RT-SHIV中国恒河猴适应株细胞水平生物学特性分析

目的 体外增值、制备动物感染来源的RT-SHIV病毒中国恒河猴适应株,比较PBMCs和CEMx174两种细胞制备出病毒的差异,同时用TZM-bl、CEMx174、PBMC三种细胞滴定测定病毒TCID50.方法 用RT-SHIV病毒静脉感染中国恒河猴,定期采血测定血浆病毒载量,当病毒载量达高峰时采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常恒河猴PBMCs或CEMx174细胞共培养,定期测定培养液中的P24抗原水平,当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存;测定病毒RNA载量、P24抗原浓度,滴定病毒的TCID50.结果 本研究共制备了78 mL PBMCs来源的RT-SHIV病毒和85 mL CEMx174细胞来源的RT-SHIV病毒.RT基因序列和原始序列的相似度为99%,仅在第254和265位的氨基酸发现突变.RT-SHIV(PBMC)和RT-SHIV(CEMx174)病毒载量分别为1.641×108 copies/mL和8.375×108 copies/mL,P24抗原水平分别为20.745 ng/mL和4.28 ng/mL,TZM-bl、CEMx174、PBMC细胞测定病毒的TCID50分别为3.16×105 TCID50/mL和1×104 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×105 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×103 TCID50/mL.结论 PBMCs细胞来源制备的病毒较CEMx174制备的病毒具有更高的感染性.     

SHIVchn19p7中国恒河猴细胞适应株的制备和生物特性研究

目的体外制备SHIVchn19p7病毒中国恒河猴细胞适应株,建立病毒库。滴定该批次SHIVchn19p7病毒的TCID50。方法用SHIVchn19p4静脉感染中国恒河猴,并进行恒河猴体内传代。定期采血测定血浆病毒载量,当病毒载量达高峰时采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度。10倍系列稀释SHIVchn19p7病毒,加入TZM-bl细胞,测定TZM-bl细胞中Lucifres值,计算病毒的TCID50。结果本研究共制备了240mL,SHIVchn19p7病毒,gp120序列测定分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。病毒载量为4.44×105copies/mL,P24抗原水平为3.57×102pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为2.08×104mL。结论此次制备的SHIVchn19p7细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIVchn19p7/中国恒河猴模型。     

全血及血浆病毒分离方法在SHIV-KB9感染猴模型中的应用

目的使用全血和血浆病毒分离方法分离SHIV-KB9感染标本,验证方法的可行性和敏感性。方法将SHIV-KB9感染恒河猴的血浆和全血标本与CEMx174细胞共培养,观察细胞病变,测定感染猴血浆病毒载量。结果全血病毒分离的滴度与血浆病毒载量测定结果趋势相符,高峰相同,但血浆病毒分离阳性分离率较低。结论全血病毒分离敏感性高于血浆病毒分离,可用于SHIV-KB9感染猴模型。     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的 体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性.方法 用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常中国恒河猴PBMCs共培养.定期测定培养液中的P24抗原水平.当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存.测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50.静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性.结果 本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变.病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL.1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上.结论 此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型.     

人骨髓源性肝干细胞体外扩增方案的探讨

目的探讨体外扩增骨髓源性肝干细胞的可行方案。方法采用密度梯度离心分离法从新鲜骨髓中获取富含CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的组分,然后将细胞在体外培养扩增0、7d、14d,扩增方案采用含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中和无血清的高糖DMEM培养基体系中加入不同浓度的促肝细胞生长素(HGPF)、促血小板生长素(TPO)和白细胞介素3(IL-3),最后用流式细胞计数法测定扩增细胞中CD117阳性细胞和CD184阳性细胞的数量变化。结果含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中加入HGPF40μg/ml、TPO50ng/ml、IL-310ng/ml组的扩增效果最好,扩增7d的CD117阳性细胞数量和CD184阳性细胞数量分别增加6.55倍和6.20倍,扩增14d的CD117阳性细胞数量和CD184阳性细胞数量分别增加11.62倍和20.57倍。结论含10%自体血清的高糖DMEM培养基体系中加入HGPF40μg/ml、TPO50ng/ml、IL-310ng/ml是体外扩增骨髓源性肝干细胞的可行方案。     

痘苗病毒毒力测定及其免疫血清的制备

目的 测试痘苗病毒毒力,制备痘苗病毒免疫血清,为药物评价和病毒检测奠定基础.方法 鸡胚绒毛尿囊膜培养痘苗病毒,测定病毒的TCID50和小鼠毒力.将痘苗病毒悬液稀释成100TCID50,0.2%福尔马林灭活,分别在0、7、14 d以腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,用IFA、IEA、ELISA方法评价血清的敏感性和特异性.结果 痘苗病毒TCID50/0.0 5 mL=1.8×104,小鼠LD50/0.2 mL=106,8;制备的免疫血清经IFA法测定效价为1:320,IEA法测血清效价为1:160,ELISA测血清效价1:6400.结论 确定的细胞和小鼠毒力将为药物测定提供基础比对数据;制备的痘苗病毒免疫血清具有高度的敏感性和特异性,可作为测试对照血清使用.     

八角茴香及其提取物莽草酸抗甲型流感病毒的体外研究

目的 检测八角茴香及其提取物莽草酸体外抗甲型流感病毒的作用.方法 MTT法测定药物对MDCK细胞的毒性;鸡胚扩增病毒,测定病毒在MDCK细胞上的TCID50;通过观察CPE的情况以及采用MTT法评价药物对病毒在细胞内生长的影响.结果 在MDCK细胞上八角水提物和莽草酸的最大无毒浓度（TC0）分别为10 mg/mL和0.1 mg/mL;病毒的TCID50为10-4/0.1 mL;在细胞模型上八角水提物对病毒有明显的预防和治疗效果,但莽草酸未表现出预防或治疗效果.结论 在体外实验中,八角水提物对H3N2型流感病毒有一定的预防和治疗作用,而其提取物莽草酸无此效果.     

融合蛋白XE-TNFαm2对SIV的抑制作用

目的检测XE-TNFαm2靶向融合蛋白作为新型生物性药物抑制SIV病毒感染CEMx-174细胞的作用。方法 XE-TNFαm2、SIV和CEMx-174细胞共同培养,在培养的第5天,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清中P27抗原水平,间接免疫荧光法(IFA)和流式细胞仪测试SIV阳性细胞,应用PE-annexin V凋亡检测试剂盒测试细胞存活率和凋亡率。结果 XE-TNFαm2在细胞安全最大药物浓度50μg/mL时,对SIV病毒抑制率为40%。细胞早期凋亡率在XE-TNFαm2浓度6.25μg/mL时为37.1%。结论融合蛋白XE-TNFαm2对SIV病毒有一定的抑制作用,其中部分作用推测是因通过诱导感染细胞产生凋亡导致病毒死亡。     

加味神术散雾化剂抗流感病毒的实验研究

目的探讨加味神术散雾化剂在体外对甲型H1N1流感病毒增殖的影响。方法以甲型H1N1流感病毒感染狗肾传代细胞（MDCK cell）为载体,观察加味神术散雾化剂不同药物浓度对流感病毒引起的细胞病变（CPE）的影响。采用Reed-Muench法计算流感病毒对MDCK细胞的半数细胞感染量(TCID50)。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）测定光密度（OD）值,计算不同药物对MDCK细胞的破坏率,通过Probit回归计算不同药物对MDCK细胞的最大无毒浓度（TC0）及半数中毒浓度(TC50)。计算不同药物对流感病毒增殖的抑制率,通过Probit回归计算半数抑制浓度(IC50)和治疗指数（TI）。结果甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的TCID50为10-8/0.1mL。加味神术散雾化剂对MDCK细胞的TC50为366.63μg/mL,TC0为31.25μg/mL;利巴韦林对MDCK细胞的TC50为109.85μg/mL,TC0为8.02μg/mL。加味神术散雾化剂对流感病毒直接抑制作用的IC50=9.79μg/mL,TI=37.45;对预防流感病毒感染的IC50=8.72μg/mL,TI=41.04;对治疗流感病毒感染的IC50=17.40μg/mL,TI=21.07。利巴韦林对预防流感病毒感染的IC50=84.30μg/mL,TI=1.30。结论加味神术散雾化剂可明显抑制甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞中的增殖,具有抗甲型H1N1流感病毒作用。     

三叶青黄酮调控STAT3信号通路对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及作用机制研究

目的 分析三叶青黄酮调控STAT3信号通路对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及作用机制.方法 将膀胱癌T24细胞分为对照组、低剂量组和高剂量组,分别使用空白培养基、50μg/mL三叶青黄酮、100μg/mL三叶青黄酮干预;使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,使用MTT法检测T24细胞的凋亡抑制率;使用Western blot法检...     

不同比例利多卡因-布比卡因合剂的毒性比较

目的比较不同比例利多卡因-布比卡因合剂的毒性。方法用清醒小鼠测定了不同比例的利多卡因（2％）-布比卡因（0．75％）合剂的惊厥半数有效量（ED50）、半数致死量（LD50）和使呼吸停止的耐受量。结果各合剂组、利多卡因（L）组和布比卡因（B）组的惊厥ED50是相似的（P〉0．05）。5：1组的LD50大于B、L、1：1和1：2组（P〈0．01）；2：1组的LD50大于B和1：1组（P〈0．01）；其他各组的LD50的差别无显著性（P〉0．05）。各L—B组的耐受量均大于B组而小于L组（P〈0．01）。结论将利多卡因和布比卡因按适当比例混合可使毒性降低。     

马钱子粉和马钱子微粉的治疗指数比较

目的探讨马钱子超微粉碎的临床意义。方法急性毒性试验分别测定马钱子普通粉和超微粉的LD50;热板法和扭体法镇痛实验测定两种粉体的镇痛ED50。分别计算治疗指数（TI）。结果热板法测得TI分别为：普通粉：4．471、超微粉：4.280,TI2／TI1=0．9573;扭体法测得TI分别为：普通粉：4.637、超微粉：4.207,TI2／TI1=0.90753。结论马钱子经超微粉碎后,治疗指数降低。     

计算机辅助CDK6抑制剂先导化合物初步设计及化合物活性的测定

目的:初步设计CDK6抑制剂先导化合物并测定化合物活性. 方法:利用计算机辅助药物设计(CADD)程序LigBuilderv1.2,依据lipinski法则,采用从头设计、片断生长的方法,在Linux操作系统下,设计全新CDK6抑制剂化合物;MTT法测定化合物IC50. 结果:得到50种化合物结构并成功合成8种,经测定其中3种有活性(IC50在220～310 μmol/L). 结论:新型CDK6抑制剂化合物具有一定抑制活性,CADD可以大大提高先导化合物发现的效率, 加快新药研究的步伐.     

巴豆中维医炮制品质量和LD_(50)的比较及相关性分析

目的 探讨中医和维医不同方法炮制的巴豆制品的质量和LD50的差异.方法 测定生巴豆及中维医巴豆炮制品的脂肪油含量、水分、灰分、过筛率以及毒理学指标LD50.结果 生巴豆、中维医巴豆炮制品的水分、灰分差异具有统计学意义(P<0.05).脂肪油含量从大至小依次为生巴豆、维医炮制品、中医炮制品.LD50分别为0.68、1.82、0.90 g/kg.线性相关分析表明,巴豆的毒性与脂肪油含量呈正相关.结论 生巴豆和中维医炮制品的指标测定结果符合药典规定,中维医炮制品之间有差异.     

舒乐感冒片的急毒试验

舒乐感冒片是纯中药制剂，经过大量的临床试用，治疗效果明显。为了保证用药的安全性，对它的半数致死量（LD５０）进行了测定。１材料及动物样品：舒乐感冒片原料药，黄褐色粉末，难溶于水，由第三五九医院提供。动物：成年小白鼠９０（雌雄各半，体重１８～２２g）。由江苏大学动物房提供，动物合格证：苏动（质）９３０１８。２实验方法预试：按３ml／１０g剂量灌胃，估计０％和１００％，致死浓度分别为２１．５％、４５．６％。药物配制：配制浓度为４５．６％的混悬液５０ml，混匀后从中吸取７ml为一号液，供第一组使用（每１０g灌０…     

盐酸聚六亚甲基胍消毒洗手液的亚急性毒性研究

目的对0．3％盐酸聚六亚甲基胍（PHMB）的消毒洗手液进行了哺乳动物的亚急性毒性试验,以研究消毒剂多次接触对实验动物的蓄积毒性作用及其靶器官,并为亚慢性、慢性毒性或致癌试验的剂量设计提供依据。方法试验依据卫生部的《消毒技术规范》（第2002版）消毒产品毒理实验规范,选用SPF级的sD大鼠,进行大鼠急性经口毒性LD50试验、亚急性毒性试验。结果大鼠急性经口毒性试验ID50〉5000mg/kg·BW,属实际无毒级;亚急性毒性试验,一般生理体征无异常,对大鼠生长曲线无明显影响,血常规指标无异常,生化指标无异常,脏体系数无异常,脏器组织病理学检查未发现异常。结论0．3％盐酸聚六亚甲基胍消毒洗手液为实际无毒级,亚急性试验各指标无异常。     

ATP50对生长激素诱导大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响

目的:研究ATP50在SD大鼠睾丸Leydig细胞中对生长激素(Growth hormone,GH)诱导睾酮合成及生长激素受体功能的影响.方法:采用离体细胞体外孵育法,观察反义ATP50寡脱氧核苷酸(Oligo deoxy nucletides,ODN)对GH诱导大鼠睾丸Leydig细胞分泌睾酮的影响及GH受体功能的影响,以睾酮放射免疫试剂盒测定睾酮合成的情况,cAMP放免试剂盒检测cAMP含量来评定GH受体的功能,免疫组织化学检测ATP50蛋白的表达.结果:反义ATP50 ODN呈剂量依赖性抑制GH诱导睾丸Leydig细胞睾酮的分泌(P＜0.05),同时使Leydig细胞中ATP50蛋白表达下降,而无义tat ODN则没有相应的作用,免疫组织化学显示ATP50蛋白阳性颗粒在Leydig细胞中中呈密集性分布,表达强度明显高于GH组(P＜0.05).结论:在SD大鼠睾丸Leydig细胞中,ATP50可能通过增强GH受体的功能,进而刺激GH诱导睾酮的合成.提示ATP50参与GH诱导大鼠睾丸Leydig细胞睾酮的分泌过程.     

槲皮素对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析

目的 观察槲皮素对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。方法 利用基因工程克隆，表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和β亚基，在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组CK2全酶，在不同条件下测定CK2的活性，CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-^32P]ATP的[^32P]放射活度来检测。结果 重组人蛋白激酶CK2是一种Ca^2 ,cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶，与天然CK2的性质一致，槲皮素对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用，IC50为522nmol/L，抑制作用大于CK2已知抑制剂DRB和A3，槲皮素对重组人蛋白激酶CK2的动力学研究表明；它与ATP和酪蛋白分别呈竞争性和非竞争性抑制作用。结论 槲皮素是CK2有效抑制剂，该抑制作用可能是槲皮素抗肿瘤作用又一分子机制。为今后筛选更有效的CK2抑制剂提供了一种较为简便的筛选方法。     

计算机辅助CDK6抑制剂先导化合物初步设计及化合物活性的测定

目的: 初步设计CDK6抑制剂先导化合物,并测定化合物活性. 方法:利用计算机辅助药物设计(CADD)程序LigBuilderv1.2,依据Lipinski法则,采用从头设计、片断生长的方法,在Linux操作系统下,设计全新CDK6抑制剂化合物;MTT法测定化合物IC50. 结果:得到50种化合物结构并成功合成8种,经测定其中3种有活性(IC50在220～310 μmol/L间). 结论:新型CDK6抑制剂化合物具有一定抑制活性,CADD可以大大提高先导化合物发现的效率,加快新药研究的步代.     

鞘内注射盐酸奈福泮和芬太尼的相互作用机制观察

目的 观察在大鼠切口痛模型中鞘内注射奈福泮和芬太尼抗伤害作用时的半数有效剂量(ED50)及对脊髓背角c-Fos表达的影响,探讨奈福泮和芬太尼联合用药时的相互作用及镇痛效应的机制.方法 用序贯法求出奈福泮与芬太尼单独使用时ED50,再分别求出两药ED50的1/2、1/4、1/8、1/16合用时各自的ED50.用两药合用时的ED50与单独使用时的ED50作等效曲线及免疫组化测量奈福泮和(或)芬太尼对FLI神经元(FLI-N)的抑制率来分析两者的相互作用.结果 (1)术后鞘内注射奈福泮对切口镇痛作用的ED50值为88.5 μ g(95%CI为80.4～97.4 μ g),芬太尼的ED50值为58.9ng(95%CI为52.3～65.1ng);两者合用药时各自的ED50值分别为奈福泮20.2μ g(95%CI为14.31～28.2μ g),芬太尼16.3ng(95%CI为10.1～21.9ng).(2)在等效曲线中奈福泮与芬太尼合用时的ED50实测值明显落在理论累加等效线的下方,两者差异有统计学意义(P<0.05).(3)1/2 ED50量的奈福泮、芬太尼联合用药对脊髓背角FLI-N抑制率均比ED50量的两药单用的抑制率大(P<0.05).结论 鞘内注射奈福泮和芬太尼抗伤害作用与脊髓背角的c-Fos表达有关,两者联合用药能产生协同作用.