整合蛋白α5,β1亚基的过表达对肝癌细胞粘附和迁移的影响

目的：研究整合蛋白α5,β1亚基的过表达与肝癌细胞粘附能力、迁移能力、集落形成能力、以及与肝癌细胞凋亡的关系。方法：用已建立的单独转染α5,β1整合蛋白亚基的细胞株α5/3-7721,β1/6-7721和共转α5和β1整合蛋白亚基的细胞株α5β1/6-7721;采用结晶紫染色法测定细胞的粘附能力、细胞的迁移能力;应用荧光染色法和流式细胞仪法测定细胞凋亡速度。结果：转染后细胞与主要胞外基质蛋白-纤连蛋白的粘附分别为对照细胞的1.39,1.34,1.7倍;与层粘连蛋白（Ln)的粘附为对细胞的1.3、2.6、1.98倍;α5,β1整合蛋白转移株细胞在Fn上的迁移能力分别增加1.22、0.78、1.38倍。集落形成能力分别下降38%,35%和52%。在无血清培养时,α5,β1整合蛋白转染株细胞的凋亡百分率分别提高2.4、0.53、1.79倍。结论：将α5β1整合蛋白导入人肝癌细胞引起α5β1整合蛋白表达,可显著改变细胞的生长,粘附和迁移能力,从而导致体外集落形成能力明显下降,细胞凋亡增加。     

人DNA MTase反义基因转染诱导E-钙黏附蛋白高表达

目的：观察人DNA MTase反义基因转染后肝癌细胞系SMMC－7721 E－钙黏附蛋白表达的变化。方法：用基因重组技术构建包含人DNA MTase正,反义基因片段的真核表达载体,采用脂质体法将其转染人肝癌细胞系SMMC－7721,采用RT－PCR法观察DNA MTase基因mRNA,E-钙黏附蛋白基因mRNA表达变化;以甲基化特异的PCR法检测E－钙黏附蛋白基因启动子区域甲基化状态的改变,以免疫组化和流式细胞法检测E－钙黏附蛋白表达变化。结果：正、反义真核表达载体构建成功并转染入SMMC－7721细胞,其中DNA MTase基因mRNA表达减低,E－钙黏附蛋白基因mRNA表达上调,E－钙黏附蛋白基因启动子区域呈现去甲基化状态,E－钙黏附蛋白表达上调。结论：抑制DNA MTase基因的表达可使肝癌SMMC－7721细胞中E－钙黏附蛋白基因启动子区域去甲基化和表达增加,DNA MTase通过诱导启动子区域高甲基化,可使E－钙黏附蛋白基因低表达。     

黏着斑激酶对肝癌细胞生物学行为的影响

目的：探讨降低黏着斑激酶（FAK）的表达对FAK高表达的人肝癌细胞株SMMC－7721恶性生物学行为影响。方法用Western杂交法比较不同肝癌细胞株FAK含量的差别,构建FAK反义质粒,转染至FAK高表达的细胞株,研究其多种细胞生物学行为的变化。结果SMMC－7721FAK含量比正常人肝细胞L02明显增高,转染FAK反义质粒后、SMMC－7721细胞生长受到抑制,软琼脂培养克隆形成率下降;细胞周期分析,S期细胞下降15％;黏附能力下降;细胞表面整连蛋白含量不变。结论在SMMC－7721中存在FAK过表达,降低FAK表达能部分逆转该肝癌细胞株的恶性表型。     

STAT3基因RNAi诱导肝癌细胞凋亡及对STAT3信号转导相关基因表达的影响

背景与目的:探讨STAT3基因RNAi对人肝癌细胞SMMC7721凋亡的影响,及对STAT3信号转导相关基因表达的影响,为STAT3信号通路的肿瘤靶向治疗提供理论依据.材料与方法:采用RNAi技术特异性沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达,通过Westem blot技术检测经RNAi作用后SMMC7721细胞STAT3蛋白表达水平的变化.采用透射电镜和流式细胞术检测经RNAi沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达后,对细胞凋亡的影响.通过半定量RT-PCR法检测细胞凋亡相关因子bcl-2和survivin基因表达的变化. 结果:STAT3基因RNAi可有效沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达(P<0.05).STAT3的表达被RNAi沉默后,SMMC7721细胞凋亡率较对照组明显增加(P<0.01).且SMMC7721细胞bel-2和survivin mRNA的表达水平均受到明显抑制,与对照组间的差异均具有统计学意义(P<0.01). 结论:STAT3基因RNAi可有效沉默SMMC7721细胞中STAT3的表达,诱导SMMC7721细胞凋亡,下调SMMC7721细胞bcl-2、survivin mRNA的表达.     

人TNFα基因转染的人肝癌细胞稳定高表达细胞克隆SMMC7721-TNF的建立及其部分生物学特性的初步观察

用重组逆转录病毒载体L-tnfSN的包装病毒颗粒感染人肝癌细胞SMMC7721，G418筛选后，随机挑选10个细胞克隆，扩大培养，检测细胞培养液上清中TNFα的水平，将其中表达TNF最高细胞克隆命名为SMMC7721-TNF。观察SMMC7721-TNF的分子生物学特性。Southern Blot证明TNFα基因完整地整合在细胞基因组中，     

α—干扰素对肝癌多药耐药株SMMC—7221／AMD的逆转及其机制研究

目的：研究α－干扰素对人肝癌多药耐药细胞SMMC－7221／ADM的逆转作用。方法：用MTT法检测常用化疗药物对SMMC－7221／ADM的毒性。用流式细胞仪（FCM）检测SMMC－7221／ADM细胞的P－糖蛋白（P－gp)的表达及细胞内柔红霉素的相对浓度，结果：α干扰素可提高SMMC－7221／ADM细胞内化疗药物的浓度，增加阿霉素等化疗药物对SMMC－7221／ADM的毒性作用。结论：α－干扰素可逆转人肝癌多药耐药株SMMC－7221／ADM。     

NF—кB信号传导途径对TNF—α诱导的SMMC—7721细胞凋亡的影响

背景与目的：已证明核因子кB（nuclear factor-кB,NF-кB)在免疫细胞激活,抗病毒,多种应激反应和细胞凋亡的调控等许多方面起着重要作用。本实验研究NF-кB信号传导途径对TNF-α诱导的肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡的影响。方法：采用ELISA和免疫组化检测TNF-α对NF-к信号传导通路的激活作用,继而用TPCK（n-tosyl-Phe-chloromethylketone)阻断NF-кB的活化,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：（1）TNF-α能激活NF-кB信号传导通路;（2）TPCK能抑制TNF-α诱导的NF-кB活化;（3）TPCK抑制NF-кB活化后,能加强TNF-α诱导的细胞凋亡,结论：SMMC-7721细胞中NF-кB细胞传导途径参与了细胞的抗凋亡过程,在SMMC-7721细胞对TNF-α的细胞毒性作用耐受中起重要作用,抑制NF-кB信号传导途径可能在肿瘤治疗中有潜在的应用价值。     

棘霉素对肝癌SMMC7721细胞凋亡相关基因影响的研究

目的：探讨棘霉素诱导肝癌SMMC7721细胞的凋亡作用及对转录因子Twist、p53、Survivin和hTERT（人端粒酶）基因的影响。方法：采用MTT法测定棘霉素对肝癌细胞的生长抑制率；半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测与肝癌的发生和转移密切相关的转录因子Twist，与细胞增殖和凋亡联系紧密的p53、Survivin和hTERT的mRNA表达水平的改变；利用Westernblot方法分析棘霉素治疗后上述基因的蛋白表达情况。结果：体外实验证实，棘霉素浓度〉10．0ng／mL各组对细胞的生长抑制均显著增加，P〈0．05，随棘霉素药物浓度增加，细胞抑制率明显增大。棘霉素抑制肝癌细胞株SMMC7721的作用呈剂量一时间依赖性。RT-PCR方法证实，随着棘霉素剂量的增加，肝癌SMMC7721细胞株中Twist、Survivin和hTERTmRNA表达水平逐渐下调，P〈0．01，p53mRNA表达水平微弱上调，P〈0．05。Westernblot检测显示，Twist、Survivin和hTERT蛋白的表达量呈递减趋势，P〈0．01，p53蛋白的表达微弱上调，P〈0．01。结论：随着棘霉素剂量的增加，细胞凋亡率显著增加。棘霉素能够抑制与肝癌生长密切相关基因的Twist、Survivin和hTERTmRNA表达，促进p53mRNA表达上调，相应蛋白的表达呈下调和上调。棘霉素可能通过抑制肝癌细胞的生长、转移和促进肝癌细胞的凋亡起到抑制肿瘤生长的作用。     

全反式维甲酸抑制反义N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V转染的SMMC7721肝癌细胞蛋白激酶B的表达

目的 探讨全反式维甲酸（ATRA）诱导反义N－乙酰氨基葡萄糖转移酶V转染的SMMC 7721肝癌细胞（简称AS－GnT-V/7721)凋亡机制。方法 用Hoechst染色检测ATRA诱导细胞凋亡情况，并应用Northern Blot和Western Blot检测ATRA诱导AS－GnT-V/7721细胞凋亡过程中bcl-2及蛋白激酶B(PKB)的表达。结果 Hoechst 33258染色结果显示ATRA处理AS－GnT-V/7721细胞24h后，细胞发生凋亡。Western Blot检测发现，ATRA处理AS－GnT-V/7721细胞不改变bcl-2的表达，但抑制PKB蛋白表达。ATRA处理AS－GnT-V/7721细胞24h后PKB蛋白即明显降低（约为原来的32%)，处理48h后PKB蛋白几乎检测不到。Northern blot检测发现，ATRA处理AS－GnT/V7721细胞12h,PKB mRNA即有所下降，24h时PKB mRNA约为原来的48％,处理48h,PKB mRNA减少至原来的15％。而ATRA处理对照细胞，bcl-2及PKB表达均不变。结论 ATRA诱导AS－GnT-V/7721细胞凋亡过程中PKB的表达下降，而bcl-2表达不变。提示，ATRA诱导AS－GnT-V/7721细胞凋亡可能是由于抑制PKB表达，而与bcl-2无关。     

白细胞介素1β转换酶基因转导人肝癌细胞株的建立及其生物学特性研究

应用基因重组技术构建了人细胞凋亡基因白介素iβ转换酶(ICE)重组逆转录病毒载体pLXSN-hICE,采用电穿孔法将其与空载体pLXSN导入包装细胞系PA317,筛选G418抗性克隆,并将其病毒上清转入人肝癌细胞株SMMC7721,经G418筛选分别获得阳性克隆SMMC7721-hICE及SMMC7721-neo.RT-PCR分析证实目的基因已整合在SMMC7721-hICE细胞基因组中.细胞生长曲线测定及裸鼠致瘤性分析表明SMMC7721-hICE体外生长速度明显低于对照细胞SMMC7721及SMMC7721-neo,而且在裸鼠体内成瘤性降低(前者3/6,后者6/6),肿瘤发生延缓,肿瘤重量明显减轻.以上结果表明,逆转录病毒介导的人ICE基因转染使肝癌细胞恶性增殖明显受抑,为开展人ICE基因治疗提供了实验基础.     

环氧合酶-2抑制剂塞来昔布诱导人肝癌细胞凋亡及其机制

目的：探讨环氧合酶2（cyclooxygenase2,COX2）抑制剂塞来昔布（celecoxib）诱导人肝癌细胞系SMMC7721凋亡的作用及其可能机制。方法：以10、25、50、75、100 μmol/L的塞来昔布处理SMMC7721细胞,MTT法检测肿瘤细胞增殖,Hoechst 33342/PI 双染法检测细胞凋亡的形态特征,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期变化。RTPCR法检测Fas和Bcl2mRNA的表达,Western blotting检测细胞Fas和Bcl2 蛋白的表达。结果：塞来昔布以剂量依赖的方式抑制SMMC7721细胞增殖。塞来昔布作用后,SMMC7721细胞出现核染色质凝集、核膜破裂等凋亡细胞典型的形态特征。25、50和100 μmol /L塞来昔布诱导SMMC7721细胞的凋亡率分别为(16.32±2.32)%、(38.05±2.47)%、(71.17±3.19)%,并使细胞阻滞于G0/G1期。塞来昔布处理后,SMMC7721细胞Fas mRNA及蛋白表达明显增强（P<0.01）;Bcl2 mRNA表达无明显变化（P>005）,高浓度塞来昔布可下调Bcl2蛋白表达（P<0.01）。结论：塞来昔布能够抑制SMMC7721细胞增殖并诱导凋亡,其机制可能与影响凋亡相关基因表达有关。     

叶酸诱导人肝癌细胞凋亡及其机制的研究

目的：研究叶酸诱导人肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法：应用叶酸连续处理体外培养的人肝癌细胞（SMMC－7721）,4天后光镜及电镜观察细胞形态改变,细胞计数测定细胞生长及增殖情况,DNA凝胶电泳分析DNA改变,流式细胞仪检测细胞周期分布,细胞凋亡指数及凋亡相关基因及其表达的改变。结果：10ug/ml叶酸可诱导SMMC－7721细胞出现凋亡特征性形态改变,其细胞NDA电一现“梯状”断裂现象,细胞凋亡指数为16．8％（空白对照组为6．9％）,S期细胞减少,细胞生长和增殖被明显抑制,且凋亡相关基因fas 和p53表达增加,而bcl-2和TGF－β1表达降低。结论：叶酸具有诱导人肝癌细胞凋亡的作用,其机制可能与凋控细胞凋亡相关基因的表达有关。     

RNA干扰抑制BMP-2基因表达对人肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响

目的：设计并化学合成针对骨形态发生蛋白2（BMP-2）的siRNA分子片段,转染人肝癌SMMC7721细胞,观察其对SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响。方法：阳离子脂质体法瞬间转染SMMC7721细胞,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western印迹法检测转染BMP-2-siRNA后细胞BMP-2 mRNA水平和蛋白水平的变化,MTT法和流式细胞术检测转染BMP-2-siRNA后SMMC7721细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化。结果：3对特异性BMP-2-siRNA均有效地抑制了BMP-2基因的表达,以siRNA-B抑制效果最好。转染BMP-2-siRNA后SMMC7721细胞的增殖能力明显受到抑制( P <0.05)且明显促进了SMMC7721细胞的凋亡。结论：靶向BMP-2基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌SMMC7721细胞的增殖并促进其凋亡     

恢复E-钙粘蛋白和β-连接素的表达通过诱导细胞凋亡抑制胰腺癌细胞的生长

在胰腺癌细胞系和胰腺原发肿瘤中 ,β 连接素和E 钙粘着蛋白的表达常常缺失 ,且 β 连接素表达的缺失比E 钙粘蛋白表达的缺失更为常见。利用不表达 β 连接素和E 钙粘着蛋白的人类胰腺癌细胞系MiaPaca 2和具有侵袭、运动能力的乳腺癌细胞系HS785T作为阳性对照 ,通过免疫荧光法、West ern分析法、悬滴粘附性分析、流式细胞仪测定、细胞凋亡和生长测定、基因转染等方法分析细胞粘附、细胞生长、细胞运动和细胞凋亡等方面的情况。结果发现亲代MiaPaca 2细胞不表达E 钙粘蛋白和β 连接素 ,而转染后细胞表达 β 连接素和E 钙粘蛋白。在表…     

过表达PRRX1 通过p53 介导的线粒体凋亡途径诱导肝癌SMMC7721 细胞凋亡

[摘要] 目的：探讨配对相关同源框1 蛋白（PRRX1）过表达对肝癌SMMC7721 细胞凋亡的影响及其分子机制。方法：分别用慢病毒介导PRRX1 过表达载体（pGMLV-PRRX1）、空载质粒（Vector）感染人肝癌SMMC7721 细胞,用qPCR和WB实验检测慢病毒感染后细胞中PRRX1 mRNA和蛋白的表达变化,用CCK-8 法、Annexin-V FITC/PI 染色流式细胞术分别检测PRRX1 过表达对SMMC7721 细胞增殖、凋亡的影响,用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-10 染色法）检测细胞线粒体膜电位变化,用caspase 活性检测试剂盒（分光光度法）测定细胞中caspase-8 和caspase-9 酶活性,用WB实验检测细胞中p53、Bcl-2、Bax、Fas、Cleaved-caspase-3以及线粒体和细胞质中细胞色素C（Cty C）蛋白的表达。结果：成功构建PRRX1 过表达的SMMC7721 细胞株,感染细胞中PRRX1 mRNA和蛋白的表达水平显著升高（均P<0.01）。与对照组和空载组比较,PRRX1 过表达组SMMC7721 细胞的增殖能力显著下降、细胞凋亡率显著增高、Cleaved-caspase-3 剪切水平显著升高、线粒体膜电位显著下降、线粒体中Cty C蛋白表达下调、胞质中Cty C蛋白表达上调以及caspase-9 酶活性升高（P<0.05 或P<0.01）,同时p53 和Bax 蛋白表达增加而Bcl-2 蛋白表达降低（均P<0.05）,但Fas 蛋白表达及caspase-8 酶活性无显著变化（均P>0.05）。结论: PRRX1 过表达可诱导肝癌SMMC7721 细胞凋亡,其机制可能与p53介导的线粒体凋亡途径被激活有关。     

叶绿酸铜钠对SMMC7721肝癌细胞抑制作用的体外实验研究

[目的]研究叶绿酸铜钠（CHL）体外抑制SMMC7721肝癌细胞的作用及机制。[方法]（1）MTT法测半数抑制浓度（IC50）并绘制生长曲线;（2）流式细胞仪观察CHL对SMMC7721细胞凋亡的诱导作用;（3）免疫组化方法检测增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期素D1（Cyclin D1）、环氧化酶-2（COX-2）的表达。[结果]（1）CHL对SMMC7721细胞具有增殖抑制作用,且具有浓度和时间依赖效应;（2）CHL能诱导SMMC7721细胞G1期阻滞,通过抑制细胞生长周期、降低细胞增生速率抑制肿瘤细胞增殖;（3）CHL对SMMC7721细胞凋亡无明显诱导作用;（4）CHL能下调SMMC7721细胞PCNA和COX-2蛋白表达,并呈一定的浓度依赖性。对Cyclin D1的表达无明显影响。[结论]CHL能抑制SMMC7721细胞的生长,这种抑制作用同PCNA、COX-2表达下调及细胞G1期阻滞有关,但与细胞凋亡和Cyclin D1的表达无关。     

整合蛋白α5、β1亚基在癌症中的表达与细胞分化的关系

目的研究整合蛋白α5和β1亚基在胃癌,结直肠癌,宫颈癌,乳腺癌的表达与肿瘤的分化程度,侵袭转移等生物行为的关系,及四种癌症之间α5和β1亚基表达的相互关系.方法用免疫组织化学ABC法检测20例胃癌,21例结直肠癌,20例宫颈癌,20例乳腺癌石蜡标本α5、β1亚基的表达水平.结果整合蛋白α5和β1亚基在四种肿瘤中的表达水平有一定类似,癌组织较癌旁组织的表达水平低,高中分化肿瘤比低分化肿瘤表达水平高,但下降概率有差异.α5、β1亚基在同种癌症中表达也有差异,β1的表达水平相对较高.结论整合蛋白α5和β1亚基在癌旁组织中的表达明显高于癌组织,并且与分化程度有关,与转移的关系比较复杂有待进一步研究,α5、β1亚基在四种癌症中的表达有一致性,但也有差异.不同种类亚基在癌症中的表达有差异.     

棘霉素对肝癌SMMC7721细胞凋亡相关基因影响的研究

目的:探讨棘霉素诱导肝癌SMMC7721细胞的凋亡作用及对转录因子Twist、p53、Survivin和hTERT(人端粒酶)基因的影响.方法:采用MTT法测定棘霉素对肝癌细胞的生长抑制率;半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测与肝癌的发生和转移密切相关的转录因子Twist,与细胞增殖和凋亡联系紧密的p53、Survivin和hTERT的mRNA表达水平的改变;利用Western blot方法分析棘霉素治疗后上述基因的蛋白表达情况.结果:体外实验证实,棘霉素浓度＞10.0 ng/mL各组对细胞的生长抑制均显著增加,P<0.05,随棘霉素药物浓度增加,细胞抑制率明显增大.棘霉素抑制肝癌细胞株SMMC7721的作用呈剂量-时间依赖性. RT-PCR 方法证实,随着棘霉素剂量的增加,肝癌SMMC7721细胞株中Twist、Survivin和hTERT mRNA表达水平逐渐下调,P<0.01,p53 mRNA表达水平微弱上调,P<0.05.Western blot检测显示,Twist、 Survivin和hTERT蛋白的表达量呈递减趋势,P<0.01,p53蛋白的表达微弱上调,P<0.01.结论:随着棘霉素剂量的增加,细胞凋亡率显著增加.棘霉素能够抑制与肝癌生长密切相关基因的Twist、Survivin和hTERT mRNA表达,促进p53 mRNA表达上调,相应蛋白的表达呈下调和上调.棘霉素可能通过抑制肝癌细胞的生长、转移和促进肝癌细胞的凋亡起到抑制肿瘤生长的作用.     

低温等离子体在肿瘤治疗中的应用

研究表明,低温等离子体对肝癌、黑色素瘤、脑肿瘤、大肠癌、肺癌等具有一定的治疗作用.主要机制为：等离子体作用后使癌细胞内一氧化氮和活性氧水平增高,导致DNA损伤和线粒体功能障碍,细胞内线粒体凋亡通路被激活,改变了Bax/Bcl-2比例,活化凋亡蛋白caspase3、9,伴有细胞周期阻滞（G2-M期或S期）,最终导致细胞生长阻滞和细胞凋亡;增加β-catenin磷酸化,导致β-catenin降解,抑制整合蛋白2、4以及细胞表面局部黏着斑激酶的表达,破坏细细胞黏附,降低细胞的迁移和侵袭活性.     

HPV16 E7蛋白对TNF-α诱导食管癌细胞凋亡及其机制的探讨

目的:探讨HPV16 E7蛋白表达对TNF-α诱导的食管癌细胞凋亡的作用及其机制.方法:构建HPV16 E7蛋白高表达的食管癌细胞系KYSE150,药物处理后利用流式细胞学检测及PARP蛋白的切割来鉴定细胞凋亡.蛋白质印迹法检测代表AKT活性的AKT473位丝氨酸磷酸化水平,荧光素酶报告基因实验检测Survivin的转录活性.结果:TNF-α与放线菌素D可以诱导食管癌细胞KYSE150发生细胞凋亡.空载细胞的细胞凋亡率从0h的1.2％增加到10h的12.1％和20 h的26.5％;E7高表达的KEYE150细胞凋亡率从0h的2.5％增加到10h的20.9％和20 h的40.5％.与空载相比,HPV16 E7表达的细胞凋亡率明显增多,在处理20 h后E7表达的KYSE150细胞凋亡率为对照细胞的1.53倍.HPV16 E7高表达的KYSE 150细胞PARP的116×103条带弱于对照细胞,而89×103条带则明显强于对照组.KYSE150GFP-E7细胞AKT143丝氨酸磷酸化水平仅为对照细胞的57.4％.TNF-α/ACD处理可以引起AKT磷酸化水平升高,但KYSE150GFP-E7细胞中AKT磷酸化水平的升高仍低于对照细胞.E7蛋白表达使得Survivin启动子区活性下调42.8％,而外源性过表达c-AKT及持续活化型AKT(myr-AKT)则使Survivin启动子区活性回复.外源性过表达AKT可以拮抗HPV16 E7对于TNF-α诱导的细胞凋亡的促进作用.结论:初步研究结果提示,HPV16 E7蛋白表达可促进TNF-α诱导的食管癌细胞凋亡,其分子机制可能是抑制AKT-Survivin通路.