰岛单细胞。对永生化成纤维细胞及单个胰岛β细胞进行电融合,通过有限稀释法获得杂交胰岛β细胞克隆。比较杂交及正常β细胞内胰岛素的含量及对葡萄糖刺激胰岛素释放反应。通过RT-PCR 及Western blot分析杂交胰岛β细胞中SV40 LTag ,insulin ,glucokinase （GK ）及glucose transporter-2 (Glut-2 )基因的表达。结果建立的永生化成纤维细胞系的增殖能力明显优于原代成纤维细胞 (P <0.05)。成功获得杂交胰岛β细胞克隆,其细胞呈短梭形或扁圆形,且具有贴壁生长等特性。透射电子显微镜下可见细胞内胰岛素分泌颗粒,杂交与正常胰岛β细胞之间细胞内胰岛素含量、胰岛素释放指数及insulin,GK,Glut- 2蛋白及mRNA表达水平无统计学差异(P >0.05),但2种细胞内insulin,GK,Glut- 2的表达水平显著高于RIN-m5F细胞(P <0.05)。结论可通过永生化成纤维细胞及单个胰岛β细胞电融合诱导生成杂交胰岛β细胞,且杂交细胞能够对葡萄糖的变化产生应答反应。     

永生化人胎肝细胞系LC-1的建立

目的 建立人源性永生化肝细胞.方法 利用含有SV40T和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox,转染包装细胞PT67;取病毒上清液感染原代培养的人胎肝细胞,用G418筛选成功转导的永生化细胞系;用细胞计数法测定永生化细胞增殖特性,免疫细胞化学染色检测肝细胞特征蛋白表达,放免法和自动生化仪检测清蛋白和尿素氮合成功能.结果 获得的一个细胞系命名为LC-1,其细胞群体倍增时间约为17h,可表达清蛋白、CK18肝细胞特征和CK19等胆管特征蛋白,具有清蛋白与尿素氮合成功能.结论 成功建立了具有良好的增殖能力、分化状态、肝细胞生物学特征的永生化肝细胞系.     

西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。