斑马鱼Tbx2基因阻抑先天性心脏病模型的建立与研究

目的建立斑马鱼Tbx2基因阻抑先天性心脏病动物模型,并研究Tbx2基因对心脏发育的影响。方法通过吗啉环寡聚核苷酸显微注射介导的翻译抑制,观察Tbx2基因阻抑胚胎的心脏发育,并通过心脏特异性分子标记整胚原位杂交技术进一步阐明Tbx2在心脏发育中的作用。结果600枚Tbx2基因阻抑的斑马鱼胚胎受精后8h27．2％（163／600）胚胎死亡,24～96h出现轻、中、重度不同程度的心脏发育异常,比例分别为21．3％（128／600）、32．8％（197／600）、18．7％（112／600）,心脏缺陷包括心室发育不良、心房扩张、房室区异常、心率缓慢、心律不齐、血液反流等,整胚原位杂交结果显示了房室区特异性分子标记多能聚糖（versican）基因表达的异常。结论斑马鱼是研究心脏发育的理想模式生物,吗啉环寡聚核苷酸基因阻抑是研究基因功能的良好方法。Tbx2基因在房室特异性分化和房室管形成方面起了重要的作用。     

心脏发育候选致病基因KIAA0196斑马鱼品系的建立及初步机制研究

目的：探究KIAA0196基因对心脏发育的影响及斑马鱼品系的建立。方法：提取先天性心脏病患者外周 血和gDNA,采用拷贝数变异和靶向序列分析筛选出候选致病基因。用CRISPR/Cas9技术建立KIAA0196基因敲除斑 马鱼品系。对野生型和突变型斑马鱼进行解剖和组织学染色,观察心脏形态、大小及环化方向等表型。结果：通过 CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼KIAA0196基因敲除品系。受精后60 h,突变个体(杂合子+纯合子)显微镜检查显 示心包积液、心脏受压和尾部严重卷曲。突变型斑马鱼与野生型相比,心脏存在心房缩小,心室增大,心肌细胞更 加松散等缺陷。结论：KIAA0196基因在心脏发育过程中起重要的调控作用,该基因可能为先天性心脏病的致病候选 基因。     

视黄酸影响斑马鱼胚胎心脏房室分化

目的观察外源性视黄酸对斑马鱼心脏前后轴发育即心脏房室分化的影响。方法采用化学遗传学方法在斑马鱼胚胎发育至12.5hpf(hours post fertilization)给予5×10-8mol/L和10-7mol/L外源性视黄酸处理1.5h。应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸对心脏特异基因vmhc,amhc,nkx2.5和nppa表达的影响。结果vmhc,amhc探针的整体原位杂交结果显示视黄酸处理会导致斑马鱼胚胎心脏的前后轴发育异常,表现为vmhc表达细胞的范围缩小,amhc表达细胞的范围明显增大。视黄酸可以明显增强nppa在心脏的表达。视黄酸对心脏房室分化的影响在48hpf后表现得明显。结论5×10-8mol/L和10-7mol/L视黄酸在12.5hpf处理斑马鱼胚胎对斑马鱼心脏早期发生没有影响。斑马鱼发育过程中,视黄酸对心脏的房室分化过程起着重要的调控作用,视黄酸支持心房的分化和发育,同时抑制心室发育。     

视黄酸缺乏对斑马鱼心脏房室分化的影响

目的 通过化学遗传学方法建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,探讨视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏前后轴发育即房室分化的影响.方法 在斑马鱼胚胎孵育的5 hpf,用不同浓度梯度的视黄醛脱氢酶2抑制剂DEAB(1×10-6、5×10-6、10×10-6、25×10-6 mol/L)处理斑马鱼胚胎,实时观察斑马鱼胚胎发育的全过程.通过给予斑马鱼胚胎外源性视黄酸,观察其对DEAB的拮抗作用.应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸缺乏对心脏特异基因vmhc和amhc表达的影响.结果 斑马鱼胚胎的生存率随着DEAB处理浓度的增加而降低,当DEAB浓度≥5×10-6 mol/L时,斑马鱼的畸胎率达100%.5×10-6 mol/L DEAB的致畸作用能够被1×10-9mol/L外源性视黄酸所拮抗.整体原位杂交结果显示视黄酸缺乏会导致斑马鱼胚胎心脏房室分化异常,表现为vmhc表达细胞的范围增大,amhc表达细胞的范围缩小.结论 通过外源性DEAB处理能有效地建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,DEAB影响胚胎发育存在剂量依赖性.视黄酸在斑马鱼心脏前后轴发育过程中起重要调控作用,心脏发育早期视黄酸缺乏会抑制心房的发育而支持心室的发育,出现房室分化异常.     

大鼠胚胎心脏的发育过程及基因HCY-2在大鼠胚胎心脏内的表达

目的 研究大鼠胚胎心脏的发育过程和同型半胱氨酸诱导基因(HCY-2)在大鼠胚胎心脏上的表达，为进一步探讨该基因与心血管疾病之间的关系奠定形态学基础。方法 分别于大鼠妊娠11～19d取胚胎，用组织学和免疫组织化学方法，观察大鼠胚胎心脏的发育过程和Hcy-2基因的表达并进行图像分析。结果 大鼠胚胎心脏11d出现第一房间隔，13d出现第二房间隔，14d心房不完全分隔完成；12d出现室间隔肌部，16d心室巳分隔完成。Hcy-2在大鼠胚胎心脏不同发育时期表达不同，11、12d表达强，13d表达减弱，14、15、16d表达又逐渐增强，17、18、19d表达强。结论 大鼠胚胎心脏内部分隔晚于小鼠；基因Hcy-2与心脏发育密切相关。     

MiR-738通过Wnt信号通路调控斑马鱼心脏发育

目的：研究miR-738对模式动物斑马鱼心脏发育的影响。方法：通过全胚胎原位杂交检测miR-738的表达。在斑马鱼受精卵中显微注射miR-738前体来过表达miR-738。通过显微镜成像来检测心脏表型。通过荧光素酶报告基因检测来验证miR-738调控Lefl。结果：MiR-738在30hpf斑马鱼心脏表达。MiR-738过表达导致斑马鱼胚胎心脏显著增大。MiR-738可以抑制Lefl的表达。结论：MiR-738通过Wnt信号通路调控斑马鱼心脏发育。     

Midkine-a通过限制心肌细胞总数的方式阻碍斑马鱼胚胎心脏生长

目的 探讨一种可溶性的外分泌因子Midkine-a在斑马鱼胚胎心脏发育过程中的功能。方法 在整体胚胎上做Midkine-a RNA的原位杂交实验;利用原有的转基因斑马鱼系Tg (pMidkine-a:EGFP),动态观察胚胎从出生到心脏发育成形这一段时间心脏荧光表达情况;将原有的转基因斑马鱼体系 Tg (phsp:Midkine-a:EGFP) 胚胎进行热休克而过表达Midkine-a,观察胚胎心脏表型;利用Tg (pcmlc2:dsRed)鱼系胚胎的心肌细胞核带有红色荧光,能进行单个心脏心肌细胞计数这一特点,将杂合的Tg (phsp:Midkine-a:EGFP)鱼系与纯合的Tg (pcmlc2:dsRed)鱼系交配,以得到Tg (phsp:Midkine-a:EGFP/pcmlc2:dsRed)的杂合胚胎,对其进行热休克而过表达Midkine-a,计算每个胚胎心脏内心肌细胞的总数; 用吗啉寡聚核苷酸 （Morphonino,MO）阻碍新生胚胎内的Midkine-a mRNA 表达,观察胚胎心脏表型。结果 原位杂交试验证实Midkine-a在胚胎48hpf （hours post fertilization, 受精后小时,用来标记斑马鱼胚胎年龄）大时表达于心脏;转基因Tg (pMidkine-a:EGFP)胚胎在72hpf时其EGFP表达于心脏;Tg(phsp:Midkine-a:EGFP) 胚胎在过表达Midkine-a后心脏变小;吗啉寡聚核苷酸敲除Midkine-a对胚胎心脏发育无影响;最后在Tg (phsp:Midkine-a:EGFP/pcmlc2:dsRed)鱼系胚胎内过表达Midkine-a导致其单个心脏内心肌细胞数目变少,与其小心脏外形吻合。结论 Midkine-a在斑马鱼胚胎发育过程中表达于胚胎心脏;过表达Midkine-a导致胚胎心脏内心肌细胞总数减少及心脏变小;敲除Midkine-a则对胚胎心脏发育无影响。     

氯氮平对斑马鱼心脏发育的影响及机制研究

目的：探索氯氮平（clozapine,CLP）对斑马鱼心脏发育的损伤效应及相关机制。方法：以 12.5 μmol/L 氯氮平（L- CLP）及25.0 μmol/L氯氮平（H-CLP）处理斑马鱼胚胎72 h,显微镜下检测心脏形态、心率、静脉窦-动脉球（sinus venosus-bulbus arteriosus,SV-BA）距离等指标;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测心脏发育相关基因NKX2.5、Hand2及Cmlc2表达;此外,H-CLP 组处理24 h后,利用内质网抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid,4-PBA）或多巴胺D2受体抑制剂溴隐亭（bro- mocriptine,BRC）联合处理48 h后,统计心脏功能指标,检测内质网应激分子（Chop、Bip）及凋亡相关分子（Caspase3、Bax/Bcl2） 的表达。结果：CLP剂量依赖性导致斑马鱼心脏结构及功能损伤,Chop、Bip和Caspase3、Bax/Bcl2的表达增加;4-PBA及BRC显著缓解CLP诱导的心脏损伤及Chop、Bip、Caspase3、Bax/Bcl2的高表达。结论：CLP导致斑马鱼心脏发育受损,可能与抑制多巴胺D2受体、激发内质网应激有关。     

Polycomb家族基因Nspcl在斑马鱼早期发育的表达

目的 探讨Polycomb家族基因Nspel在模式生物斑马鱼发育早期的表达模式.方法 根据GenBank中斑马鱼Nspcl的cDNA序列设计Nspcl原位杂交探针片断,并制备地高辛标记的探针.收取单细胞期、双细胞期、胚芽期及不同时间点的体节期斑马鱼胚胎,用制备好的探针作原位杂交,显微镜下拍照,获得信号适当的杂交结果.结果 在斑马鱼体节期前,Nspcl在全身表达;从体节期开始,其表达逐渐表现出特异性,主要在头部的神经系统中表达.结论 Nspcl在模式生物斑马鱼的早期发育、尤其是神经系统发育的过程中可能扮演重要角色.     

阿奇霉素对斑马鱼心脏毒性的初步研究

目的建立阿奇霉素诱导斑马鱼幼鱼心脏毒性的模型,为后续抗菌类药物心脏毒性的机理研究奠定基础。方法以受精后2 d发育正常的斑马鱼胚胎作为模型,以不同浓度的阿奇霉素处理斑马鱼胚胎3 d后,观察斑马鱼胚胎心脏形态并计算其心率和心搏量以评价斑马鱼胚胎心脏的功能。结果 0.3和1 mm浓度的阿奇霉素作用3 d后,可见斑马鱼胎心明显毒性。与正常对照组比较,模型组斑马鱼胎心肿大,心率减慢和心搏量减小。结论阿奇霉素对斑马鱼胎心有明显毒性作用,且与阿奇霉素的浓度正相关,该模型可以用于后续抗生素类药物引起的心脏毒性的机理研究。     

hand2基因对斑马鱼胚胎发育影响的实验研究

  目的 观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况,验证显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸（Morpholino oligonucleotides,MO）使hand2 表达下调的有效性。观察hand2 表达下调后斑马鱼胚胎发育的异常表型,初步探讨hand2在斑马鱼胚胎发育中的作用,为利用斑马鱼开展hand2的功能研究提供线索。 方法 采用胚胎整体原位杂交的方法观察hand2在斑马鱼胚胎内的表达情况。利用向斑马鱼受精卵显微注射MO的方法使hand2 表达下调,并进行hand2 表达下调的效率验证。将斑马鱼单细胞受精卵分为四组进行显微注射,即对照MO（Con MO）注射组、hand2 MO注射组、hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组。在荧光显微镜下观察hand2-GFP mRNA注射组和hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组的荧光表达情况以验证hand2 表达下调的效率。在显微镜下观察hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的各器官发育情况并进行评定。 结果 hand2在斑马鱼胚胎的侧板中胚层、咽弓、心脏和鳍有较强表达。hand2-GFP mRNA注射组在8hpf（hours post fertilization）时胚胎有较强的荧光表达,而hand2-GFP mRNA+hand2 MO注射组胚胎几乎无荧光表达。与Con MO注射组相比,hand2 MO注射组斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节有明显的发育异常。 结论 向斑马鱼受精卵显微注射hand2 MO的方法可有效的使 hand2表达下调。hand2 在斑马鱼胚胎的心脏、血管、血细胞、鳍以及体节的发育过程中有重要作用。     

利用吗啉代寡核苷酸技术下调早期斑马鱼胚胎lmna基因的初步研究

目的利用吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼lmna基因的技术方法。方法在斑马鱼lmna基因序列中选择靶点,设计针对斑马鱼lmna基因的吗啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),构建能特异指示lmna基因表达的lmna-EGFP-pCS~(2+)重组质粒,并通过显微注射方式将二者共注射入斑马鱼胚胎中,通过观察胚胎中绿色荧光表达量反应lmna基因表达量,并通过蛋白质印迹法检测胚胎中lamin蛋白表达量。结果蛋白质印迹法检测斑马鱼体内lamin蛋白的表达,分别有大小为69 KD和62 KD两种蛋白表达。设计并构建了lmna-MO和重组质粒lmnaEGFP-pCS~(2+),单独注射lmna-EGFP-pCS~(2+)质粒后观察到从6 hpf到96 hpf胚胎均有绿色荧光蛋白表达;二者共注射后观察到,与对照组相比,实验组从6 hpf至30 hpf胚胎中绿色荧光蛋白表达量均不同程度下降或消失;蛋白质印迹实验结果显示实验组胚胎内lamin蛋白表达量明显下降。表明已成功下调了斑马鱼胚胎lmna基因表达。结论可通过lmna-MO和重组质粒lmna-EGFP-pCS~(2+)共注射方法下调斑马鱼lmna基因表达,并通过绿色荧光蛋白表达量反映下调效果。该方法可为深入研究人核纤层病提供良好的动物模型。     

Kruppel样因子6对肝癌HepG2细胞的作用及其缺失对斑马鱼肝脏发育的影响

目的 探讨Kruppel样因子6（KLF6）低表达对肝癌细胞凋亡及迁移能力的影响,并以斑马鱼作为动物模型,研究klf6基因沉默对肝脏发育的作用。方法 构建敲除KLF6基因质粒,转染肝癌细胞（HepG2）及正常人肝细胞（L-02）,通过免疫印迹（WB）、凋亡及细胞周期测定、划痕实验检测KLF6基因敲除后对HepG2细胞的影响;设计合成沉默KLF6基因的吗啉代寡核苷酸（Morpholino）,显微注射入转基因斑马鱼Tg（lfabp：eGFP）胚胎中,通过免疫荧光法观察KLF6蛋白表达的变化以及对转基因斑马鱼胚胎肝脏发育表型的影响。结果 体外实验表明,L-02细胞中的KLF6蛋白的表达量明显高于HepG2细胞;敲除KLF6基因后,HepG2细胞KLF6蛋白表达明显减少、凋亡减弱、细胞周期主要集中于S期、迁移能力增强;体内实验表明,klf6基因沉默后,斑马鱼胚胎肝脏中的KLF6蛋白表达量减少,肝脏发育明显迟缓。结论 KLF6基因低表达促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,减少凋亡;且影响斑马鱼肝脏的正常发育。探讨KLF6基因低表达及其功能,可为以后斑马鱼肝癌模型建立及药物筛选提供理论基础。     

MMP21基因表达下调对斑马鱼心脏环化的影响

目的 探讨基质金属蛋白酶21(matrix metallopeptidase 21,MMP21)基因表达下调对斑马鱼胚胎发育的影响.方法 在斑马鱼胚胎1～2细胞期采用显微注射吗啡啉反义寡核苷酸(morpholino antisense oligonucleotides,MO)的方法下调MMP21基因的表达.10体节期用RT-PCR方法检测MMP21-MO的有效性.设置0.5、0.75、1 mmol/L和1.5 mmol/L 4个不同浓度梯度的MMP21-MO注射组,以标准对照吗啡啉反义寡核苷酸(Con-MO)注射组和野生型(WT)组为对照.体视显微镜下观察各组斑马鱼胚胎发育情况,统计分析不同注射浓度斑马鱼胚胎死亡以及畸形数量.整胚原位杂交检测心脏特异性标志物(cardiac myosin light chain 2,cmlc2)在受精后28 h(hours post fertilization,hpf)及受精后48 h的表达,体视显微镜下观察受精后72 h斑马鱼胚胎心脏,分析各时间点斑马鱼心脏环化情况.通过计数各组斑马鱼胚胎受精后24、48及72 h心率和测量各组胚胎受精后72 h时心室收缩分数(ventricular shortening fraction,VSF),评价MMP21基因表达下调对斑马鱼心脏功能的影响.结果 MMP21-MO能够有效抑制MMP21基因的表达.MMP21-MO对斑马鱼胚胎发育的影响存在一定的剂量反应关系.1 mmol/L MMP21-MO注射组胚胎畸形率最高,死亡率较低,畸形主要表现为心前区水肿、心脏环化异常、心脏搏动减弱和心率减慢.整胚原位杂交结果显示MMP21基因的表达下调导致心脏特异标志物cmlc2 mRNA在受精后28 h和受精后48 h时期异常表达,提示心脏环化前期阶段(cardiac jogging)和心脏环化(cardiac looping)过程异常.受精后72 h体视显微镜下观察斑马鱼心脏形态同样发现MMP21-MO注射组斑马鱼心脏环化异常.与对照组比较MMP21-MO注射组胚胎心率减慢,心室收缩分数下降.结论 MMP21基因表达下调导致斑马鱼心脏环化异常及心功能受损,MMP21基因可能在斑马鱼心脏环化过程中发挥重要作用.     

Effect of Tbx1 knock-down on cardiac performance in zebrafish

Background Tbxl is the major candidate gene for DiGeorge syndrome （DGS）. Similar to defects observed in DGS patients, the structures disrupted in Tbxl-/- animal models are derived from the neural crest cells during development. Although the morphological phenotypes of some Tbxl knock-down animal models have been well described, analysis of the cardiac performance is limited. Therefore, myocardial performance was explored in Tbxl morpholino injected zebrafish embryos. Methods To elucidate these issues, Tbxl specific morpholino was used to reduce the function of Tbxl in zebrafish. The differentiation of the myocardial cells was observed using whole mount in situ hybridization. Heart rates were observed and recorded under the microscope from 24 to 72 hours post fertilization （hpf）. The cardiac performance was analyzed by measuring ventricular shortening fraction and atrial shortening fraction.Results Tbxl morpholino injected embryos were characterized by defects in the pharyngeal arches, otic vesicle, aortic arches and thymus. In addition, Tbxl knock down reduced the amount of pharyngeal neural crest cells in zebrafish. Abnormal cardiac morphology was visible in nearly 20% of the Tbxl morpholino injected embryos. The hearts in these embryos did not loop or loop incompletely. Importantly, cardiac performance and heart rate were reduced in Tbxl morpholino injected embryos.Conclusions Tbxl might play an essential role in the development of pharyngeal neural crest cells in zebrafish. Cardiac performance is impaired by Tbxl knock down in zebrafish.     

g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达

目的: 观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法: 利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒,并将其显微注射入斑马鱼胚胎内,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;蛋白质印迹法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白的表达量;改良G6pd定量比值法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd酶活性。结果: g6pd基因在进化过程中相对保守,斑马鱼与人类的G6pd蛋白质相似度为88%,斑马鱼与小鼠的G6pd蛋白质相似度为87%。原位杂交试验结果显示,g6pd基因主要表达于斑马鱼的造血组织,显微注射g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒后观察的结果与原位杂交试验结果一致。24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白相对表达量分别为1.44±0.03、1.47±0.05、1.54±0.02,差异无统计学意义（P > 0.05）;G6pd酶活性分别为1.74±0.17、1.75±0.12、1.71±0.22,差异无统计学意义（P > 0.05）。结论: 成功观察到斑马鱼体内g6pd基因表达部位及其变化规律,并测定了不同发育时相斑马鱼胚胎中G6pd蛋白表达和酶活性,为建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。     

益母草碱对阿霉素致斑马鱼心脏毒性保护作用的初步研究

目的观察不同浓度的盐酸益母草碱对阿霉素所致斑马鱼胚胎心脏毒性的保护作用。方法应用发育正常受精后48h的斑马鱼胚胎作为实验模型,用盐酸益母草碱＋阿霉素（浓度为0＋30mg／L,30mg／L＋30mg／L,60mg／L＋30mg／L,120mg／L＋30mg/L）处理上述胚胎,分别于受精后60h、72h和96h时观察胚胎心脏的形态及心率的变化。结果各给药组以及对照组在给药后均出现心率减慢、心脏区域出血的胚胎心脏中毒现象。但益母草碱联合用药组的心脏毒性作用较小,且随着盐酸益母草碱浓度的升高,阿霉素的心脏毒性作用明显减小。结论阿霉素对斑马鱼胚胎具有心脏毒性作用．而盐酸益母草碱对阿霉素所致心脏毒性具有保护作用。     

bcl-2反义寡核苷酸对膀胱癌BIU87细胞株的影响

目的:探讨bcl-2反义寡核苷酸对培养的膀胱癌BIU87细胞株的影响.方法:采用bcl-2基因第1外显子的反义寡核苷酸,以硫代磷酸修饰(PS-ASON),序列为5′-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3′,与膀胱癌细胞株BIU87共同孵育作为实验组.加入正义的bcl-2寡核苷酸,序列为5′-TACCGCGTGCGACCCTCT-3′(PS-SON)作为对照组,用流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死率,电镜观察细胞形态变化.结果:与对照组相比,实验组的细胞坏死率明显上调,电镜下细胞形态呈坏死改变.结论:bcl-2的反义寡核苷酸引起膀胱癌细胞大量坏死,可能成为膀胱癌的治疗方法之一.     

Bcl-2反义寡核苷酸对肾癌细胞株的生长抑制作用

目的：研究bcl-2反义寡核苷酸对肾细胞癌细胞的生长抑制作用及剂量一效应关系。方法：设计、合成与已知人类基因无同源性的bcl-2反义寡核苷酸(AS1翻译起始端，AS2编码区)，以阳离子脂质体Lipofectin转染不同的肾癌细胞株，MTS比色实验测定细胞活率。结果：单纯Lipofectin、反义寡核苷酸及正义寡核苷酸处理，对肾癌细胞ACHN生长无抑制作用，而转染入细胞内的反义寡核苷酸可抑制多种肾癌细胞的生长(ACHN、RCW和OSRC-2)，且抑制作用与剂量呈正相关。结论：bcl-2反义寡核苷酸可剂量依赖性抑制多种肾癌细胞的生长。