人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞

目的:探讨以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的方法.方法:以鼠间充质干细胞作为饲养层,收集受孕3.5～4 d昆明小鼠的囊胚和桑椹胚进行培养,筛选纯化细胞集落,使其稳定传代后,采用光镜,碱性磷酸酶染色及Oct-4染色对其形态学和生物学性状进行初步鉴定.结果:以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养的昆明小鼠ES有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES细胞碱性磷酸酶进行检测,末分化的Es细胞显微镜下为黄褐色,分化的不着色;Oct-4染色阳性.结论:以间充质下细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞可行,得到的胚胎干细胞能保持特殊的形态和未分化状态.     

人成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的支持作用

目的观察人成纤维细胞对人胚胎干细胞（hESC）生长的支持作用，建立完全非动物源性培养系统。方法采用人包皮成纤维细胞为饲养层，以血清替代品取代动物血清，支持人胚胎干细胞生长，观察其增殖和分化情况。结果包皮成纤维细胞能很好地支持人胚胎干细胞生长增殖，并保持87％左右未分化表型：碱性磷酸酶（AKP）染色强阳性，阶段特异性胚胎抗原3（SSEA-3），肿瘤排斥抗原160（TRA-1-60）表达强阳性，可见转录因子OCT-4mRNA表达。核型正常，体外能形成拟胚体。结论人成纤维细胞完全可以支持人胚胎干细胞增殖，可望为胚胎干细胞定向诱导分化应用于临床打下基础。     

两种培养条件下人胚胎干细胞生长状况的比较

目的:比较胚胎干细胞株在两种不同培养体系下生长状况,验证两种不同培养体系对于人胚胎干细胞全能性的维持与延续.方法:将人类胚胎干细胞株分别接种于传统的培养体系以及mTESR1的培养体系,观察在不同培养体系下人类胚胎干细胞状态及克隆形态之间的差别.对生长于不同培养体系下的胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色以及用RT-PCR的方法检测人胚胎干细胞全能性.结果:生长在传统培养体系中的胚胎干细胞,细胞克隆薄且扁平,与周围的饲养层细胞边界清晰,克隆中心的细胞容易出现分化.单个胚胎干细胞核质比高,核仁明显.生长mTESR1体系中的胚胎干细胞,细胞克隆较传统培养体系下的大,呈单层细胞生长,细胞排列紧密,单个胚胎干细胞的细胞核大,核仁明显,核质比高.生长在不同培养体系下的人胚胎干细胞碱性磷酸酶染色均呈现阳性,免疫荧光染色及RT-PCR均验证了细胞的全能性.结论:两种不同培养体系均能维持胚胎干细胞的全能性.mTESR1培养条件更加简便,能更清楚观察与分析单个细胞的形态,适合人胚胎干细胞的维持培养.     

不同滋养层对维持人胚胎干细胞的生长作用

目的 比较不同滋养层对保持连续传代培养的人胚胎干细胞(hESC)不分化和高增殖能力作用的差异.方法 分别用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人包皮成纤维细胞(hFF)、人骨髓间充质细胞(hMSC)作为滋养层培养hESC系H9细胞,采用碱性磷酸酶染色和台盼蓝染色观察不同滋养层支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率,并采用免疫荧光染色对传代5代以后的hESC进行生物学鉴定.结果 3种滋养层细胞均可维持hESC呈克隆样生长,但是不同滋养层支持的克隆的形态差异大.3种滋养层细胞支持的hESC的大鼠抗阶段特异性胚胎抗原-3及碱性磷酸酶染色均呈阳性.MEF支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率均显著高于人来源滋养层(均P<0.01).hMSC支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量均显著高于hFF的hESC(均P<0.01).结论 3种滋养层细胞均可支持hESC的正常生长.MEF最有利于hESC的增殖,但是两种人来源滋养层细胞为去除动物源性的hESC培养体系奠定了基础.在维持hESC增殖方面,hMSC优于hFF.     

脐带组织间充质干细胞分离及向成骨与脂肪细胞的分化

目的探讨人脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞诱导分化的方法与条件。方法取脐带沿血管长轴切开,去掉血管,再将脐带重新缝合形成环状,灌入胶原酶悬液,6～8h后灌洗离心,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,取传代细胞进一步行免疫表型测定和成骨、成脂肪细胞诱导分化。结果去除血管后获取脐带组织细胞的方法,可获得贴壁生长的细胞,呈短棒状或梭形样细胞,易扩增和形成集落,有基质细胞免疫表型表达,成骨诱导分化的细胞茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,碱性磷酸酶钙钴法染色胞质呈灰黑色,阳性细胞百分率>85%;成脂肪分化的细胞油红染色示胞浆充满了油滴空泡。结论脐带组织存在具有间叶细胞分化能力的间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,传代细胞表达基质细胞表面抗原,能够向成骨细胞、成脂肪细胞分化。     

人脐带间充质干细胞生物学特性及向成骨细胞分化的研究

目的:体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞(WJ～MSCs),观察其生物学特性并研究其定向分化成成骨细胞的能力。方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小段,剥离血管后酶解,释放细胞贴壁生长,倒置显微镜观察细胞形态,绘制第3代生长曲线;流式细胞仪测定细胞表面标记(CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14和HLA～DR);化学染色检测其体外诱导成骨分化的能力。结果:原代人脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维样形态;流式细胞仪检测培养细胞间充质干细胞的表面标志CD105、CD73和CD90阳性表达,但不表达造血细胞的表面标志CD34、CD45、CD14及HLA-DR阴性表达,HLA-ABC低表达。体外诱导实验证实,该细胞具有成骨分化能力。结论:WJ-MSCs体外诱导成骨能力确切,具有类似骨髓间充质干细胞的特异性表面标记,且具有同种异体移植的低免疫原性。     

一种新的培养人胚胎干细胞的包被基质

目的 开发一种新的培养人胚胎干细胞（hESCs）的包被基质,使hESCs的培养更加简便.方法 用甲醇固定的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为包被基质,人胚胎干细胞系X-01在该基质上生长,每隔5～6 d传代一次,培养10代后,对人胚胎干细胞特性进行检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达和分化能力.结果 hESCs在新的基质上生长良好,经10次传代后仍能保持典型的hESCs克隆形态.碱性磷酸酶染色阳性,免疫荧光染色 Oct4、SSEA4、Tra-1-60 为阳性,体外分化可形成拟胚体.结论 此种固定的基质可以大量制备,长期保存,并可以长期维持hESCs的未分化状态,为人胚胎干细胞的体外扩增探索出了一个新的途径.     

人胚胎干细胞体外培养及特性分析

目的探讨人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)的体外培养及其特性。方法 hESCs接种于饲养层细胞,培养液为含20%Knockout SR的Knockout DMEM,其中添加10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),通过观察细胞形态、免疫细胞化学技术分析hESCs表面标志分子SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1和TRA-1-60的表达,鉴定hESCs的未分化状态;G显带技术分析细胞染色体核型。同时,通过分析hESCs体外形成胚胎体、体内生成畸胎瘤的情况,鉴定hESCs的分化潜能。结果 hESCs在饲养层细胞上呈克隆生长,细胞为二倍体核型。hESCs表达SSEA-3、SSEA-4、以及TRA-1-60细胞表面特征性标志。体内、外分化实验证实hESCs具备多分化潜能。结论 hESCs在体外培养条件下能够保持未分化状态和发育的全能性,为进一步探索hESCs的诱导分化,以及hESCs的应用研究提供可行性保证。     

人类脐带血MSC和骨髓MSC分泌细胞因子的对比研究

目的比较人类脐带血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞支持造血干细胞分泌生长因子的能力。方法应用EUSA方法,测定两种细胞分泌的干细胞生长因子（Stem cell factor,SCF）,血小板生成素（Thrombopoietin,TPO）和白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）的浓度,并且进行对比。结果人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可分泌TPO、SCF和IL-6等支持造血生长因子。但是相同生长条件下,两种细胞分泌的因子浓度不同。人脐血基质细胞分泌SCF的量（575．7±40．2pg／ml）高于骨髓基质细胞（482．2±17．7pg／ml）,而人脐血基质细胞分泌IL-6（469．7±27．2pg／m1）的量（低于同期培养的骨髓基质细胞（935．19±35．4pg／ml）,人脐血基质细胞TPO分泌的量（195．5±7．3pg/ml）与骨髓基质细胞（172．2±9．3pg/ml）相近。结论人脐血基质细胞与骨髓基质细胞都具有分泌支持造血生长因子的能力,但是分泌量之间有差异。     

Very small embryonic like（VSEL） stem cells

It is generally accepted that adult bone marrow(BM) contains both hematopoietic stem cells(HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs). Recently, a rare population of stem cells different from HSCs and MSCs were identified in murine BM and human cord blood (CB), named as very small embryonic like(VSEL) stem cells. These cells are tiny round and CXCR4 Sca-1 Lin- CD45-, expressing SSEA-1/4, Oct-4 and Nanog, which have potent of differentiation into all three germ-layer lineages, such as cardiomyocytes, neural and pancreatic cells.     

脐带间充质干细胞无血清培养的实验研究

目的建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）的方法。方法利用酶消化法分离hUCMSCs,在无血清干细胞培养体系下培养扩增,进行形态学观察,CCK-8法分析细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期,进行成骨、成脂诱导分化。结果hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态,具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs,该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态,可用于各种治疗的临床试验。     

脐带间充质干细胞联合HLA单倍型相合造血干细胞治疗重型再生障碍性贫血的临床观察

目的 观察人脐带间充质干细胞(HUC-MSC)在联合人类白细胞抗原(HLA)单倍型相合移植治疗重型再生障碍性贫血的疗效和安全性.方法 对8例重型再生障碍性贫血患者进行HUC-MSC联合HLA单倍型相合移植治疗,观察移植疗效及相关并发症.结果 所有患者均重建供者造血,中性粒细胞大于0.5×109/L和血小板大于20×109/L的恢复中位时间分别为12.1 d和15.2 d.8例患者均出现粒细胞缺乏症伴感染,1例(12.5%)发生急性移植物抗宿主病(aGVHD),予甲泼尼松龙和布地奈德后治疗控制.巨细胞病毒(CMV)感染1例,无1 例发生肝静脉闭塞病(VOD).结论 HUC-MSC联合HLA单倍型相合移植治疗重型再生障碍性贫血安全有效,可加快造血重建.     

当归对人脐血间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨当归对人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及当归诱导后脐血间充质干细胞nestin变化情况。方法:无菌条件下收集新生儿脐血,以Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法分离单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)。分离获得的MNCs采用DMEM/F12培养基/10%胎牛血清进行MNCs培养传代。向培养基内加入1μl/ml当归注射液,分为两组,阳性对照组为加当归注射液,阴性对照组不加当归注射液,进行台盼兰染色活细胞计数,以平均数为结果分别绘制两组的细胞生长曲线。对人脐血间充质干细胞进行神经标志物nestin的免疫组化检查。结果:阳性对照组脐血MSCs细胞生长曲线比阴性对照组高,在体外应用当归诱导后表达nestin。结论:当归注射液有促进脐血MSCs分化增值的作用,脐血MSC具有较强的可朔性,当归在体外使脐血间充质干细胞nestin表达增高。     

组织块法分离人脐带间充质干细胞的研究

目的：应用组织块法分离人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）并对其生物学特性进行研究。同时探讨在不同储存条件下的脐带是否对组织块法的分离成功率产生影响。方法：无菌条件下采集足月儿的脐带,应用组织块法分离hUC-MSCs,通过流式细胞术观察其免疫学、生长特性。脐带在常温条件和冷冻条件下储存后进行组织块法分离,观察细胞生长情况。结果：应用组织块法能获得贴壁生长的hUC-MSCs,流式细胞仪分析结果显示细胞高表达常见MSC表面分子CD105、CD73及HLA-ABC;低表达造血细胞表面标记CD34、CD45及HLA-DR。常温储存条件下,随着处理时间的延长,获得原代细胞数量下降;组织冷冻后可以获得hUC-MSCs。结论：组织块分离法可以获得贴壁生长的hUC-MSCs,并成功传代扩增;脐带采集后24 h内处理,hUC-MSCs获得数量及分离成功率高;随着处理时间延长,hUC-MSCs获得数量减少,分离成功率降低。     

人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用

 目的 为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞( human embryonic stem cell, hESc)体外培养系统，本实验欲用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts, hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法 利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞，纯化增殖细胞，采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc（HS181细胞株）接种在该饲养层上，连续传代至20代，倒置显微镜观察其形态学变化，测定其细胞碱性磷酸酶活性，类胚体形成实验及干细胞转录因子表达，严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice, SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。 结果 hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛，连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖，24h内能较好地保持细胞活力和形态学特征，具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代任能较好地保持未分化状态，细胞呈克隆性生长，高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子；悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体（Embryoid bodies, EB）结构, 可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达，证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞，说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示：将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论 hPFF可作为一种来源丰富，取材方便的人源化饲养层细胞，能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险，初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用

目的探讨人胎盘源问充质干细胞（PMSCs）对脐血单个核细胞（MNCs）体外生长的支持作用。方法将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁培养获得人PMSCs，用流式细胞仪检测细胞表面标志。以密度梯度离心法分离脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养，通过细胞计数和流式细胞仪分别检测细胞的生长情况。结果从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs，经流式细胞仪检测其表型为CD29^＋,CD44^＋,CD105^＋、CD106^＋、CD166^＋、CD34^-,CD45^-、HLA—DR^-。人PMSCs＋脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45^＋细胞数在各培养时间点均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。在培养第7天，CD45^＋、CD14^＋及CD19^＋细胞数共培养组也明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。     

不同浓度EGF对人脐血间充质干细胞增殖的研究

目的探索不同浓度表皮生长因子（EGF）对人脐血间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）增殖的影响。方法无菌条件下来集正常人脐血，密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，用Mesencult培养基进行纯化和扩增培养，通过MTT法检测不同浓度的EGF的促人脐血MSCs增殖作用。结果EGF的5—100ng／ml各浓度组增殖效应均明显大于对照组（P〈0．05），10ng／ml组明显大于其它各浓度组（P〈0．01）。结论EGF对体外培养的人脐血MSCs有促进增殖的作用，此作用呈剂量依赖性。