一种缺失核定位信号区的hbFGF的表达及纯化

目的：为了研究缺失核定位信号区的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)独特的转运机制，在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达和纯化了缺失核定位信号区的hbFGF。方法：将PCR扩增得到的hbFGF cDNA片断克隆到表达载体pET3c中，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，通过离子交换和肝素亲和层析从菌体上清中纯化目标蛋白，MTT法检测促分裂活性。结果：hbFGF的表达量约为全菌体蛋白的20％，纯化的缺失核定位信号区的hbFGF的促分裂活性与缺失核定位信号区的hbFGF标准品相当。结论：BL21(DE3)／pET3c表达系统能高效表达缺失核定位信号区的hbFGF，纯化得到的hbFGF可用于进一步的研究。     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的 构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a(+)原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体.方法 采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a(+),通过两次定点诱变得到pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度.结果 经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的 蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1:100 000.结论 成功构建pET28a(+)-野生型LPL及pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础.     

成纤维细胞生长因子-21[Arg59]突变体基因的克隆及融合蛋白的表达与纯化

目的：对野生型成纤维细胞生长因子-21（FGF21）进行突变改造及表达与纯化,为后续蛋白质体外偶联(Pull-down)实验及建立人源肝癌裸鼠模型奠定基础。方法：采用PCR定点突变方法,将FGF21 cDNA第59位赖氨酸密码子突变为精氨酸密码子,所得的突变体片段与SUMO分子伴侣相连后插入表达载体pET20b,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导表达。对表达产物进行Ni-NTA柱亲和层析、酶切和除盐等纯化分析。结果：PCR扩增出约546 bp的特异性片段,测序分析表明已成功引入突变;所构建的pET20b-SUMO-FGF21［Arg59］ 重组阳性克隆经PCR与双酶切鉴定及测序分析,与预期结果一致;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约31 500,且为可溶性;Western blotting分析证实：纯化后产物是成熟的FGF21［Arg59］ 突变体蛋白。结论：成功构建FGF21［Arg59］ 突变体基因,并经表达纯化得到成熟的FGF21［Arg59］ 突变体蛋白。     

人La蛋白突变体表达质粒的构建及诱导表达纯化

目的:构建人La蛋白(human La protein,hLa)突变体表达质粒,并在大肠杆菌中表达野生型La蛋白及各突变体.方法:利用定点突变技术,对野生型人La蛋白的原核表达质粒pET28b-hLa进行定向缺失突变,将得到的3个突变体Mu1(A366)、Del1(A235～276)、Del2(A119～150)分别克隆至pET28b中,获得野生型人La蛋白突变体的表达质粒,并在BL21(DE3)和Rosetta2两种不同宿主菌中和不同浓度的IPTG诱导条件下进行蛋白表达水平的比较.结果:所获得的人La蛋白突变体的基因编码序列经测序符合序列设计的要求,表达产物经SDS-PAGE分析可见,在相对分子质量47 000处出现一明显条带,与预期的相对分子质量一致.结论:三个位点的序列改变并没有明显影响hLa蛋白的表达,在补充密码子的宿主菌Rosetta2中的表达量优于宿主菌BL21(DE3).     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a( )原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体。方法采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a( ),通过两次定点诱变得到pET28a( )-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度。结果经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1∶100000。结论成功构建pET28a( )-野生型LPL及pET28a( )-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础。     

人TFAR19的定点突变及其重组蛋白的表达、纯化和功能分析

目的:了解凋亡相关新基因TFAR19编码蛋白分子中潜在的Ser100磷酸化位点与其促凋亡效应的关系.方法:利用重叠延伸PCR定点突变技术构建TFAR19 Ser100→Ala100突变体,用DNA测序技术验证,大肠杆菌表达,离子交换技术纯化重组突变蛋白,将其加入培养的白血病细胞株HL-60,通过PI染色,流式细胞仪分析,观察突变重组蛋白的促凋亡效应.结果:构建成TFAR19 Ala100突变体,并经DNA测序所证实,在大肠杆菌中获得了高水平表达,Western blot表明突变型重组蛋白与野生型具有相同的免疫学活性,流式细胞仪分析发现突变蛋白对撤除血清的HL-60细胞具有与野生蛋白相似的剂量依赖性促凋亡效应. 结论:TFAR19 分子中潜在的Ser100磷酸化位点对其促凋亡效应无影响,提示TFAR19发挥其生物学活性时无需cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶活化.     

一种新型结缔组织生长因子人源单链抗体的可溶性表达以及分离纯化

目的：研究单链抗体（scFv）在不同载体和菌株中的表达以及表达产物的免疫学活性评价。方法：将人源化单链抗体的基因通过酶切、连接等生物技术的方法克隆到pET28a、pET32a和pET-EI：X3种不同的载体中,并选用不同的表达菌株进行表达,观察单链抗体的表达情况并对抗体的可溶性表达进行优化,采用亲和层析和分子筛层析对目的蛋白进行纯化,并在体外研究目的蛋白的生物学活性。结果：抗结缔组织生长因子单链抗体在pET28a/BL21（DE3）中不能表达,在pET32a/BL21（DE3）和pET-EI：X/BLR（DE3）中均成功表达,但是在pET-EI：X/BLR（DE3）中scFv抗体无法从内含肽（intein）上裂解。scFv在pET32a/BL21（DE3）中表达量占总蛋白的30%左右,经过两步层析纯化后纯度达到85%以上。体外免疫试验显示,目的蛋白具有良好的免疫学活性。结论：人源化抗结缔组织生长因子单链抗体scFv在大肠杆菌中的表达需要分子伴侣,通过低温表达策略在pET32a/BL21（DE3）中成功得到表达。     

截断型人酸性成纤维细胞生长因子的表达及活性鉴定

目的:稳定且具有活性的截断型人酸性成纤维细胞生长因子(shaFGF)的构建、表达及纯化.方法:以含全长人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的质粒pUC-haFGF为模板,设计一对引物,PCR扩增获得shaFGF cDNA,将其克隆到表达载体pET3c中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导表达,通过离子交换和肝素亲和层析纯化目标蛋白,MTT法检测促分裂活性.结果:shaFGF的表达量约为25%,纯化的shaFGF的促分裂活性与haFGF标准品相当.结论:BL21(DE3)/pET3c表达系统能高效表达shaFGF,纯化得到的shaFGF可供下一步的药学研究.     

基于增殖诱导配体新型抗肿瘤分子的构建及初步筛选

目的构建针对APRIL的免疫抑制分子,并对其原核表达蛋白进行纯化及活性筛选.方法将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变并插入TEL Th表位序列,突变体用pQE-80L/DH5α原核表达系统进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定、Ni-NTA亲和层析纯化及Western印迹分析,最后检测纯化蛋白对Raji细胞增殖的影响.结果成功构建并表达了4种sAPRIL突变体:C端引入HEL Th表位的sAPRIL突变体(Ⅰ)、N端引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅱ)、C端缺失45bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅲ)、N端缺失45 bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅳ).SDS-PAGE电泳、Western印迹分析均检测到相应的特异蛋白带.用Ni-NTA系统成功纯化表达的突变体蛋白.细胞试验表明,突变体Ⅰ、Ⅱ纯化蛋白具有明显的促细胞增殖活性,而突变体Ⅲ、Ⅳ纯化蛋白没有促细胞增殖活性.结论在4种sAPRIL突变体中初步筛选到不具有促细胞增殖活性的APRIL免疫抑制分子,为下一步确定该分子的免疫抑制功能奠定了物质基础.     

hIL-3突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :将天然型hIL 3蛋白经定点突变为hIL 3突变体蛋白 ,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法 :超声破碎细菌得到包涵体 ,经DEAEFastFlow,SephaecrylS 200HR等层析步骤纯化。结果 :经以上一系列纯化 ,得到的人IL 3突变体蛋白纯度达90 % ,比活性为7.3×104 U/ml ,总回收率为100 %。结论 :突变体hIL 3在大肠杆菌中得到高效表达 ,并获得高纯度、高活性的hIL 3蛋白。     

胰十二指肠切除术后住院时间影响因素分析-回顾性研究

Background. Postoperative hospital stay after pancreaticoduodenectomy (PD) was relatively longer than other gastrointestinal operations, The aim of current study was to investigate the risk factors of postoperative hospital stay after PD. Methods. Patients who were performed PD in Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences (CHCAMS) between December 2008 and November 2012 were selected for the retrospective study. The clinical and pathological data was collected and analyzed. The primary outcome was postoperative hospital stay. Normal discharge or recovery was defined as postoperative hospital stay no more than 10 days, otherwise it was defined as delayed discharge or recovery (including hospital death). Results. Finally, 152 patients were enrolled in present study. Postoperative hospital stay was 19.7±7.7 (7-57 d). 67 of 152 patients were normal discharge, and 85 of 152 patients were delayed discharge. The overall morbidity of complications was 62.5% (95/152), and the mortality rate was 3.29% (5/152). Multiple factors analysis showed that complication morbidity (adjusted OR=10.40, 95%CI=3.58-30.22), age (adjusted OR=4.09, 95%CI=1.16-14.39), BMI (body mass index) (adjusted OR=4.40, 95%CI=1.19-16.23), surgical procedure (adjusted OR=26.14, 95%CI=4.94-153.19), blood transfusion (adjusted OR=7.68, 95%CI=2.09-28.27) and fluid input (adjusted OR=3.47, 95%CI=1.24-11.57) were significantly associated with delayed discharge. Conclusions. Postoperative complications affects the postoperative hospital discharge. Furthermore, age, BMI, transfused red blood, surgical procedure and input might prolong LOS (length of hospital stay). Studies with more patients were needed in future.     

甲状旁腺切除术对甲状旁腺机能亢进性骨病的远期疗效

为了评价甲状旁腺切除术对原发性甲状旁腺机能亢进（ＰＨＰＴ）所致骨病的远期疗效，回顾分析了１６例术后平均５．１（１．０～１０．５）年患者的临床表现、骨结构和骨密度恢复情况，结果表明手术虽能明显改善患者骨病，但在随访终点有１０／１６例（６２．５％）骨病恢复不全，其中骨病重的Ｙ１组比骨病轻的Ｙ２组恢复不全比例更高（Ｐ＜０．０５），１４／１６例血骨钙素（ＢＧＰ）和尿吡啶并啉（Ｐｙｒ）浓度处于中青年对照组范围内，这意味着其成骨与破骨处于平衡状态。这些结果提示：ＰＨ－ＰＴ患者应尽早诊断治疗，术后应对患者密切随访，重视对骨病恢复不全者的后续治疗     

甲磺酰胺苯乙胺类化合物抗心律失常活性的定量构效关系研究(Ⅰ)

以ＰＯＬＹＧＥＮ软件中的ＣＨＡＲＭｍ程序和集团坐标轮换法，对合成的１２个甲磺酰胺苯乙胺类化合物的结构进行计算机分子模拟。根据所得化合物的能量最低构象，计算了其ＶＤＷ体积、偶极矩、总键能、总键角能、总非正则能以及氮原子电荷等值，并对这些化合物进行ＣＮＤＯ／２法量化计算，这些计算结果作为结构参数分别与１２个化合物抗心律失常活性进行相关分析，以逐步回归法建立了两个相关性较好的方程：ｌｇｌ／ＭＥＣ＝６．９９９１－０．３８４２Ｘ２＋３．６７９６Ｘ５［ｎ＝１２，ｒ＝０．８５５９７５，ｓ＝０．１８９６７２，Ｆ＝１２．３３４６４＞Ｆ１－０．０５（３，９）＝３．８６］；ｌｇｌ／ＭＥＣ＝１４．７０３８－２１３．２６９２Ｘ４－１０．４８２９Ｘ５［ｎ＝１２，ｒ＝０．９３１９１９，ｓ＝０．１３３０４７，Ｆ＝２９．７１３５４＞Ｆ１－０．０１（３，９）＝６．９９］。结果提示，这类化合物的抗心律失常活性与分子中的原子轨道杂化程度和氮原子对分子ＨＯＭＯ和ＬＵ－ＭＯ的贡献有关，可以看出，氮上的取代不同会引起抗心律失常活性的不同     

基于网络药理学探讨独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎的作用机制*

目的 基于网络药理学的方法分析和预测独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎可能的作用机制。方法 利用TCMSP数据库获取独活、羌活、细辛的活性成分及靶点,与CTD、NCBI等数据库获取的膝骨关节炎疾病基因靶点映射,构建药物-活性成分-疾病靶点网络。进行MCODE聚类分析,通过Omicshare云平台和DAVID数据库GO、KEGG通路富集分析。结果 从3味药中共筛选出了36个活性成分及205个靶点,主要有山柰酚、 β-谷甾醇、芝麻脂素、异紫花前胡苷等关键成分,AKT1、ESR1、JUN、CASP3等为关键靶点,核心基因有NOS3、ESR1、COX1、NR1I2,关键的生物进程和通路有类固醇激素反应性、活性氧代谢过程、AGE-RAGE通路和TNF通路。结论 独活-羌活-细辛可能通过多成分、多靶点网络来治疗膝骨关节炎。     

欧洲刺柏（Juniper）

活性成分与药理作用欧洲刺柏药用部位是其浆果，具有促水排泄、防腐、抗胃肠胀气和抗风湿作用，还可改善胃功能。用作促水排泄药可增加尿量（水丢失），但不增加钠排泄。成分萜品烯-4-醇可增加肾小球滤过率，但刺激肾。欧洲刺柏浆果对单纯疱疹病毒体外显示抗病毒活性，并具抗真菌活性。动物实验显示，欧洲刺柏浆果提取物具有堕胎、抗生育、抗炎、抗胚胎植入、降血压、升血压和降血糖作用。欧洲刺柏浆果油具有兴奋子宫的活性，以及利尿、胃肠道抗菌和刺激作用，该油对平滑肌有阻止解痉作用。     

矮身材儿童血铅镉锌钙铁铜镁水平分析

目的探讨血铅、镉、锌、钙、铁、铜、镁水平对儿童生长发育的影响。方法通过采用钨舟原子吸收光谱仪测定我院儿保门诊53例矮身材儿童（矮身材组）及53例正常儿童（对照组）末梢静脉血中铅、镉、锌、钙、铁、铜、镁水平,并对其与儿童生长发育关系进行分析。结果矮身材儿童血铅明显高于正常对照组,锌、钙、铁明显低于正常对照组（P〈0．05）。而血镉、铜、镁与对照组则无明显差异。矮身材组血铅男童明显高于女童（P〈0．05）。结论矮身材儿童的生长发育迟缓可能与高血铅,低血锌、钙、铁密切相关。儿童铅中毒防治和合理的膳食结构是降低儿童矮身材发生率的重要措施。     

原子吸收火焰法测定合力康粉剂中钾、钠、钙、镁、锌、铁的含量

目的：采用原子吸收火焰法测定合力康粉剂中钾、钠、钙、镁、锌、铁的含量。方法：用盐酸-硝酸-水(9：1．5：25)混酸湿法水浴加热消化处理样品，硝酸锶作镁离子释放剂，乙炔-空气火焰原子吸收法。结果：钾、钠、钙镁、锌、铁加样回收率与RSD(n=5)分剐为98．3％、0．8％；100．8％、3．2％；101．8％、1．3％；102．5％、2．1％；101．2％、2．8％；97．4％、2．4％。特征浓度分别为(产生0．0044吸收所需要的浓度，μg/m1)0．02、0．01、0．07、0．003、0．0l、0．06。结论：该方法简便、快速、结果准确，适用于合力康粉剂粉剂中钾、钠、钙、镁、锌、铁的含量测定。