豫医无毛小鼠无毛基因部分DNA序列分析

目的：探讨豫医无毛小鼠的无毛基因突变情况.方法：采用PCR方法扩增豫医无毛小鼠无毛基因的部分DNA序列,并进行克隆测序,将测序结果与国外公布的小鼠、大鼠及人无毛基因的cDNA序列做同源性比较和分析,确定该鼠无毛基因的特异性.结果：克隆测序结果为一923 bp的片段,相当于Genbank上公布的小鼠无毛基因cDNA序列的3 150～3 565 bp位置,包含4个外显子（外显子13～16）及3个内含子（内含子13～15）;与本室以前所测昆明小鼠无毛基因部分DNA序列100%同源,其外显子部分共416 bp,可编码138个氨基酸,与国外公布的小鼠、大鼠、人的无毛基因核苷酸同源性分别为100%、95%、84%,氨基酸同源性分别为100%、97.8%、84%.结论：①克隆定序了豫医无毛小鼠无毛基因的部分DNA序列;②排除了豫医无毛小鼠无毛基因的突变发生于本段序列的可能;③无毛基因在哺乳动物体内同源性很高,应属保守基因,其蛋白质产物可能在一些基本的调节途径中起重要作用,推测豫医无毛小鼠的无毛基因可能也位于14号染色体.     

豫医无毛小鼠无毛基因的比较生物学分析

目的:分析豫医无毛小鼠与其他物种间无毛基因组成的差异.方法:采用RT-PCR方法对豫医无毛小鼠无毛基因的cDNA序列进行克隆测序,并借助生物信息学分析技术对小鼠、大鼠、猴和人的无毛基因及其所编码的氨基酸序列进行比较生物学分析.结果:获得了豫医无毛小鼠无毛基因的全长4 014 bp的cDNA序列 (GenBank 登录号:AY547390).豫医无毛小鼠与国内外报道的2种小鼠、大鼠、猴、人等5种动物的核苷酸同源性分别为99.9%、99.7%、94.3%、 81.7%、 81.8%,氨基酸同源性分别是99.8%、99.7%、94.5%、79.8%、80.0%.结论:无毛基因是一个高度保守基因,不同物种间具有高度同源性.     

豫医无毛小鼠无毛基因DNA原位PCR检测

目的：探讨原位PCR技术对检测基因组变异的有效性。方法：应用原位PCR检测豫医无毛小鼠皮肤和脾的石蜡组织切片，并以健康昆明小鼠皮肤和脾的石蜡组织切片、PCR反应液不加Taq DNA聚合酶、不加引物和引物不带生物素作为对照。结果：豫医无毛小鼠皮肤和脾石蜡组织切片中检测到清晰的杂交信号，而且杂交信号位于细胞核内；4组对照均未出现杂交信号。结论：原位PCR在基因组变异检测方面实用、有效。     

无毛小鼠同类系的建立

目的：培育包含无毛基因的同类系小鼠新品系，明确无毛基因在不同遗传背景下的表达方式。方法：将无毛基因通过杂交互交导入法分别导入615、C57BL／6、BALB／c、DBA／2共4种近交系。结果：已完成4代导入杂交的第1代、第3代均表现有毛，第2代、第4代互交育出615、C57BL／6、BALB／c、DBA／2共4种无毛小鼠，其脱毛规律同豫医无毛小鼠。结论：无毛基因可以在不同的遗传背景下表达。     

豫医无毛小鼠无毛基因部分内含子突变研究

目的 研究豫医无毛小鼠突变的分子机制。方法 对豫医无毛小鼠和昆明小鼠的基因组DNA进行PCR扩增,对二者扩增片段克隆后测序,对结果进行比较,以确定豫医无毛小鼠无毛基因的特异性程度。结果 本实验共测出豫医无毛小鼠DNA序列1746bp和昆明小鼠DNA序列1733bp,两者不同之处有32处,均位于内含子,突变形式包括插入、缺失和点突变。结论 无毛性状的产生可能与内含子中的插入、缺失和点突变有关。     

BALB/c无毛同类系小鼠的分子遗传学特征分析

目的:探讨BALB/c无毛同类系小鼠无毛基因表型的分子遗传学基础。方法:采用PCR和RT-PCR方法扩增BALB/c无毛同类系小鼠和BALB/c小鼠无毛基因的部分序列,并对测序结果进行对比分析。结果:BALB/c无毛同类系小鼠无毛基因3110位碱基(外显子12)发生G→A突变,使911位的色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子(TGA)。结论:BALB/c无毛同类系小鼠谱系清楚,遗传机制明确,将是一种有价值的动物模型。     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达。方法采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达。结果构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×10³的融合蛋白。结论成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础。     

豫医无毛小鼠中期染色体标本中无毛基因的原位PCR检测

目的确立豫医无毛小鼠无毛基因的原位PCR荧光检测方法。方法应用原位PCR的方法对豫医无毛小鼠中期染色体标本的无毛基因进行检测，并设立PCR反应液中无Taq DNA聚合酶、无引物、无bIo-11—dU/TP等进行多组对照。结果染色体标本上出现1—2个黄绿色的扩增信号，而对照组则无。结论本实验为以后进行该基因的精确染色体定位打下了良好基础。     

分子佐剂小鼠补体C3d基因的克隆与序列分析

目的 构建C3d的真核表达质粒，以期将其作为分子佐剂，提高核酸疫苗的免疫效能。方法 采用PCR技术扩增小鼠补体C3d基因（897bp)，并将其克隆至pGEM-T 载体上；经鉴定其DNA序列正确；再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。结果 经DNA测序证实了该克隆片段为小鼠补体C3dA基因，可进一步用于基因表达和基因治疗的研究。结论 构建了C3d真核表达质粒，为高效核酸疫苗的研究打下了良好的基础。     

豫医无毛小鼠无毛基因突变部位的定位和分析

目的:研究豫医无毛小鼠(YYHL)突变的分子机制.方法:对豫医无毛小鼠和昆明小鼠的基因组DNA进行PCR扩增,对扩增片段克隆后测序,并与Mus muscnlus进行同源性分析.结果:共测出YYHL DNA序列1 824bp和昆明小鼠DNA序列1816 bp,其不同之处有27处,变异方式包括插入、缺失和点突变.其中在12外显子中有一无义突变(G→A),导致该部位由编码色氨酸的UGG转变为终止密码子UGA.结论:YYHL无毛性状的产生可能与基因组的变异有关.     

西藏小型猪MSTN基因分子克隆及序列分析

目的扩增西藏小型猪的肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码区全长序列,并对序列进行生物信息学分析。方法提取西藏小型猪肝脏组织的RNA,反转录成为c DNA,利用RT-PCR方法扩增MSTN基因编码区全长序列,将纯化的片段与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并测定其序列,利用生物信息学方法分析其序列特征,并与其他12种物种构建系统进化树。结果西藏小型猪MSTN基因编码区全长1128bp,编码375个氨基酸,氨基酸序列同源性分析表明,与版纳微型猪MSTN氨基酸序列相似性最高,为99%。结论 MSTN基因西藏小型猪除了与鸡和斑马鱼亲缘关系较远外,与人、犬、版纳微型猪、绵羊、山羊、牛、马、黑猩猩、大鼠、小鼠的关系都较为接近,其中与版纳微型猪的亲缘关系最为接近。     

黑线仓鼠及其白化突变系酪氨酸酶基因的克隆与序列分析

目的对黑线仓鼠及其白化突变系酪氨酸酶基因进行比较研究,揭示黑线仓鼠白化突变系白化性状产生的分子机理。方法根据小鼠与大鼠的酪氨酸酶基因保守区设计3对引物,利用RT-PCR方法 , 从黑线仓鼠及其白化系皮肤总 RNA中扩增得到酪氨酸酶的cDNA基因,并对其二者进行克隆测序。结果成功获得了黑线仓鼠及其白化突变系的酪氨酸酶基因,对二者的序列比较分析结果表明,二者的编码区没有差异。 结论黑线仓鼠白化突变系白化性状产生的原因与已知小鼠的白化性状产生原因不同,并不是由酪氨酸酶基因编码区突变造成的,其白化性状产生的机理有待进一步的研究。     

C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因的克隆及序列分析

【目的】克隆C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因cDNA序列，并进行序列测定和分析。【方法】参照GENBANK公布的C57BL／6小鼠ZFP580eDNA序列（注册号为AK005257），根据ZFP580C端编码基因eDNA序列设计1对引物，采用RT-PCR技术，从C57BL／6小鼠的肾脏组织中扩增ZFP580C端编码基因eDNA序列，回收纯化后与T载体连接，构建重组子pMD18-T-ZFP580，转化大肠杆菌DH5a。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后，测定序列并分析。【结果】自C57BL／6小鼠肾脏组织获得总RNA，扩增出255bp的基因片段，成功构建阳性克隆重组子pMD-T-ZFP580，经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的C57BL／6小鼠ZFP580C端基因eDNA序列与13本RIKEN基因组中心于GENBANK注册（注册号为AK005257）的完全一致，与人ZNF580C端编码基因eDNA序列比较，核苷酸序列同源性为90％；该eDNA序列所编码的氨基酸序列与人ZNT580基因C端比较，同源性为100％，均编码有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白主构域。其氨基酸序列与大鼠、犬、牛比较，同源性分别为100％、100％、98％。【结论】成功克隆C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因，该基因在不同种属间高度保守。     

PKH26和Hoechst 33258联合示踪Uncv无毛小鼠iRhom2及其突变体蛋白

目的利用PKH26和Hoechst 33258联合示踪Uncv无毛小鼠iRhom2及其突变体蛋白在Vero细胞中的定位。方法用PKH26对细胞膜进行染色,同时用Hoechst 33258染料对细胞核进行染色,置于激光共聚焦显微镜下观察。结果通过激光共聚焦荧光显微镜观察目的蛋白,发现野生型iRhom2分布在细胞的胞浆,而iRhom2mut于细胞浆内和细胞核内都存在。结论亚细胞定位的不同推测到iRhom2的N末端缺失突变可能对其细胞内的定位有影响。     

人脂联素基因的克隆及序列分析

目的：克隆人脂联素基因（apM1）,为进一步研究脂联素的功能提供实验基础.方法：应用RT-PCR法自人大网膜脂肪组织的总RNA中扩增出apM1 cDNA全长基因,采用T-A克隆法重组到pGEM-T Vector System中,通过蓝白斑筛选出阳性克隆后,测序鉴定.结果：从脂肪组织总RNA中扩增得到735bp apM1基因,其cDNA序列与GenBank报导的人脂联素基因apM1同源性为99.7%（159位和558位碱基发生了无义突变）,获得了质粒pGEM-T-apM1,测序鉴定正确.结论：成功的克隆了apM1基因全长cDNA.     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白M的基因克隆与序列分析

目的：建立汉坦病毒（HV）包膜糖蛋白M的克隆载体;研究M基因的变异情况,并对其序列进行系统发生树分析。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增GM04—38M片段的基因。产物纯化后克隆于PMD-18T载体。经氨苄青霉素筛选,酶切鉴定,并进行序列测定,应用DNASTAR软件将它与世界范围内分离的病毒株同一基因序列分析比较。结果：筛选出含有HVM蛋白基因的克隆。GM04—38株M片段的全基因序列共3651个核苷酸。4种核苷酸的比例分别为：A30．46％。T30．13％,G20．84％。C18．57％。序列同源分析表明。GM04—38株与Z37株核苷酸同源性最高（97.3％）。属于SEO型HV。与其他SEO各株的差别均小于18．0％：绘出了核苷酸系统发生树。结论：成功地建立汉坦病毒M蛋白基因克隆载体：中国不同地区汉坦病毒流行株基因序列存在明显差异。这为研究HV遗传与变异以及制备有效的亚单位疫苗奠定了基础。     

表皮生长因子受体跨膜区编码序列的克隆

目的：克隆表皮生长因子受体跨膜区（Transmembrane,TM）编码序列，为构建跨膜型超抗原和细胞因子的表达载体奠定基础。方法：以表达c-erb-B2癌基因的中国卵巢癌细胞系HO－8910细胞的RNA逆转录产物(cDNA）为模板，用两条针对c-erb-B2全长基因序列中编码TM区序列特异性的引物，采用RT－PCR方法克隆TM区片段并测序。结果：实验克隆的TM编码序列，经测序证实与Genbank中接受号为M11730的TM区序列完全一致；与接受号为X03363的TM区序列存在G→A的多态性。结论：成功地克隆了TM编码序列，并证实源于中国的卵巢癌细胞系HO－8910中所包含的表皮生长因子受体基因中编码的TM区序列存在多态性。