皮肤成纤维细胞培养的体会

国内已有一些科研单位开展了皮肤成纤维细胞的培养技术〔１〕，因其在核型分析中稳定性好，并能够表达其来源个体的基因组中与代谢有关的绝大多数基因，利用理化方法予以检测。此外皮肤组织取材方便、安全，易为患者接受，可以动态观察，细胞株可储存备用，故有着重要的实...     

人皮肤成纤维细胞的高效分离培养及鉴定

[摘要] 目的 建立高效的人皮肤成纤维细胞的原代培养和体外连续培养体系,为组织工程皮肤真皮的构建提供充足的种子细胞。方法 取临床无菌切除的幼儿包皮,利用II型胶原酶分离表皮和真皮, 再用胰蛋白酶消化,剪碎真皮,接种于培养瓶,加少许含10%胎牛血清的高糖-DMEM培养液进行培养,次日补加培养液。原代长满后,进行传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及免疫荧光鉴定。结果 接种次日倒置镜下可见有长梭形细胞迁出、生长,3～4d进行传代,传代后3d长满,可长期传代。细胞免疫荧光检测,Vimentin表达阳性。结论 该方法可快速高效获得构建组织观察皮肤真皮所需的成纤维细胞。     

人牙龈成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的：分离培养人牙龈成纤维细胞,为进一步研究细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控作用提供实验条件。方法：用组织块法培养人牙龈成纤维细胞,并进行形态学和免疫学鉴定。结果：牙龈成纤维细胞原代培养成功并稳定传代,细胞呈长梭形或星形,免疫学鉴定抗波形丝蛋白抗体阳性,抗角蛋白抗体阴性,为中胚层来源的成纤维细胞。结论：组织块法培养的细胞符合牙龈成纤维细胞的形态学和免疫学特征,可作为体外细胞模型,为研究细胞因子对其功能的调控作用奠定基础。     

大鼠气道成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的:体外分离、培养、纯化大鼠气道成纤维细胞,并对其进行鉴定,为进一步气道成纤维细胞的相关研究提供物质基础。方法:处死SD大鼠,在无菌条件下切开胸腔,取出气道,刮去气管内膜上皮及气管外组织,将气道剪成小组织块行贴壁培养,用抗波形蛋白对其进行鉴定。结果:成功分离、培养出SD大鼠气道成纤维细胞,通过鉴定得出所培养的细胞为成纤维细胞。结论:成功分离、培养出大鼠气道成纤维细胞,为进一步深入研究气道成纤维细胞的功能奠定了基础。     

人皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定

目的：探索和建立一种新的、适宜于人皮肤成纤维细胞（Fbs）的体外分离、培养及鉴定方法。方法：采用冷胰蛋白酶和胶原酶联合消化法对人皮肤Fbs的进行体外培养，通过生物化学、免疫细胞化学及ELISA实验技术，对人皮肤Fbs的活力检测、生长曲线、羟脯氨酸（HYP）含量及Ⅰ型胶原含量指标进行研究。结果：人皮肤Fbs原代培养时间较大鼠长。人皮肤Fbs冻存复苏后所得生长曲线与冻存前所得曲线基本相似；人皮肤Fbs培养液中，3～5 d的HYP含量与1 d相比有显著增加（P<0.01）；2～6 d Ⅰ型胶原含量与1 d相比有显著增加（P<0.01）。结论：培养的人皮肤Fbs增殖能力强、适应性强、易培养且性状稳定，可为人类凹陷性瘢痕修复和美容除皱提供可靠的细胞来源。     

人工真皮成纤维细胞的分离培养与鉴定

目的:建立人工真皮成纤维细胞分离培养及鉴定方法.方法:取出生24 h内的Wistar大白鼠背部皮肤,分别用组织块法及酶消化法分离纯化、传代培养,用免疫组织化学方法进行鉴定.结果:用组织块法和酶消化法培养的成纤维细胞呈梭形,属纤维型细胞,免疫组织化学染色95%以上细胞中间丝波形蛋白呈棕色颗粒或棕色着染(阳性);结蛋白抗体和第Ⅷ因子相关抗原均无棕色颗粒或棕色着染(阴性),表明所培养的细胞为比较纯净的成纤维细胞.结论:该培养方法可提供较纯净的足够量的成纤维细胞.     

人成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的建立不同组织来源成纤维细胞的培养方法并比较其培养差异。方法用消化法和贴壁法分离人胚胸主动脉成纤维细胞与人胚肺成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养的细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24 h后人胚胸主动脉成纤维细胞全部贴壁,48 h后细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而消化的人胚肺组织中细胞形态不一,经继续培养4～5代后,培养物完全由成纤维细胞构成。结论用胶原酶Ⅰ消化人胚胸主动脉成纤维细胞效果好,而用胰蛋白酶液消化人胚肺成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

人皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

基因治疗方式可分为间接体内法 (ｅｘｖｉｖｏ)和直接体内法(ｉｎｖｉｖｏ)。离体基因治疗方法亦称间接法是将患者的某种组织或细胞取出体外 ,在短期培养的条件下转入目的基因 ,进行筛选和富集整合有外源基因的阳性细胞 ,然后再回输到患者体内。该方法具有靶细胞明确 ,转染效率高的优点 ,因此在基因治疗中被较多采用。目前 ,国际上已有 10余种疾病的基因治疗研究采用皮肤成纤维细胞为靶细胞 ,并且越来越多的研究已进入临床Ⅰ期试验。本实验探讨了人皮肤成纤维细胞的分离及体外培养方法 ,观察总结了体外培养的生长特征 ,以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞 ,从而为自体皮肤成纤维细胞基因治疗的研究提供充足、可     

东方田鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 对影响东方田鼠胚胎成纤维细胞(MfEF)分离和培养的因素进行探索,并观察其生物学特性.方法 取室内繁殖饲养不同胎龄的东方田鼠胚胎分离成纤维细胞,通过原代和继代培养,分析比较不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度等因素对MfEF分离及培养的影响,观察MfEF的生长形态及其生物学特性.结果 MfEF为贴壁型生长,细胞形态多样,呈梭形、不规则多边形;采用0.125%的胰蛋白酶室温消化12～13 d胚胎组织5 min,以DMEM培养基添加15%小牛血清分离培养MfEF的效果最佳;MfEF2～7代增殖最旺盛.结论 获得了实验室分离、培养MfEF的有效方法,为进一步深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定了基础.     

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况。方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞,评价杆状心肌细胞的比例变化。台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin)治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率。结果在每个成年小鼠心脏分离了40~60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞。心肌细胞培养1 h2、4 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%。心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论应用改良Langendorff方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究。     

西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。     

简易犬皮肤表皮细胞的体外培养

目的　探索犬皮肤表皮细胞简易培养方法 ,以此了解复合组织经体外保存后组织细胞的存活状况。方法　组织块培养法。结果　培养至第 5 d,倒置相差显微镜下可见表皮细胞从组织块周围长出 ,并向四周扩展。第 7d,组织块间长出的表皮细胞已相互汇合 ,交为一体 ,形成单层表皮细胞片。至第 1 1 d,扩增的表皮细胞片直径达 1 mm以上 ,在组织块周边可见乳白色、半透明的表皮细胞生长物。结论　犬表皮细胞在 RPMI1 64 0培养基中生长良好 ,增殖旺盛。组织块培养法简便、易行 ,适合犬表皮细胞培养。     

人胚胎肾间质成纤维细胞培养及其鉴定

目的：探讨人胚胎肾脏成纤维细胞培养方法。方法：利用人胚胎肾脏肾髓质进行培养，然后通过细胞形态学，超微结构，免疫细胞化学等方法进行分析鉴定。结果：培养的细胞为长梭形，单核，超微结构为典型的成纤维细胞，并表达成纤维细胞表面抗原，波形蛋白，结蛋白，不表达角蛋白。结论：成功地培养出人胚胎肾间质成纤维细胞。     

优化贴壁法人皮肤成纤维细胞的原代培养

目的:优化贴壁法原代培养人皮肤成纤维细胞的条件,建立稳定?经济?高效可行的人皮肤成纤维细胞培养方法?方法:采用包皮环切术后皮肤组织,剪成均匀组织块后贴壁,皮肤边缘长出薄层致密细胞团后胰酶消化?传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及细胞免疫荧光鉴定?此方法与酶消化法相对照?结果:优化贴壁法成功率100%,取得组织后2 d沿皮肤边缘均开始生长高密度类圆形细胞层,在1周内可获得高质量?高数量的细胞,传代贴壁后经镜下形态观察及细胞免疫荧光染色确定为皮肤成纤维细胞?结论:较之酶消化法,优化贴壁法细胞存活率高,活性及纯度好?该方法可稳定?经济地获得足够数量的细胞?     

胎儿肝干细胞的分离、鉴定及培养

目的：分离、鉴定人胎肝中肝干细胞并短期培养,为体外扩增及诱导分化实验提供细胞来源。方法：采用原位两步胶原酶灌注结合Percoll液密度梯度离心的方法分离、纯化胎肝中肝干细胞,用光镜、电镜观察所得细胞形态,通过免疫细胞化学染色检测细胞AFP、CK19、CD34。测量肝脏重量及获得的肝干细胞数量,计算肝干细胞产量,对肝干细胞进行短期培养。结果：两步胶原酶灌注可有效消化胎儿肝脏结缔组织,分离的肝脏细胞经不连续Percofl密度梯度离心,可得到肝干细胞,细胞活性率为（88．35±2．45）％（n=30）。光镜下肝干细胞呈卵圆形,直径约为成熟肝细胞的1／3,电镜下肝干细胞直径约10um,细胞大部分被卵圆形细胞核所占据,细胞质少,核浆比例大,内质网、线粒体、高尔基体等细胞器不发达。ABC法免疫细胞化学染色显示：胎儿肝干细胞CK19、CD34及AFP呈阳性信号。对肝干细胞进行培养,12h后肝干细胞逐渐粘附、贴壁、铺展,呈现为圆形、椭圆形,呈上皮细胞样平铺生长。肝干细胞产量为（8．76±0．46）×10^6个／g（n=15）。结论：两步胶原酶灌注结合不连续Percoll液密度梯度离心法可较好地分离纯化胎儿肝干细胞,所得细胞可体外培养,可做为进一步实验的材料。     

人睾丸支持细胞的分离培养及鉴定

目的:建立人胚胎睾丸支持细胞体外分离,纯化及培养的方法,并进行鉴定。方法:取胎龄13~28周的胚胎睾丸,采用两步酶消化,添加特定培养基,培养过程中纯化睾丸支持细胞,并用免疫荧光及RT-PCR技术对培养细胞进行鉴定。结果:通过检测阶段特异性标记物M IS提示胚胎睾丸支持细胞占培养细胞总数的90%以上,经RT-PCR及免疫荧光检测所培养细胞具有分泌产生SCF的能力。结论:在本研究建立的培养体系下细胞可稳定传代,经鉴定为高纯度的睾丸支持细胞,并维持了其体内生物学活性。     

大鼠骨髓源内皮祖细胞分离和培养

目的:研究大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)分离、培养以及诱导向内皮细胞分化的方法。方法:采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离单个核细胞,经贴壁后定向诱导培养2周。以CD34、CD133、VEGFR-2、vWF免疫细胞化学、荧光染色法以及Dil-acLDL结合FITC-UEA-1双荧光染色法鉴定EPCs。结果:贴壁细胞经培养诱导后3d开始伸展,4~7 d形成细胞集落,10~21 d增殖加速呈典型的"鹅卵石"样外观,并出现条索状结构且呈"微血管样"排列生长。细胞免疫荧光染色鉴定CD34、CD133、VEGFR-2、vWF阳性,Dil-acLDL联合FITC-UEA-1双染阳性。结论:从大鼠骨髓中分离单个核细胞,体外诱导培养后可以表现出部分内皮细胞的特征。