成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术

目的建立稳定的成年大鼠心肌细胞分离和培养方法,以便进行成年大鼠心肌细胞收缩功能的研究。方法将成年大鼠心脏挂于Langendorff装置上灌流,胶原酶消化分离成年大鼠心肌,无血清悬浮培养心肌细胞。光镜观察,结合形态学和收缩功能评价心肌细胞。结果新分离的心肌细胞的收获量为(4~6)×106个,杆状和圆形,其中长杆状细胞大于75%,横纹清晰,收缩幅度(12.00±2.68)%。无血清培养24 h后,细胞保持完整的形态结构,长杆状心肌细胞占总数的70%以上,收缩幅度(11.78±1.59)%,与刚培养时的细胞相比,无显著差别(P>0.05)。结论通过本方法可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离培养。     

成年大鼠心肌细胞的分离与培养

目的研究成年大鼠心肌细胞的分离与培养方法。方法成年SD大鼠麻醉后,迅速开胸取心连接于Langendorff装置上进行逆行灌注,用0．06％-0．1％Ⅱ型胶原酶灌注消化分离心肌细胞,采用自然沉降法纯化心肌细胞,用改良M199培养基进行细胞培养。结果本方法可获得60％～85％具有活性的成年大鼠心室肌细胞,每只SD大鼠心脏的细胞产量可达1×10^7个。结论该方法简单、有效,同时具有一定的可控性。     

成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定

目的:建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法,并对心肌细胞内Ca2 动态变化进行测定。方法:用改进的Langendorff装置,行大鼠主动脉插管逆向灌流(温度、pH、水质恒定),用混合液(0.6 mg/mL胶原酶Ⅱ 0.06 mg/mL蛋白酶 1mg/mL牛血清白蛋白)消化心脏,经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞;室温静置1～2 h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2 的动态变化。结果:得到70%～90%长杆状活细胞,钙稳态心肌细胞可占40%～60%;fluo-4 AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。结论:胶原酶和蛋白酶混合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞,可用于心肌细胞内钙信号研究。     

成年大鼠心肌细胞的急性分离方法探讨

目的:介绍一种可以稳定地获得高活性心肌细胞的急性分离方法,以便更有利于心肌细胞电生理研究和分子生物学研究.方法:用正常SD大鼠,麻醉成功后迅速取出心脏,以主动脉逆挂于Langendorff灌流装置上,先以无钙台氏液灌流5min然后换以酶液灌流20min,分次采集心肌组织获取心肌细胞并保存于KB液中.结果:获得大量高活性(78%±7.5%)的心肌细胞,杆状,轮廓和横纹清晰,折光性好.结论:本文介绍的方法稳定性好,获得的心肌细胞数量多,活性好,适合用于心肌细胞电生理和分子生物学研究.     

膜片钳研究中的钙耐受大鼠心肌细胞分离方法

目的：探讨膜片钳实验中大鼠心肌细胞分离过程中影响细胞活性和钙耐受性的各种影响因素。方法：采用Langendorff灌流，先用台氏液灌流30s，再用无钙台氏液灌流5-7min，其后换含胶原酶Ⅰ0.1-0.2g/L的低钙本科液消化约8-30min，最后用无钙台氏液冲洗心脏2min，剪下心肌组织，KB液中37℃剪碎吹打温育5min后，用200μm筛网过滤，室温静置换液后进行膜片钳实验。结果：注意控制水，酶，温度等各种因素后，可得到杆状、横纹清晰、膜良好的耐钙心肌细胞。结论：大鼠心肌细胞分离过程中各种因素控制好后可以保证一定的细胞成活率及其质量，有利于膜片钳实验的顺利进行。     

大鼠心肌细胞急性分离方法

目的 探讨酶法分离大鼠心肌细胞过程中的各种影响因素，提高细胞成活率和膜片钳实验成功率。方法 采用Langendorff灌流，先用无钙液灌流7-8min，再用含胶原酶P0.1-0.3g/L的酶液灌流8-10min，剪下心室肌组织，KB液中用吸管吹打分散，过150μm筛网，放置6-7h后进行膜片钳实验。结果 在分离细胞过程中，注意控制水、酶、温度、pH、O2等各种影响因素，可得到横纹清晰、膜良好、长杆状的心肌细胞。结论 仔细调整和控制细胞分离过程中的影响因素可以保证心肌细胞成活的数量和质量，有利于膜片钳实验的顺利进行。     

大鼠成体心肌细胞的分离和培养

目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4～6∶ 1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.     

成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征

目的比较两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,进一步表征成年大鼠心室肌细胞兴奋-收缩耦联。方法 Langendorff装置进行主动脉逆流灌流,分别用两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,无血清培养并进行腺病毒感染。显微镜下观察单个心肌细胞的形态学特点,荧光显微镜下检测病毒感染。采用IonOptix仪器检测心肌细胞肌节收缩-舒张指标以及心肌细胞钙离子摄入-排出指标。结果两种分离液均可获得70%横纹清晰的长杆状心肌细胞,培养可存活7 d以上。腺病毒感染48 h,绿色荧光蛋白持续表达7 d以上。分离液一获得的心肌细胞不能很好地随电场刺激产生收缩,分离液二获得的细胞可用于检测兴奋-收缩耦联特性,心肌细胞肌节缩短分数为11.61%±2.15%,舒张时间为(0.177±0.031)s,钙瞬变幅度为30.79%±9.74%,钙瞬变衰减时间为(0.300±0.074)s。结论两种分离液均可用于分离和培养成年大鼠心肌细胞,并用于腺病毒转染等长时程研究。分离液二更适用于检测成年大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联特性。     

一种分离和无血清原代培养成年兔心肌细胞的方法

目的　探索成年哺乳动物心肌细胞分离、培养技术。方法　依次用低钙、蛋白酶及胶原酶灌流兔心脏 ,分离心肌细胞 ,并用悬浮法和贴壁法进行无血清原代培养。结果　新分离心肌细胞的产率为 5× 10 6 个 ,其中长杆状细胞占 85 %。用悬浮法培养 4～ 5天 ,细胞保持完整的形态结构 ,用贴壁法细胞可培养数周。结论　此法是比较理想的心肌细胞分离、培养方法     

新生大鼠心肌细胞的分离与培养

目的:建立一种简单实用的新生大鼠心肌细胞分离与培养的方法。方法:用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和分散酶消化心室肌组织,用差速贴壁法纯化心肌细胞进行培养。用台盼蓝染色法检测细胞存活率,倒置显微镜下观察细胞形态变化和细胞搏动频率。结果:从第3天开始,大部分心肌细胞出现搏动,存活率均在96%以上。培养3d的心肌细胞搏动频率较小,到第6天搏动频率达到高峰,随后几天趋于稳定。结论:应用此方法培养的心肌细胞纯度高,存活时间长,是一种稳定、可靠的新生大鼠心肌细胞的培养方法。     

新生大鼠心肌细胞分离与原代培养

目的 应用酶消化法消化心肌组织、培养心肌细胞.方法 0.1%的胰蛋白酶重复消化乳鼠心肌组织多次,收集的细胞用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后过滤,纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育.结果 培养的心肌细胞4～6 h后开始贴壁生长,12～24 h明显增殖,3～4 d后细胞汇合成片.在倒置显微镜下心肌细胞呈圆形、梭形、多角形,伸出伪足,出现自发性节律性搏动.结论 应用酶消化法可简便、快速地获得大量活力高的心肌细胞.     

改良Langendorff主动脉逆行灌流法分离不同大鼠心肌细胞的效率探讨

目的 比较分析Langendorff主动脉逆行灌流联合酶消化传统4步法和改良2步法急性分离普通远交群大鼠(SD)心肌细胞的优缺点。同时探讨改良2步法分离普通SD大鼠、自发性高血压大鼠(SHR)及wistar-京都大鼠(WKY)心肌细胞数量和质量的差异。方法 同时运用传统4步法和改良2步法急性分离SD大鼠心肌细胞,在倒置显微镜下观察心肌细胞形态及存活细胞比率。随后用改良2步法分离SD、WKY和SHR的心肌细胞,比较三种大鼠心肌细胞数量和质量差异,探讨改良2步法在不同大鼠心肌细胞急性分离的价值。结果 两种方法分离SD大鼠心肌所得杆状细胞横纹清晰、棱角分明,均为可供膜片钳实验顺利进行的存活细胞,改良2步法分离所得杆状细胞数、总细胞数较传统4步法显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);改良2步法分离3组大鼠杆状细胞数、总细胞数差异有统计学意义(P<0.05),3组大鼠杆状细胞比率、覆钙后杆状细胞数和细胞总数均没有差异(P>0.05);3组大鼠心脏重量、消化时间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 心肌细胞急性分离的Langendorff主动脉逆行灌流联合酶消化...     

成年大鼠心室肌细胞的分离、培养与鉴定

目的探讨成年大鼠心肌细胞的分离、培养方法.方法麻醉后取成年Wistar大鼠心脏连接于Langendorff装置上进行0.1%胶原酶 0.1%透明质酸酶灌注肖化分离心肌细胞,纯化后培养于DMEM培养基.用免疫荧光染色方法鉴定心肌细胞,并在倒置显微镜、电镜下观察细胞的形态结构.结果本方法分离、培养的心肌细胞纯度为98%,细胞活性为92%,杆状细胞率为82%.结论该方法简单有效,为深入研究成年心肌细胞打下了基础.     

成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况。方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞,评价杆状心肌细胞的比例变化。台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin)治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率。结果在每个成年小鼠心脏分离了40~60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞。心肌细胞培养1 h2、4 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%。心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论应用改良Langendorff方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究。     

适合膜片钳实验的心肌细胞分离方法研究

目的：摸索并建立简便可行的适于做膜片钳实验的心肌细胞急性分离方法。方法：采用自行改进的Langendorff心脏灌流装置,用无钙台氏液和酶解液逆行主动脉灌流之后,剪取心肌组织置于KB液中保存以供全细胞膜片钳方式记录电流,结果：分离所得80％～90％的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的快钠电流。结论：控制好分离心肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。     

成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察

为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法 ,应用生物酶 ( 5g/L胰蛋白酶及 1 g/L胶原酶 )灌注法分离成年大鼠心肌细胞 ,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞 ,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。结果 :心肌细胞的存活率为 91 .7% ;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上 ,细胞完整 ,呈杆状 ,长宽比约为 4～ 6∶1。结果提示 :该方法是比较理想的心肌细胞培养法。     

心肌细胞分离纯化的实验方法

心肌细胞分离纯化的实验方法康毅心肌细胞分离纯化的实验方法@康毅...     

心力衰竭大鼠心肌细胞的分离培养和病理生理特性研究

目的分离培养心力衰竭（心衰）大鼠心肌细胞,以及利用IonOptix^TM系统观察心衰大鼠离体心肌细胞的收缩舒张特性,并与正常的心肌细胞进行对比。方法开胸结扎5只大鼠左前降支冠状动脉,4周后将心衰后的大鼠心脏挂于Langendorff装置上灌流,胶原酶消化分离大鼠心肌,Laminin附壁无血清培养心衰后的心肌细胞。光镜观察心衰后心肌细胞的形态学特点,用含氧台氏液灌流并予电场刺激（0、5Hz,3ms）,利用IonOptix^TM系统检测其收缩／舒张功能并与5只正常大鼠心肌细胞进行对比。结果心力衰竭大鼠有明显的心衰症状。B超显示心衰大鼠射血分数与结扎前相比明显降低[（55&#177;3）％和（78&#177;4）％,P=0.00002]。平均单个心衰的心脏所分离的心肌细胞的收获量明显比正常心脏少[（5．6&#177;0.3）&#215;10^6和（8.1&#177;1.2）&#215;10^6,P=0．0014]。与正常心肌细胞相比,心衰大鼠长杆状心肌细胞显著变长[（152&#177;19）μm和（133&#177;17）μm,P=0．03];收缩幅度显著减少[（7.5&#177;3.2）％和（12．6&#177;3．0）％,P=0.0016];收缩速度显著减慢[（36&#177;18）μm／ms和（60&#177;19）μm/ms,P=0.009]。结论与正常大鼠心肌细胞相比,心衰大鼠心肌细胞具有显著的病理生理学特性,因而可用于病理及药物干预下心衰大鼠心肌细胞功能变化的研究。     

戊巴比妥钠麻醉对分离培养大鼠心肌细胞的影响

目的探讨戊巴比妥钠常用麻醉剂量对分离培养成年大鼠心肌细胞的直接作用。方法分对照组和戊巴比妥钠组（30mg／kg腹腔注射），分离心肌细胞测细胞存活率和单个细胞收缩幅度。结果与对照组相比，戊巴比妥钠组心肌细胞存活率下降（P〈0．01），单个细胞收缩幅度降低（P〈0．05）。结论常用剂量下戊巴比妥钠即可降低心肌细胞存活率，直接抑制心肌细胞收缩幅度。     

小檗碱对急性分离成年大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的　研究小檗碱对急性分离大鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ] i)的影响。方法　采用酶解法分离单个大鼠心肌细胞 ,用钙敏感的荧光指示剂Fluo 3/AM染色 ,以荧光强度 (FI)来代表 [Ca2 + ] i,应用激光扫描共聚焦显微镜实时监测FI的变化。结果　在静息状态下 ,小檗碱 (3～ 1 0 0 μmol/L)对 [Ca2 + ] i 无影响。 3～ 1 0 0 μmol/L小檗碱对KCl 60mmol/L介导的钙内流也无影响。但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)对caffeine 1 0mmol/L引起的钙动员有明显促进作用 (P <0 .0 1 )。结论　小檗碱对于KCl通过电压依赖性钙通道 (VDC)介导的 [Ca2 + ] i 升高无影响 ;但小檗碱 (30和 1 0 0 μmol/L)可能通过影响RyRs而促进肌浆网 (SR)内钙外流 ,也可能对SR钙摄取 ,钙的跨膜转运及Na+ Ca2 + 交换有抑制作用