热应激对大鼠睾丸iNOS表达的影响及其意义

目的 研究热应激对大鼠睾丸诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表达的影响及其意义。方法42d龄SD雄性健康大鼠12只建立单侧隐睾作为热应激处理的模型,术后第7d处死大鼠留取双侧睾丸,采用RT—PCR及免疫组化SABC法分别检测生精细胞iNOSmRNA和蛋白表达的变化,TUNEL法检测生精细胞凋亡。结果热应激处理后生精上皮内可见iNOS强阳性表达,而对侧睾丸生精上皮内无iNOS表达;热应激处理后睾丸iNOSmRNA也较对侧睾丸增强,生精细胞凋亡指数明显高于对侧睾丸,差异均有显著性意义（P〈0．05）。结论热应激导致生精上皮内iNOS表达增强,生精细胞凋亡增加,iNOS参与介导生精细胞凋亡。     

盐酸利多卡因神经毒性损伤大鼠脊髓钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的表达

目的 观察大鼠鞘内注射盐酸利多卡因神经损伤后脊髓钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMK Ⅱ)的表达变化.方法 鞘内成功置管的雄性SD大鼠48只,体质量(230±20)g,用随机数字表法将大鼠分成4组(n=12,其中行为学检测大鼠8只,免疫印迹实验大鼠4只):正常组(C组)、假手术组(S组)、溶媒组(D组)、10％利多卡因组(L组).分别于给药前、给药后2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d、4d、5d等时点检测大鼠机械缩腿阈值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩腿潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL).并于给药后12h取4只大鼠脊髓腰膨大,免疫印迹检测大鼠脊髓腰膨大CaMKⅡ的表达.结果 C组、S组和D组大鼠MWT的基础值分别为(11.2±3.1)g、(11.8±2.2)g和(11.4 ±2.4)g,其余各时间点与基础值比较差异无统计学意义(n=8,P＞0.05);L组大鼠MWT在给药后2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d、4d时点显著增加(n=8,P＜0.01),分别为(22.0±6.6)g、(22.2 ±5.3)g、(20.5 ±5.8)g、(18.5 ±4.3)g、(16.7 ±3.2)g、(15.2 ±3.1)g、(15.5 ±3.5)g、(13.7±2.4)g.与MWT结果相似,C组、S组和D组大鼠TWL的各时间点比较差异无统计学意义(n=8,P＞0.05);L组大鼠TWL在给药后2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d时点显著增加(n=8,P＜0.01).C组、S组、D组及L组大鼠脊髓CaMK Ⅱ表达分别为0.17±0.03、0.16 ±0.03、0.19 ±0.05、0.42 ±0.11,L组大鼠表达显著增加(n=4,P＜0.01).结论 鞘内注射盐酸利多卡因可致脊髓CaMK Ⅱ表达显著增加,提示CaMK Ⅱ可能与盐酸利多卡因所致的神经损伤有关.     

热应激对大鼠睾丸影响的研究

目的:通过观察大鼠睾丸热应激后热休克蛋白70(Hsp70)、Bax、Bcl-2m RNA及活化caspase-3表达的变化,探讨Hsp70在睾丸热应激中的作用。方法:热应激模型用43℃水浴20min造成,0.5h、2h、6h、24h、48h分批处死大鼠,摘取睾丸进行研究。Real time PCR检测Hsp70、Bax、Bcl-2 mRNA;Western blot检测活化caspase-3;HE染色、TUNEL检测形态和凋亡信号。结果 :热应激后生精细胞逐渐脱落甚至缺失,凋亡信号在热应激后也明显增加,24h时表现最为严重,与形态变化一致。Hsp70 mRNA的表达热应激后迅速上调,0.5h组、2h组与正常组之间存在统计学差异(P<0.05);各热应激组Bax和Bcl-2 mRNA的表达与正常组相比,无统计学差异(P>0.05);但热应激后Bcl-2/Bax显著增加(P<0.05)。活化caspase-3在2h时表达最少,与正常组之间存在统计学差异(P<0.05)。结论:睾丸热应激诱导Hsp70m RNA高表达,进而通过上调Bcl-2/Bax、下调活化caspase-3水平而发挥抗凋亡作用。     

钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的制备与活性测定

目的：从牛心肌中提取纯化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ),并测定其活性。方法：采用DEAE-cellulose柱层析和Sepharose 4B亲和层析分离纯化蛋白,用γ－^32P掺入法测定CaMKⅡ及自磷酸化的CaMKⅡ活性。结果：从牛心肌中提取到钙调蛋白结合的蛋白组分,纯化后得到的CaMKⅡ比较稳定,产量也较高,此过程比较简单,适合大量制备,经SDS-PAGE检测,发现酶提取物均质,酶亚基的目的蛋白带相对分子质量为56000。在syntide-2为底物的反应中,纯化的CaMKⅡ的特异性酶活性为7．84pmol.min^-1.mg^-1。CaMKⅡ可自磷酸化,经过自磷酸化的酶在Ca2 和钙调蛋白不存在时也保持活性。结论：通过凝胶层析与亲和层析可提纯CaMKⅡ。     

热应激对大鼠睾丸Bcl-2和Bax表达的影响

目的研究热应激对大鼠睾丸B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X(Bcl-2 associated X,Bax)表达的影响。方法42天龄24只雄性SD大鼠建立单侧隐睾作为热应激处理的模型,随机选取16只大鼠建立左侧隐睾作为热应激处理的模型,其余8只将左侧睾丸还纳入阴囊后关腹作为假手术组。术后第3天和第7天分别采用RT-PCR和免疫组织化学SABC方法检测热应激处理后睾丸Bcl-2、Baxm RNA和蛋白表达的变化。结果与假手术组睾丸相比,热应激后第7天睾丸生精上皮和睾丸间质细胞内Bax mRNA和蛋白表达增高,而Bcl-2 mRNA蛋白在热应激后第3天表达明显降低,差异有显著性(P<0.05)。结论热应激能导致睾丸内Bax表达增高,Bcl-2表达降低,从而促进生精细胞凋亡增加。     

单次热应激对小鼠睾丸雄激素受体的影响

目的探讨单次热应激对小鼠睾丸雄激素受体(AR)的影响。方法将6周龄C57雄性小鼠24只分为对照组(6只)和热应激处理组(18只)。小鼠睾丸热应激处理组给予单次43℃水浴,干预15 min,于1 d、7 d和14 d取睾丸,用免疫组织化学染色检测雄激素受体蛋白在睾丸组织中的定位及变化,蛋白印迹(Western Blot)检测睾丸中雄激素受体蛋白的表达,并进行统计学分析。结果免疫组织化学检测显示,AR定位在细胞的细胞核,在曲细精管的基底膜处以及间质细胞中表达,在第14天表达最强;Western blot检测显示,与对照组相比,热应激后雄激素受体蛋白的表达随着时间推移不断增多,且组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论小鼠睾丸经43℃水浴单次热应激15 min后,雄激素受体蛋白表达对生精细胞恢复有保护作用。     

单次热应激诱导小鼠睾丸间质细胞乙醛脱氢酶蛋白表达的变化

目的 探讨ALDH2在单次热应激致小鼠睾丸功能可逆性变化中的作用。方法 C57雄性小鼠18只,随机分成对照组和热处理组,热处理组按处理后1、7、14 d分成3个亚组(n=3),每组设立对照组(n=3),热应激组和对照组小鼠下腹部分别置于43 ℃和25 ℃水浴中干预15 min,于处理后1、7、14 d 取睾丸组织。免疫组化染色检测ALDH2蛋白定位及表达,Western 印迹检测ALDH2蛋白表达水平。结果 免疫组化显示,ALDH2蛋白在睾丸间质细胞中表达。Western 印迹检测显示,与对照组相比,热应激后第1天,ALDH2蛋白表达无明显改变;热应激后第7天、14天较对照组及热应激第1天比较,ALDH2蛋白表达明显增多(P＜0.01);热应激第7天与热应激第14天,ALDH2蛋白表达无明显改变。结论 小鼠在热应激处理后的第7、14天,ALDH2蛋白表达量在睾丸组织中显著增加。     

热休克蛋白与应激诱导的细胞凋亡

组织细胞在受到包括烧伤在内的外界各种因素的刺激后会发生一系列非特异性防御反应。应激反应中可产生对细胞起保护作用的应激蛋白．主要是热休克蛋白(heat shock protein．HSPs)．后者能够快速短暂调整应激过程中细胞机能．保护细胞抗损伤．并有助于细胞恢复正常结构和机能的重建．而细胞凋亡普遍存在于生物的生理、病理过程中．是     

鞘内注射钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN93对骨癌痛小鼠痛行为的影响

目的 探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在骨癌痛发病机制中的作用.方法 雄性C3H/HeN小鼠40只分为5组:假手对照Sham组(S组n=8),癌痛模型对照Control组(C组n=8)和KN93 Treat组(T1组n=8、T2组n=8、T3组n=8).C组和T组(T1、T2、T3)小鼠左侧股骨远端骨髓腔接种溶于α-MEM的NCTC 2472纤维肉瘤细胞,建立骨癌痛模型;S组小鼠骨髓腔注入不含NCTC 2472细胞的α-MEM.在术后的第14天S组和C组鞘内注射20%DMSO 5μl,T1、T2、T3组分别鞘内注射溶于20%DMSO的KN93 15 nmol/5μl、30nmol/5μl、60nmol/5μl.各组于给药前及给药后的0.5 h、2h、4h、8 h检测小鼠的自发抬足次数、机械性缩足反射阈值(PWMT)和热缩足反射潜伏期(PWTL).结果 鞘内给予KN9315 nmol对骨癌痛小鼠痛行为无影响,鞘内给予KN93 30nmol、60nmol能剂量依赖性减轻小鼠痛行为反应,给药后0.5 h 2组小鼠自发抬足次数[(7.25±1.49)次、(4.12±1.36)次]比C组[(11.62±1.92)次]降低,PWMT[(1.28±0.14)g、(1.75+0.46)g]、PWTL[(14.64±2.12)s、(16.85±1.61)s]比C组[(0.47±0.16)g、(11.32±1.68)s]升高,差异有显著性(P＜0.05).作用2h达到高峰,维持到4h左右,8 h后基本消失.结论 CaMKⅡ在骨癌痛的发病中起重要作用,鞘内注射KN93能够剂量依赖性改善骨癌痛小鼠的痛行为.     

热休克/应激蛋白与内科疾病

<正>热休克蛋白(HeatShockProteins,HSPs)又称应激蛋白(StressProteins,SPs),当高热、病原体感染、细胞因子(IL—1、IL—2等)、某些金属、乙醇、缺氧,氨基酸类似物伤害生物细胞时,激活HSPs基因,编码合成HSPs,引发应激反应。随着HSPs基础研究的深入和一些生物效应的阐明,发现它与多种内科疾病的发生发展有关,并且具有一定的诊断、治疗和预防保护作用。     

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在心力衰竭与触发性心律失常中的信号转导作用

心力衰竭的心肌细胞可发生组织重构和电重构,尤其是细胞内钙离子循环出现障碍时,引起心脏电-机械活动异常,这也是其心律失常产生的主要原因。近年来研究表明,钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ通过调节钙循环的各个环节,在心肌肥大和凋亡所致心电重构和心力衰竭的发生、发展中起着关键的信号转导作用,该文将近年来的研究进展扼要概述。     

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ δ RNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响

目的 研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ δ(Ca2+/Calmodulin dependent kinase Ⅱ δ,CaMK Ⅱ δ)RNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响,以证实其在破骨细胞分化中的作用.方法 应用慢病毒构建CaMK Ⅱ δ RNA干扰载体,并确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值及转染效率.小鼠RAW264.7细胞分为对照组、空白载体组和干扰组.转染5d后收获细胞,确定干扰效率;并检测RNA干扰对活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、非受体酪氨酸激酶(c-Src)基因表达及破骨细胞分化的影响.结果 成功构建了CaMK Ⅱ δ RNA干扰载体,最佳转染MOI值为30,转染效率可达78％ (P ＜0.05).重组病毒对CaMK Ⅱ δ的干扰效率在mRNA水平超过78％,在蛋白水平超过70％ (P＜0.01).CaMKⅡ δ RNA干扰显著降低NFATc1、TRAP和c-Src基因,与对照组、空白载体组比较,其mRNA水平下降分别超过了47.8％、43.3％和48.5％ (P ＜0.05,P＜0.01),蛋白相对水平分别超过了61.1％、48.2％和39.6％％(P＜0.01);免疫荧光细胞化学检测也得到相似结果.CaMK Ⅱ δ RNA干扰也显著降低了破骨细胞生成及骨吸收功能;与其他两组比较,干扰组破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数目和面积下降分别超过了49.8％、47.6％和61.3％ (P ＜0.01).结论 CaMKⅡδ RNA干扰可显著下调其下游NFATc1、TRAP、c-Src基因表达并抑制破骨细胞分化;CaMK Ⅱ δ在破骨细胞分化中可能发挥关键调控作用.     

慢性应激对大鼠心肌超微结构与热休克蛋白70表达的影响

目的研究慢性应激对大鼠心肌细胞的损害和动员的保护因素。方法将青年雄性Wistar大鼠随机分为对照组11只和实验组12只。实验组大鼠每笼1只喂养。实验第1～21天,接受各种不同的应激。对照组大鼠群养不给任何刺激。实验第22天杀死所有大鼠,速取心左室心尖部心肌各4块,制成电镜切片用透射电镜观察,制成免疫组化切片免疫组化法检测蛋白HSP70表达,进行图像分析。结果与对照组相比,实验组体质量明显下降[(239.17±32.18)粒,P<0.01],水平穿越格数减少[(19.12±9.76)次,P<0.01]、直立次数减少[(9.47±3.93)次,P<0.05]、修饰次数减少[(3.98±2.19)次,P<0.05],粪便粒数增多[(4.83±2.13)粒,P<0.01]、中央格停留时间增加[(5.10±2.11)s,P<0.01]。结论慢性应激可引起大鼠体质量下降及行为学改变。慢性应激可引起心肌细胞超微结构改变,慢性应激可引起心肌HSP70表达增强。     

高功率微波辐照对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响

目的 :探讨高功率微波 (HPM )辐照对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响。　方法 :健康成年SD雄性大鼠 5 0只 ,随机分为照射组和对照组。以S波段平均功率密度为 2 0mW /cm2 的HPM辐照大鼠 5min ,照后 6、2 4、4 8、72h和 5天取睾丸组织 ,应用原位末端标记技术 (TUNEL)检测各组凋亡细胞。　结果 :辐照后 6、2 4、4 8h ,大鼠睾丸生殖细胞凋亡数量明显高于对照组 (P <0 .0 1) ,呈线性上升和下降趋势 ,2 4h凋亡细胞数量最多 ,达(2 5 .4 0± 3.30 )个 /5个曲细精管。 72h和 5天与对照组间无差别 (P >0 .0 5 )。　结论 :HPM辐照大鼠 5min即可触发生精细胞的细胞凋亡数目增加 ,影响大鼠生殖功能。     

脊髓钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ-NR2B信号通路参与小鼠骨癌痛的形成

目的 探讨鞘内注射钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ( CaMKII)抑制剂KN93对骨癌痛小鼠脊髓NR2B蛋白表达的影响及机制.方法 SPF级雄性C3 H/HeJ小鼠36只,采用随机数字表法分为3组:假手术组(S组n=8)、骨癌痛组(BP组n=8)和KN93组(K组n=20).BP组和K组采用股骨远端骨髓腔注射20μl含NCTC 2472纤维肉瘤细胞的α-MEM的方法制备骨癌痛模型,S组骨髓腔注入不含NCTC 2472细胞的同体积α-MEM.K组于接种肿瘤细胞后14d鞘内注射溶于20％ DMSO的KN93 60 nmol/5μl,BP组和S组鞘内注射20％ DMSO 5μl.分别于肿瘤细胞接种前1d、鞘内注射KN93或溶媒前1 h、注射后1,2,4,24h(T0～5)时各组随机取8只小鼠,采用von Frev丝测定机械痛阈,并于各时点随机取3只小鼠处死取脊髓L3～5节段,采用Western blot法测定NR2B蛋白的表达.结果 与S组[机械痛阈(1.78 ±0.31)g、NR2B(0.33 ±0.04)]相比,除K组T3时机械痛阈差异无统计学意义(P＞0.05)外,BP组[(0.50±0.11)g]和K组[ (0.52 ±0.10)g]机械痛阈均降低(P＜0.05),BP组(1.78±0 34)和K组T2～5[分别为(1.11±0.14)、(0.73±0.03)、(1.11±0 15)、(1.89±0.32)]脊髓组织NR2B蛋白表达均上调(P＜0.05);与BP组相比,K组T2～4机械痛阈升高,NR2B蛋白表达下调;与给药前T1相比,除K组T2～4机械痛阈升高外,各组各时点该指标差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 鞘内注射KN93缓解小鼠骨癌痛的同时降低小鼠脊髓NR2B蛋白表达,CaMKII-NR2B信号通路可能参与了骨癌痛的形成.     

尼莫地平对癫痫大鼠海马Ca2+浓度及Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα表达的影响

目的 探讨尼莫地平( nimodipin,NIM)对戊四氮( pentylenetetrazol,PTZ) 点燃癫痫大鼠空间学习记忆能力及海马细胞内游离 Ca2+浓度([Ca2+]I)、ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα(calcium / calmodulin-dependent protein kinase Ⅱa,CaMKⅡα 蛋白表达的影响.方法 将动物分为正常对照组、PTZ 组和 NIM + PTZ组,采用 PTZ 慢性点燃癫痫模型,应用 Mor-ris 水迷宫观察各组大鼠空间学习记忆能力,运用流式细胞仪检测海马细胞内[Ca2+]I变化,Western blot方法测定 CaMKⅡα蛋白的表达.结果 PTZ 组大鼠空间学习记忆能力受损,其海马细胞内[Ca2+]I明显升高(P<0.05),CaMKⅡα蛋白水平较正常对照组减少(P<0.05);与 PTZ 组比较,NIM + PTZ 组大鼠空间学习记忆能力好转,其海马细胞内[Ca2+]I;下降(P<0.05),CaMKⅡα蛋白水平升高(P<0.05).结论 PTZ 点燃癫痫大鼠海马存在钙超载及CaMKⅡα的表达异常,由此引起大鼠空间学习记忆能力受损;NIM 可以降低细胞内[Ca2+]I;,提高 CaMKⅡα的表达,改善癫痫大鼠的学习记忆能力.     

热应激对心血管系统的影响

在热环境下,过度的热应激会对心血管系统造成一定的影响.但是,适度的预热应激处理可以使机体产生热休克蛋白,从而对心血管系统产生一定的影响.本文就热应激对心血管系统产生的影响,作一概述.     

孕鼠双酚A染毒对雄性子鼠睾丸结构及MnSOD-SIRT3蛋白表达的影响

目的 探讨孕鼠双酚A(BPA)染毒对雄性子鼠睾丸结构及MnSOD-SIRT3蛋白表达的影响。方法 将ICR孕鼠随机分成4组,自受孕第一天始,用溶剂对照组、BPA低剂量(10 nmol/L)组、BPA中剂量(50 nmol/L)组、BPA高剂量(300 nmol/L)组,饮水染毒,待子鼠出生后第6周,处死雄性子鼠,取睾丸组织,HE染色、电镜观察染毒后子鼠睾丸结构改变,Hoechst染色观察细胞凋亡,Western blot法检测睾丸组织MnSOD、SIRT3蛋白的表达。结果 与溶剂对照组比较,HE染色显示,染毒组睾丸组织的形态有损伤,且中、高剂量组较为严重;电镜显示,中、高剂量组的间质细胞、精原细胞、支持细胞均有损伤;Hoechst 33258染色显示:染毒组较对照组睾丸组织内各细胞凋亡明显;Western blot检测显示:随染毒剂量增加,睾丸组织MnSOD、SIRT3蛋白表达呈下降趋势。结论 BPA可影响睾丸组织学结构,诱导生精细胞和间质细胞的凋亡,其机制可能与降低睾丸组织中MnSOD和SIRT3表达有关。     

慢性应激对大鼠心肌超微结构与热休克蛋白70表达的影响

目的研究慢性应激对大鼠心肌细胞的损害和动员的保护因素.方法将青年雄性Wistar大鼠随机分为对照组11只和实验组12只.实验组大鼠每笼1只喂养.实验第1～21天,接受各种不同的应激.对照组大鼠群养不给任何刺激.实验第22天杀死所有大鼠,速取心左室心尖部心肌各4块,制成电镜切片用透射电镜观察,制成免疫组化切片免疫组化法检测蛋白HSP70表达,进行图像分析.结果与对照组相比,实验组体质量明显下降[(239.17±32.18)粒,P＜0.01],水平穿越格数减少[(19.12±9.76)次,P＜0.01]、直立次数减少[(9.47±3.93)次,P＜0.05]、修饰次数减少[(3.98±2.19)次,P＜0.05],粪便粒数增多[(4.83±2.13)粒,P＜0.01]、中央格停留时间增加[(5.10±2.11)s,P＜0.01].结论慢性应激可引起大鼠体质量下降及行为学改变.慢性应激可引起心肌细胞超微结构改变,慢性应激可引起心肌HSP70表达增强.