ITP患者骨髓间质干细胞体外对CD4(+)CD25(+)Treg细胞增殖的影响

目的:体外研究免疫性血小板减少症(ITP)患者骨髓间质干细胞(MSCs)对CD4(+)CD25(+)Treg细胞的影响。方法:采用Ficoll分离ITP患者及健康对照者骨髓单个核细胞,通过体外培养,扩增出MSCs。通过Ficoll分离法和尼龙棉柱法获取ITP患者外周血T淋巴细胞,ITP患者MSCs经丝裂霉素C处理后按不同数量(1×103、1×104、1×105个细胞/孔)(A1、A2、A3组)接种培养板作为基底层细胞;健康对照者MSCs经丝裂霉素C处理后按不同数量(1×103、1×104、1×105个细胞/孔)(B1、B2、B3组)接种培养板作为基底层细胞;然后分别以2×105个细胞/孔接种体外分离纯化的ITP患者T淋巴细胞,设立空白组C组(ITP患者T淋巴细胞单独培养)。培养第3天各自收集T淋巴细胞,用流式细胞术检测各组CD4(+)CD25(+)Treg细胞比例。结果:在血凝素作用下,实验组及对照组各浓度亚组CD4(+)CD25(+)Treg细胞数量均较空白组明显减少(P0.05);A2组较B2组CD4(+)CD25(+)Treg细胞数量显著减少(P0.05),A3组较A2、B3组CD4(+)CD25(+)Treg细胞数量明显减少(P0.05)。结论:ITP患者可能存在MSCs质或量的改变,导致免疫调节功能异常,对CD4(+)CD25(+)Treg细胞增殖抑制作用明显加强,CD4(+)CD25(+)Treg细胞的不足引起外周免疫耐受减弱,MSCs的免疫调节功能异常可能在ITP发病过程中起重要作用。     

黄芪注射液对慢性阻塞性肺疾病患者外周血Th17/Treg细胞平衡的影响及意义

目的探讨黄芪注射液干预前后慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血Th17细胞、Treg细胞占CD4+T细胞的比例及白介素-10(IL-10)的表达水平,及黄芪注射液对其的作用。方法收集COPD急性加重期(A组)、稳定期(B组)、肺功能正常吸烟者(C组)及肺功能正常非吸烟者(D组)各20例,分别抽取患者空腹静脉血制备单个核细胞悬液(PBMC),分为空白组和黄芪组,应用流式细胞术检测各组黄芪注射液干预前后Th17细胞、Treg细胞占CD4+T细胞的比例及IL-10的表达水平。结果CD4+Th17细胞的比例:空白组均高于黄芪组(P0.05),空白组:A组(2.87±0.90)%高于B组(2.07±0.76)%、C组(1.20±0.42)%、D组(1.02±0.30)%,B组高于C、D组,C组和D组相比差异无统计学意义(P0.05);黄芪组:A组(1.51±0.93)%高于B组(0.94±0.65)%、C组(0.75±0.45)%、D组(0.68±0.37)%(P0.05),B、C、D组组间两两比较差异无统计学意义(P0.05);CD4+Treg细胞的比例:黄芪组均高于空白组(P0.05),在黄芪组,D组(8.04±2.65)%高于A组(4.76±1.43)%、B组(5.89±1.93)%、C组(6.50±2.2)%(P0.05),B组和C组相比差异无统计学意义,C组高于A组(P0.05);在空白组,D组(6.29±3.24)%高于A组(2.42±1.45)%、B组(4.13±1.83)%、C组(4.41±2.67)%(P0.05),B组和C组相比差异无统计学意义,C组高于A组(P0.05);外周血IL-10水平:黄芪组均高于空白组(P0.05),黄芪组:D组(7.25±1.32)%高于A组(4.76±1.31)%、B组(6.32±1.75)%、C组(6.02±1.39)%(P0.05),B组和C组相比差异无统计学意义,C组高于A组(P0.05);空白组:D组(5.21±1.07)%高于A组(2.96±1.25)%、B组(4.00±0.81)%、C组(4.31±0.90)%(P0.05),B组和C组相比差异无统计学意义,C组高于A组(P0.05);Th17/Treg细胞的比值:空白组均高于黄芪组(P0.05),黄芪组:A组(0.34±0.21)%均高于B组(0.17±0.13)%、C组(0.14±0.10)%、D组(0.11±0.07)%(P0.05);空白组,A组(4.27±7.77)%均高于B(0.60±0.33)%、C(0.31±0.19)%、D组(0.21±0.13)%(P0.05)。结论 Th17/Treg比值升高,平衡失调,可能是COPD发病的免疫机制;黄芪注射液在一定程度上能调节Th17/Treg比例失衡,对COPD的治疗可能有一定的疗效。     

弓形虫排泄分泌抗原对Lewis肺癌小鼠瘤体生长的抑制作用

目的　探讨弓形虫排泄分泌抗原（ESA）对Lewis肺癌小鼠CD4+CD25+ Foxp3+ T（Treg）细胞亚群的影响,观察弓形虫ESA对肿瘤生长的抑制作用。方法　将C57BL/6小鼠随机分成PBS组（14只）和Lewis组（34只）。Lewis组小鼠右腋窝皮下接种Lewis肺癌细胞2 × 105个,PBS组注射等量无菌PBS。接种后第7 天（D7）,将PBS组小鼠分成PBS2组、PBS2 + ESA组,每组7只;将Lewis组分成Lewis2组和Lewis2 + ESA组,每组17只; PBS2 + ESA组及Lewis2 + ESA组小鼠腹腔注射100 μL弓形虫 ESA。ESA干预后7 d计算各组小鼠脾脏系数,检测Treg细胞数量变化,同时观察荷瘤鼠长期瘤体生长情况。结果　ESA干预后7 d,PBS2 + ESA组[（0.66 ± 0.09）%]和Lewis2 + ESA组[（0.69 ± 0.07）%]脾脏明显增大,脾脏系数与PBS2组[（0.30 ± 0.02）%]和Lewis2组[（0.33 ± 0.03）%]比较,差异均有统计学意义（P 均 < 0.05）。PBS2 + ESA组[（1.28 ± 0.14）%]和Lewis2 + ESA组[（1.58 ± 0.14）%]脾脏Treg细胞占脾细胞的比例均下降,与PBS2组[（2.06 ± 0.07）%]和Lewis2组[（2.44 ± 0.23）%]比较差异均有统计学意义（P 均< 0.05）。ESA干预后,瘤体生长延缓,在实验终点时,Lewis2 + ESA组小鼠瘤体明显小于Lewis2组（P < 0.05）。结论　ESA可下调荷瘤鼠脾脏Treg细胞占脾细胞的比例,抑制瘤体生长。     

弓形虫排泄分泌抗原对Lewis肺癌小鼠瘤体生长的抑制作用

目的　探讨弓形虫排泄分泌抗原（ESA）对Lewis肺癌小鼠CD4+CD25+ Foxp3+ T（Treg）细胞亚群的影响，观察弓形虫ESA对肿瘤生长的抑制作用。方法　将C57BL/6小鼠随机分成PBS组（14只）和Lewis组（34只）。Lewis组小鼠右腋窝皮下接种Lewis肺癌细胞2 × 105个，PBS组注射等量无菌PBS。接种后第7 天（D7），将PBS组小鼠分成PBS2组、PBS2 + ESA组，每组7只；将Lewis组分成Lewis2组和Lewis2 + ESA组，每组17只； PBS2 + ESA组及Lewis2 + ESA组小鼠腹腔注射100 μL弓形虫 ESA。ESA干预后7 d计算各组小鼠脾脏系数，检测Treg细胞数量变化，同时观察荷瘤鼠长期瘤体生长情况。结果　ESA干预后7 d，PBS2 + ESA组[（0.66 ± 0.09）%]和Lewis2 + ESA组[（0.69 ± 0.07）%]脾脏明显增大，脾脏系数与PBS2组[（0.30 ± 0.02）%]和Lewis2组[（0.33 ± 0.03）%]比较，差异均有统计学意义（P 均 < 0.05）。PBS2 + ESA组[（1.28 ± 0.14）%]和Lewis2 + ESA组[（1.58 ± 0.14）%]脾脏Treg细胞占脾细胞的比例均下降，与PBS2组[（2.06 ± 0.07）%]和Lewis2组[（2.44 ± 0.23）%]比较差异均有统计学意义（P 均< 0.05）。ESA干预后，瘤体生长延缓，在实验终点时，Lewis2 + ESA组小鼠瘤体明显小于Lewis2组（P < 0.05）。结论　ESA可下调荷瘤鼠脾脏Treg细胞占脾细胞的比例，抑制瘤体生长。     

2型糖尿病合并感染老年患者机体免疫功能变化

目的探讨2型糖尿病合并感染患者机体免疫功能变化。方法 2型糖尿病患者150例、非糖尿病感染患者75例和体检中心健康者75例分为A组(糖尿病合并感染78例)、B组(糖尿病未合并感染72例)、C组(非糖尿病感染)和D组(健康对照)。观察各组血C3、C4、Ig M、Ig A、Ig G水平和血CD8+、CD4+、CD3+、自然杀伤(NK)细胞和B细胞水平。结果与D组比较,A组、B组和C组C3和C4水平均显著升高(P0.05);与B组和C组比较,A组C3和C4水平均显著升高(P0.05)。与D组比较,A组、B组和C组Ig A水平均显著升高(P0.05);与B组和C组比较,A组Ig A水平显著升高(P0.05);与C组和D组比较,A组、B组Ig G水平显著降低(P0.05)。与D组比较,A组、B组和C组CD4+、CD3+和CD4+/CD8+均显著下降(P0.05);与B组和C组比较,A组CD4+和CD4+/CD8+均显著下降(P0.05)。与D组比较,A组、B组和C组NK细胞和B细胞水平均显著下降(P0.05);与B组和C组比较,A组NK细胞和B细胞水平均显著下降(P0.05)。结论 2型糖尿病患者体内存在体液免疫和细胞免疫异常,其中2型糖尿病合并感染者体内体液免疫和细胞免疫异常更加严重。     

弓形虫排泄分泌抗原对B16F10黑素瘤小鼠CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞和NK细胞的影响

目的探讨弓形虫排泄分泌抗原（ESA）对B16F10黑素瘤小鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞和NK细胞数量和功能的影响,观察ESA对肿瘤生长的作用。方法将传代培养的B16F10黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右腋窝皮下,建立荷瘤动物模型。采用ESA腹腔注射进行干预,将实验小鼠分为4组：PBS组、B16F10组、PBS＋ESA组、B16F10＋ESA组,分别于ESA干预后2、4、6d取脾,流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞和NK细胞占脾细胞的比例;WST-8法检测各组小鼠CD4＋CD25＋T细胞对CD4＋CD25-T细胞增殖的抑制功能;LDH法检测NK细胞杀伤B16F10功能;观测荷瘤鼠肿瘤体积动态变化。结果 ESA干预4、6d后,荷瘤鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞占脾细胞的比例分别为（1.65±0.18）%和（1.56±0.17）%,与荷瘤对照组[分别为（2.47±0.10）%和（2.82±0.12）%]比较差异均有统计学意义（P均〈0.05）;ESA干预可使CD4＋CD25＋T细胞对CD4＋CD25-T细胞的抑制功能下降。抑制作用以干预后4、6d较明显,抑制率分别为50.03%和50.00%,低于荷瘤对照组的75.03%和78.14%（P均〈0.05）;荷瘤鼠脾脏NK细胞占脾细胞的比例[（3.58±0.07）%]在ESA干预后6d显著高于荷瘤对照组的（2.61±0.13）%（P〈0.05）。同时NK细胞杀伤B16F10细胞功能也增强,不同效靶细胞比（5∶1、10∶1、20∶1）下分别为26.51%、35.25%、60.19%,明显高于荷瘤对照组的16.81%、24.63%、45.62%（P均〈0.05）;ESA干预后,瘤体出现延缓生长,平均出瘤时间较对照组延迟6d,实验终点荷瘤第35天ESA干预组瘤体体积[（6208.34±443.64）mm3]明显小于荷瘤对照组[（9027.46±1362.01）mm3]（P〈0.05）。结论弓形虫ESA可通过下调荷瘤鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞比例并抑制其功能和上调NK细胞比例并增强其杀伤功能,发挥抗肿瘤作用。     

CD4~+ CD25~+调节性T细胞对慢性淋巴细胞白血病预后的影响

目的:探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)表达及其与预后的相关性。方法:采用流式细胞仪检测50例健康者(对照组)及30例CLL患者(CLL组)治疗前后CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg水平。结果:初诊CLL组患者外周血T淋巴细胞数量、CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg水平均显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。治疗后,CLL组患者外周血T淋巴细胞数量、CD4+CD25+Foxp3+Treg水平显著降低,与初诊时比较差异有统计学意义(P0.05),但仍高于对照组(P0.05)。CLL患者中,Binet临床分期A期患者CD4+CD25+Foxp3+Treg水平显著低于B/C期患者,差异有统计学意义(P0.05)。Spearman相关分析结果显示,Binet临床分期与CD4+CD25+Foxp3+Treg水平呈正相关(r=0.511,P0.05)。结论:CD4+CD25+Foxp3+Treg水平可能是评估CLL患者预后的有效指标。     

斯氏艾美球虫可溶性蛋白对小鼠结肠癌皮下肿瘤模型的影响

目的探讨斯氏艾美球虫(Eimeria stiedai)可溶性蛋白(EsSP)对荷瘤小鼠肿瘤生长、生存率和免疫状态的影响。方法建立小鼠皮下结肠癌(CT26)肿瘤模型,确定最小100%致瘤量肿瘤细胞数。取10~8个斯氏艾美球虫孢子化卵囊,采用超声波间断乳化制备EsSP。105只雄性BALB/c小鼠按随机数表法均分为7组(15只/组),每组小鼠于右侧腋窝皮下接种CT26细胞5×10~5个,其中6个实验组(A~F组)小鼠分别腹腔注射100.00、50.00、10.00、1.00、0.10、0.01μg/d EsSP,1次/d×5 d,对照组腹腔注射等量PBS。于接种后第7、11、13、15、17、19、21、23天测量肿瘤直径,计算相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率(T/C)。接种后第25天每组各处死5只小鼠,称量瘤重,计算抑瘤率。采眼球血,分离小鼠外周血淋巴细胞,MTS比色法检测EsSP对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖能力的影响,计算刺激指数(SI);流式细胞术检测外周血CD4~+/CD8~+T淋巴细胞比值变化。记录各组荷瘤小鼠死亡时间和死亡数量,共观察80 d。各组间差异性比较采用单因素方差分析。结果最小100%致瘤量肿瘤细胞数为5×10~5个。接种结肠癌细胞后第23天,A、B、C组的肿瘤体积为(435.2±41.1)、(366.3±29.2)、(460.2±28.5)mm~3,较E、F和对照组的(761.2±33.2)、(810.4±38.4)、(865.2±35.3)mm~3生长缓慢(P0.05);A、B、C组的T/C分别为(39.0±6.7)%、(33.3±8.9)%、(35.0±8.1)%,均40%。B组小鼠瘤重为(1.109±0.432)g,低于对照组的(1.946±0.289)g(P0.05),抑瘤率最高,为(43.0±14.6)%。MTS比色法检测结果显示,B、C组小鼠SI分别为1.75±0.15、1.70±0.32,高于对照组的1.38±0.18(P0.05)。流式细胞术检测结果显示,A、B、C组小鼠外周血中CD4~+/CD8~+T淋巴细胞亚群的比值分别为1.58±0.24、1.74±0.22、1.61±0.16,与对照组的1.34±0.15比较,差异均有统计学意义(P0.01或P0.05)。荷瘤小鼠生存率结果显示,至第80天,B、C组各存活5只小鼠,高于对照组的2只(P0.05)。结论 EsSP能够抑制结肠癌皮下肿瘤的生长,提高荷瘤小鼠生存率,改变肿瘤诱导的免疫抑制状态,增强小鼠抗肿瘤免疫反应。     

CD+4CD+25 T淋巴细胞对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响及作用机制

目的探讨CD+4 CD+25 T淋巴细胞(Treg细胞)对支气管哮喘(简称哮喘)小鼠气道炎症的影响及作用机制.方法 60只小鼠按随机数字表法分为3组,每组20只.哮喘组(A组)小鼠于第1、13天以鸡卵白蛋白(OVA)0.1 ml腹腔注射致敏,第21～29天雾化吸入2% OVA生理盐水溶液10 ml激发 30 min后建立小鼠哮喘模型.生理盐水对照组(B组)以生理盐水10 ml替代OVA处理.去除T淋巴细胞哮喘组(C组)去除小鼠体内CD+25 T淋巴细胞后再按A组方法复制小鼠哮喘模型(用药剂量和方法同A组).分离A、B、C 3组小鼠脾脏淋巴细胞,用流式细胞仪(FACS)检测Treg细胞数量,计算其占CD+4 T淋巴细胞的百分比;分离CD+4 T淋巴细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子β1(TGF-β1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原4 mRNA(CTLA-4 mRNA)的表达;同时对肺组织行苏木精-伊红 (HE)染色,观察小鼠肺组织的炎症改变. 结果经过OVA反复激发,A组小鼠脾脏Treg细胞占CD+4 T淋巴细胞的百分比为(3.10±0.03)%,B组为(9.60±0.04)%,A、B两组间及C组分别与A、B组比较差异均有统计学意义(P均<0.01); IL-10、TGF-β1和CTLA-4 mRNA的表达A组分别为0.250±0.040、0.29±0.03、0.28±0.06, B组分别为0.480±0.080、0.47±0.05、0.50±0.03、C组分别为0.080±0.020、0.11±0.04、0.12±0.05,A、B两组及C组分别与A、B组比较差异均有统计学意义(P均<0.01).与B组比较,A组肺部以嗜酸粒细胞浸润为主要表现的炎症改变明显增强,C组则较A、B组显著增强.结论 Treg细胞的数量减少和(或)功能障碍可能是哮喘气道炎症发生发展的重要机制.     

甲醛固定的H22细胞联合IL-2抑制小鼠H22肝癌生长效果观察

目的 观察甲醛固定的H22肿瘤细胞联合IL-2对小鼠H22肝癌细胞腹部移植瘤生长的影响.方法 20只小鼠,均采用股部皮下1×105个H22细胞的方法建立小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型.将其随机分为A、B、C、D组,各5只.肿瘤直径超过1 cm后A、B、C、D组分别瘤内注射生理盐水、甲醛固定H22细胞、IL-2、甲醛固定H22细胞+IL-2各0.5 mL.H22细胞浓度为106/mL,IL-2浓度为8×103 IU/mL.每3d注射1次,共注射4次.治疗结束处死动物,取瘤称重,并计算抑瘤率.采用免疫组化SABC法对肿瘤组织染色,光景下观察瘤内CD8+T淋巴细胞表达情况.结果 A、B、C、D组肿瘤治疗后质量分别为(6.683 ±1.102)g、(2.851 ±0.223)g、(2.282 ±0.443)g、(1.052±0.225)g,B、C、D组与A组相比明显降低,D组与B、C组相比明显降低(P均＜0.05).B、C、D组抑瘤率分别为51.58％、60.54％、80.96％.D组小鼠瘤体内大量肿瘤细胞变性和坏死,且瘤内有大量CDs+T淋巴细胞浸润,阳性产物主要呈现在细胞膜上并被染成棕褐色.B、C组内仅见少量CD8+T淋巴细胞.结论 甲醛固定的H22细胞联合IL-2具有延迟荷瘤小鼠H22肝癌形成,限制生长的作用.     

晚期血吸虫病肝纤维化患者血清维生素D水平与免疫失衡的关系

目的探索晚期血吸虫病肝纤维化患者血清维生素D水平与免疫失衡间的关系。方法选择2016年5月至2018年9月就诊于嘉兴市第一医院血吸虫病科的120例晚期血吸虫病肝纤维化患者作为观察组,选取50例同期该院健康体检者作为对照组,比较两组血清中IgG抗体、IgA抗体、C3补体、C4补体、CD4+细胞比例、CD8~+细胞比例、25羟维生素D [25(OH)D]等指标水平。根据超声肝纤维化分级标准,将患者分为肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级,比较不同程度肝纤维化患者血清中上述指标水平差异。根据患者血清中维生素D水平,将患者分为25(OH)D水平充足组、不足组和缺乏组,比较各组患者上述指标水平差异,并分析维生素D水平与免疫指标间的相关性。结果 120例晚期血吸虫病肝纤维化患者中,男性58例、女性62例,平均年龄(72.00±3.00)岁;肝纤维化I级32例、Ⅱ级46例、Ⅲ级42例。观察组和对照组血清D-二聚体(D-D)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、C3补体、C4补体水平差异均无统计学意义(t=2.467、0.322、0.790、-2.432、-2.630,P均 0.05),但天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、血钙、血磷、IgG抗体、IgA抗体、CD4~+细胞比例、CD8~+细胞比例、25(OH)D水平差异均有统计学意义(t=5.130、6.382、-1.341、2.361、8.708、11.783、-2.995、-6.543、-3.022,P均0.05)。不同肝纤维化程度患者AST、ALT、血磷、IgA抗体、C3补体、CD8+细胞比例、25(OH)D水平差异均有统计学意义(F=19.704、16.254、62.669、49.347、5.430、5.434、5.783,P均0.05);肝纤维化Ⅰ级与Ⅲ级患者ALT、血磷、IgA抗体、CD8+细胞比例、25(OH)D水平差异均有统计学意义(P均0.05),肝纤维化Ⅱ级与Ⅲ级患者血磷、IgA抗体、CD8+细胞比例差异均有统计学意义(P均0.05),肝纤维化Ⅰ级与Ⅱ级患者CD8+细胞比例差异有统计学意义(P 0.05)。25(OH)D水平充足组、不足组与缺乏组患者血清IgG抗体、IgA抗体、C3补体、CD4~+细胞比例、CD8~+细胞比例差异均有统计学意义(F=13.303、59.623、8.698、9.969、12.805,P均0.05),不足组与缺乏组患者血清CD8~+细胞比例差异有统计学意义(P 0.05)。Pearson相关性分析显示,晚期血吸虫病肝纤维化患者血清25(OH)D水平与IgG抗体、IgA抗体水平呈负相关(r=-0.754、-0.773,P均0.05),与C3补体、CD4+细胞比例、CD8~+细胞比例呈正相关(r=0.827、0.850、0.830,P均0.05)。结论晚期血吸虫病肝纤维化患者存在免疫失衡,患者血清中维生素D水平可能与免疫失衡有关。     

脂质体瘤苗抗小鼠H22腹水型肝癌作用研究

目的观察脂质体瘤苗的抗癌作用,寻找有效的抗肿瘤疫苗.方法制备H22肝癌细胞的脂质体瘤苗,将该瘤苗通过腹腔接种,免疫荷瘤的BalB/c小鼠(LAg组),同时设单用抗原免疫组(Ag组)和D-Hanks组作为对照,比较各组小鼠的生存期,并用MTT法检测外周血和脾淋巴细胞对H22肝癌细胞的体外杀伤作用.结果LAg免疫的BalB/c鼠的平均生存期及脾和外周血淋巴细胞毒活性均高于Ag组及D-Hanks组(P＜0.05),Ag组及D-Hanks组两者之间差异无显著性(P＞0.05).结论单用H22抗原不能诱导有效的抗肝癌免疫反应,用脂质体包裹后,其抗肝癌作用可明显增强,脂质体瘤苗有潜在的临床应用前景.     

加载野生型p53基因鼠树突细胞的抗肿瘤作用

目的 观察加载了野生型p53基因的树突细胞(DC)对不同位点p53基因突变肿瘤得庖咧瘟谱饔?方法通过锥虫蓝染色、同种异体混合白细胞反应及流式细胞仪检测DC细胞表面分子,评估腺病毒(Ad)-p53感染DC是否影响DC的免疫功能.以Ad或转导了野生型p53基因的Ad分别感染骨髓De(Ad-DC和Ad-p53-DC)后,静脉注射免疫C57BL/6小鼠各5只,分离脾细胞,采用标准6 h51 Cr释放试验测定其诱导不同肿瘤细胞系(MethA、D459和P815)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性;效应细胞(Ad-p53-DC免疫后的小鼠脾细胞)和靶细胞(Ad-p53-P815和D459)孵育时分别加入抗CD4抗体或抗CD8抗体,观察CTL的活性变化.使用MethA和D459肿瘤细胞系得到不同的荷瘤鼠,于肿瘤形成前后分别使用Ad-p53-DC免疫,Ad-DC对照,当实体瘤三维直径之和＞20 cm时处死小鼠,用生存曲线评估Ad-p53-DC免疫的预防或治疗作用.结果 (1)Ad-p53-DC免疫诱导的抗Ad-p53-P815、D459和MethA的CTL反应(效应细胞:靶细胞=50:1)分别为(27.8±3.4)%、(23.5±2.7)%及(58.3±9.2)%,与Ad-DC免疫诱导的反应[(9.3±1.8)%、(4.6±1.0)%及(23.5 ±3.7)%]相比,差异有统计学意义(td值分别为5.79、3.68、5.02,均P＜0.05).Ad-p53-DC免疫小鼠T淋巴细胞与靶细胞Ad-p53-P815或D459的CTL活性,抗CD4组[(59.8 ±4.6)%、(18.9±2.4)%]与无抗体组[(64.4±6.3)%、(22.2±3.0)%]相比,差异无统计学意义(td值分别为0.84、0.91,均P＞0.05),而抗CD8组[(26.7±2.8)%、(6.1±1.2)%]差异有统计学意义(td值分别为9.03、7.67,均P＜0.05).抗CD8组与抗CD4组比较,差异有统计学意义(td值分别为8.79、9.18,均P＜0.05).(2)Ad-p53-DC和Ad-DC静脉注射2次免疫小鼠后,分别以D459细胞或MethA肉瘤细胞荷瘤20只小鼠.在Ad-p53-DC免疫组分别有14只和16只小鼠肿瘤的生长得到完全抑制,与Ad-DC免疫组比较差异有统计学意义(x2值分别为6.72、5.86,P＜0.05).皮下接种小鼠D459后,Ad-p53-DC免疫治疗组的小鼠肿瘤生长速度比Ad-DC组延缓2周左右,二组比较差异有统计学意义(x2 值为9.48,P＜0.05).结论 Ad-p53-DC可诱导抗MethA、P815和D459靶细胞的由CD8+T淋巴细胞介导的CTL反应,并抑制鼠体内肿瘤细胞的形成和生长.     

支气管哮喘大鼠CD4+CD25+T细胞的变化及地塞米松干预作用的研究

目的 研究支气管哮喘(简称哮喘)大鼠模型支气管肺泡灌洗液(BALF)、血液、脾脏CD4+CD25+T细胞的变化,及地塞米松对CD4+CD25+T细胞的影响.方法 50只SD大鼠随机分为5组,空白对照(A)组,哮喘(B)组,地塞米松1(C)组、地塞米松2(D)组,地塞米松3(E)组.A组第l天给予腹腔注射生理盐水l ml,第15～21天每天给予生理盐水雾化.B、C、D、E组用卵蛋白建立哮喘大鼠模型,第1天,每只大鼠腹腔注射抗原l ml(卵蛋白1 mg+灭活百日咳杆菌9×106个+氢氧化铝干粉100 mg)混悬液,第15～21天给予1%的卵蛋白雾化30 min,C、D、E组于雾化后分别给予腹腔注射地塞米松0.2 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg.采用流式细胞仪检测的方法 ,观察大鼠体内BALF、外周血、脾脏CD4+CD25+T细胞的变化及使用不同剂量地塞米松后对其的影响.结果 B组BALF、外周血、脾脏CD4+CD25+T细胞表达占CD4+T细胞的百分比分别是(42.21±5.62)%、(12.69±2.70)%、(11.15±1.05)%,A组结果 分别是(18.76±5.85)%、(6.21±1.73)%、(7.85±2.13)%.B组与A组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05);C组、D组、E组BALF中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的百分比表达分别是(10.49±4.03)%、(13.28±5.12)%、(7.51±5.39)%,显著低于A组和B组,(P＜0.05,P＜0.01);外周血中,C组(6.03±1.43)%、D组(4.88±0.95)%与A组(6.21±1.73)%比较,差异无统计学意义,E组(3.49±0.62)%与C组、A组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).脾脏中,C组(7.25±1.82)%、D组(8.63±3.18)%与A组(7.85±2.13)%比较,差异无统计学意义,E组(3.38±1.37)%与C组、D组、A组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CD4+CD25+T细胞在哮喘大鼠体内有明显的优势表达,可能是哮喘发病的机制之一.地塞米松可以抑制CD4+CD25+T细胞的表达.BALF内CD4+CD25+T细胞的变化与外周血和脾脏的变化具有一致性,监测外周血或脾脏CD4+CD25+T细胞变化可了解肺部情况.     

不同U87细胞数量对裸鼠原位恶性胶质瘤模型构建的影响

目的 观察不同数量的人恶性胶质瘤U87细胞对裸鼠原位恶性胶质瘤模型构建的影响。方法 将20只裸鼠随机分成A、B、C、D组各5只,于右侧纹状体分别注射0、0.05×105、0.2×105、1×105/μL的U87细胞悬液5μL。接种前及接种后4周称取体质量,接种4周后取脑组织测量肿瘤体积,并行脑组织病理检查。结果 接种后4周,D组体质量较A组降低(P<0.05),其他组间无统计学意义。A组无肿瘤形成,脑组织病理检查未见异常;B、C、D组均可见肿瘤组织,细胞核中Ki-67蛋白表达强阳性;肿瘤体积分别为(1.57±0.09)、(4.25±1.15)、(16.32±0.41)mm3,组间比较,P均<0.05。结论 U87细胞颅内接种可构建原位恶性胶质瘤模型,且接种细胞数量越多建模效果越好。     

树突状细胞介导心肌梗死大鼠特异性细胞免疫对心室功能改善的作用

目的探讨树突状细胞(DC)介导心肌梗死(AMI)大鼠特异性细胞免疫对心室功能改善的作用。方法购自北京医疗器械检验所(动物实验中心)清洁级雄性大鼠24只,构建AMI手术模型后将其随机分成A、B、C三组,每组各8只,A组为假手术大鼠、B组为AMI大鼠、C组为接受DC干预的AMI大鼠。记录大鼠生存情况;每组4只用于DC、血流动力学指标和炎性因子检测,另4只用于HE染色检测细胞炎性浸润、细胞凋亡及心肌梗死情况。结果 C组生存率高于A组(P0.05);AMI后第3 d可检出DC相关标志物,第7 d达高峰,第14 d后下降;C组CD40、CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ表达水平高于A、B组(P0.05);流式分析结果显示,DC可获取CD4~+CD25~+纯度90%,且可有效诱导Treg细胞群;Treg在大鼠心脏和淋巴结中均有表达,且C组表达水平高于A、B组(P0.05);C组动力学指标、炎性因子水平优于A、B组(P0.05);C组心肌梗塞面积、胶原体积分数(CVF)低于A、B组(P0.05),且基质金属蛋白酶2(MMP-2)活性高于A、B组(P0.05);C组炎性细胞计数、细胞凋亡A、B组(P0.05)。结论 DC可激活AMI后特异性细胞免疫,修复炎性细胞,进一步改善心室重塑及功能,提高AMI大鼠生存率。     

脾多肽注射液对进展期直肠癌患者术后外周血调节性T细胞水平的影响

目的:观察脾多肽注射液对进展期直肠癌患者术后细胞免疫功能及调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的影响.方法:前瞻性收集2014-05/2015-12山西省肿瘤医院结直肠外科进展期直肠癌患者82例,随机分配为脾多肽组(A组:42例)和常规治疗组(B组:40例),A组在常规治疗(B组)基础上术后给予脾多肽注射液治疗10 d.用间接免疫荧光法分别检测患者手术前3 d及手术后2 wk外周血中Treg细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、自然杀伤(natural killer,NK)细胞占淋巴细胞的比例,以及CD4~+T细胞/CD8~+T细胞,观察免疫细胞比例的变化.结果:两组患者治疗前均提示细胞免疫功能低下,各免疫细胞比例两组之间无统计学差异(P0.05).与手术前对比,两组治疗后均出现CD4~+T细胞比例下降(A组:t=2.311,P=0.026;B组:t=4.909,P=0.000)、CD8~+T细胞比例升高(A组:t=2.415,P=0.020;B组:t=6.384,P=0.000),CD4~+T细胞/CD8~+T细胞下降(A组:t=3.267,P=0.002;B组:t=6.964,P=0.000),而NK细胞无统计学差异(A组:t=1.002,P=0.322;B组:t=0.511,P=0.612).术后2 wk患者两组之间CD4~+T细胞比例(t=2.231,P=0.029)、CD8~+T细胞比例(t=2.151,P=0.035),CD4~+T细胞/CD8~+T细胞(t=3.473,P=0.001)均有统计学差异,而NK细胞(t=0.220,P=0.827)无统计学差异.对于Treg细胞,术前两组之间无统计学差异(t=0.552,P=0.583),术后两组均有统计学差异.A组(t=69.408,P=0.000)与B组(t=39.521,P=0.000)患者手术后Treg细胞较术前均明显下降,A组较B组患者的Treg细胞比例下降明显(t=68.977,P=0.000).结论:脾多肽注射液能够提高进展期直肠癌患者术后免疫功能,同时降低患者围术期Treg细胞水平,这可能是脾多肽注射液提高患者免疫功能的途径之一.     

西罗莫司促进TGF-β分泌对小鼠调节性T细胞体外增殖的影响

目的通过观察西罗莫司或环孢霉素A与CD4+CD25+调节性T细胞((regulatory T cell,Treg)体外共培养对CD4+CD25+Treg增殖情况及对Foxp3和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达的影响,探讨西罗莫司促进TGF-β分泌诱导Treg体外分化和增殖的机制。方法无菌条件下取C57BL/6小鼠脾脏,分离单个核细胞,免疫磁珠分选获得CD4+CD25+Treg,设空白对照组、西罗莫司组、环孢霉素A组,共培养96h。上流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg。反转录聚合酶链、酶联免疫吸附试验法检测西罗莫司或环孢霉素A处理后的CD4+CD25+Treg的FoxP3+、TGF-βmRNA表达水平和分泌情况;Western blot分析TGF-β信号通路重要的活化分子Smad蛋白的表达情况,观察其对CD4+CD25+FoxP3+Treg增殖的影响;使用TGF-β中和抗体进一步验证TGF-β在西罗莫司促进CD4+CD25+FoxP3+Treg分化增殖过程中的重要作用。结果与对照组相比,西罗莫司处理的CD4+T细胞分泌的TGF-β水平增加近2.5倍,差异有统计学意义(P<0.01);而环孢霉素A处理的CD4+T细胞分泌的TGF-β水平则有所下降,但与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,环孢霉素A组CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞比例明显降低,差异有统计学意义(41.25%vs.69.22%,P<0.01);西罗莫司组CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞稍有下降,但差异无统计学意义(65.21%%vs.69.22%,P>0.05)。西罗莫司组FoxP3+T细胞的比例明显高于对照组,差异有统计学意义(53.7%vs.40.2%,P<0.05);而环孢霉素A组FoxP3+T细胞比例明显低于对照组,差异有统计学意义(23.6%vs.40.2%,P<0.01)。结论西罗莫司在体外培养促进CD4+CD25+Treg的增殖与生长,而环孢霉素A体外抑制CD4+CD25+Treg的增值与生长。西罗莫司通过诱导TGF-β表达分泌来促进CD4+CD25+FoxP3+Treg的增殖。     

肝癌细胞裂解物致敏的树突状细胞瘤苗预防肝癌术后转移复发

目的探讨人自体肝癌细胞裂解物致敏的树突状细胞(D C)瘤苗预防肝癌术后转移复发的价值。方法从肝癌患者外周血单核细胞中诱导D C,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF) 和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)刺激活化,经自体肝癌细胞裂解物致敏D C制备瘤苗。将3 0例肝癌术后患者随机分为D C瘤苗治疗组1 5例,对照组1 5例。对两组病例治疗前后免疫功能、临床疗效、肿瘤转移复发率及生存率进行观察比较。结果DC瘤苗治疗后外周血CD 3 、CD4 /CD 8 及自然杀伤细胞比率较治疗前明显升高(P<0.0 5),且明显高于对照组治疗后的相应水平(P<0.05)。DC瘤苗治疗后血清IL-1 0水平明显下降(P<0.0 5)。随访18个月,DC瘤苗治疗组的转移复发率为13.3 3%,明显低于对照组53.33%(P <0.05);而治疗组的生存率为93.33%,明显高于对照组60.00%(P<0.05)。结论肝癌术后行自体肝癌细胞裂解物致敏的DC瘤苗治疗,可改善患者的免疫功能,降低肿瘤转移复发率,提高患者术后生存率,为肝癌的免疫治疗开辟一条新途径。     

失代偿期乙型肝炎肝硬化患者骨髓间充质干细胞对自体外周血淋巴细胞及调节性T细胞亚群增殖的影响

目的研究乙型肝炎肝硬化失代偿期患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)对其外周血中淋巴细胞、调节性T细胞亚群(Tregs)增殖的影响。方法 12例乙型肝炎肝硬化失代偿期患者骨髓分离培养出间充质干细胞,采用倒置显微镜观察培养后的贴壁细胞形态、采用流式细胞仪技术观察间充质细胞免疫表型;在植物血凝素(PHA)刺激下、自体血清作为培养基,实施BMSCs和患者自体外周血淋巴细胞共培养,分为A组(BMSCs+淋巴细胞+PHA接触培养)、B组(BMSCs+淋巴细胞+PHA非接触培养)、C组(淋巴细胞+PHA培养)、D组(淋巴细胞),均72 h后观察BMSCs对外周血淋巴细胞增殖及Tregs细胞表达的影响。结果流式细胞仪分析结果显示:培养3代后的间充质干细胞主要高表达T细胞亚群(Tregs)中的CD44(95.26%)、CD29(92.18%),低表达CD34(1.27%)、CD25(1.33%)。C组淋巴细胞增殖率显著高于A、B、D组(P0.05),A、B两组显著高于D组(P0.05),但A、B两组差异无统计学意义(P0.05)。A、B、C组Tregs细胞表达率显著高于D组(P0.05),A、B两组显著高于C组(P0.05),A、B两组差异无统计学意义(P0.05)。结论乙型肝炎肝硬化失代偿期患者BMSCs对其外周血中淋巴细胞增殖具有抑制作用、同时调上调T细胞亚群表达,BMSCs可能具有免疫抑制作用。