与机械牵张盆底肛提肌卫星细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化抗原和结蛋白表达的影响

目的研究与机械牵张的盆底肛提肌卫星细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成肌分化的影响;探索在体外条件下诱导BMSCs向肌细胞分化的微环境的创建以及成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)和结蛋白(des minfilament,Desmin)蛋白的表达。方法选择7 d龄SD大鼠,利用密度梯度离心法体外分离纯化大鼠BMSCs。取大鼠盆底肛提肌组织,自行分离传代,获得大鼠盆底肛提肌卫星细胞。对第3代盆底肛提肌卫星细胞施以10%形变,1 Hz,12 h的周期性单向机械牵张刺激,机械牵张后的盆底肛提肌卫星细胞与纯化培养后的第4代BMSCs间接共培养6d。采用实时定量RT-PCR方法检测共培养后BMSCs中MyoD和Desmin mRNA的表达情况;Western-blot法检测MyoD和Desmin的蛋白含量。结果与对照组相比,共培养组和机械牵张共培养组BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达水平均有显著增高(P0.05);与共培养组相比,机械牵张共培养组BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达量也有显著增高(P0.05)。结论与机械牵张刺激的盆底肛提肌卫星细胞间接共培养可以促进BMSCs合成MyoD和Desmin,诱导BMSCs向肌细胞分化。     

骨髓间充质干细胞体外分化过程中细胞周期蛋白的表达变化

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向分化为多巴胺(DA)能神经元过程中细胞周期相关蛋白的表达变化。方法:体外分离、扩增和鉴定大鼠骨髓MSCs。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h后,用1μmol/L全反式维甲酸(ATRA)和50 ng/ml GDNF联合诱导6 d,检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)、细胞周期蛋白(Cyclin)B1的表达。结果:诱导后大鼠骨髓MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,大鼠MSCs经诱导后PCNA、CDK2、Cyclin B1的表达均较对照组明显减弱,Bcl-2表达与对照组无明显差别。结论:骨髓间充质干细胞体外开始分化后细胞增殖力下降。     

组蛋白乙酰化/去乙酰化失衡对C2C12肌原细胞成肌分化的影响

目的探讨组蛋白乙酰化/去乙酰化在C2C12肌细胞分化过程中的作用。方法选择C2C12肌原细胞为研究对象,按照培养基及干预条件的不同,将其分为对照组、马血清诱导分化组、1mmol/L丙戊酸（VPA）组、2mmol/L VPA组、4mmol/L VPA组及8mmol/L VPA组,每组样品数为6个,其培养基内分别含10%胎牛血清、2%马血清、2%马血清＋1mmol/L VPA、2%马血清＋2mmol/L VPA、2%马血清＋4mmol/L VPA及2%马血清＋8mmol/L VPA。比较不同浓度VPA组与马血清诱导分化组肌小管分化率差异。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）与Western蛋白质印迹法（Western blotting）检测肌相关蛋白[包括肌球蛋白（Myosin）、肌钙蛋白（Troponin）I-SS、成肌细胞分化（Myod）1蛋白]和组蛋白去乙酰化酶（HDAC,包括HDAC1,2,3）在C2C12细胞分化过程中及使用不同浓度VPA干预C2C12细胞分化过程中的转录及蛋白表达水平,并比较其表达水平差异。结果本研究结果为：1马血清诱导分化组较对照组的肌相关蛋白mRNA和蛋白表达水平均显著升高,且差异有统计学意义（P〈0.01）;而HDAC mRNA和蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。2各浓度VPA组肌小管分化率分别较马血清诱导分化组显著下降,且差异有统计学意义（P〈0.05）。34mmol/L VPA组及8mmol/L VPA组肌相关蛋白及HDAC mRNA和蛋白表达水平分别较马血清诱导分化组显著下降,且差异有统计学意义（P〈0.05）;4给予VPA干预后,不同浓度VPA组C2C12细胞的Myosin、Troponin ISS、Myod1、HDAC1,2,3的mRNA及蛋白表达水平均呈浓度依赖性,随着VPA浓度增加,表达水平逐步下降（r=-0.92,-0.89,-0.93,-0.84,-0.93,-0.97;r=-0.99,-0.86,-0.92,-0.95,-0.91,-0.96;均为P〈0.05）。结论组蛋白乙酰化/去乙酰化在C2C12肌原细胞成肌分化过程中具有重要意义,HDAC表达抑制可导致肌相关蛋白表达水平下降,进而抑制成肌分化。     

抗心肌肌凝蛋白重链自身抗体IgG亚类与腹主动脉缩窄、冠状动脉结扎术后大鼠慢性心力衰竭的关系

目的 研究抗心肌肌凝蛋白重链自身抗体(AMHCA)IgG亚类的产生与腹主动脉缩窄(AAC)、冠状动脉结扎(LCL)术后大鼠慢性心力衰竭(CHF)之间的关系.方法 应用AAC术与LCL术建立两种CHF大鼠模型,以合成的大鼠心肌肌凝蛋白重链部分肽段(1135-1150位氨基酸残基)为合成肽抗原,采用间接ELISA方法检测大鼠血清中AMHCA IgG亚类的水平及动态变化.结果 两组模型大鼠手术处理后1-2周AMHCA IgG1、IgG2a和IgG2b亚类阳性率较手术完成时均增高(P＜0.05).两组大鼠模型术后1～2周IgG1、IgG2a和IgG2b自身抗体阳性率和抗体滴度开始增高,3～4周达峰值,5～6周后缓慢下降.结论 AAC和LCL组大鼠模型在CHF的发生、发展过程中均有AMHCA IgG亚类的产生,并呈产生、维持、衰减的动态变化.     

肌营养不良蛋白在假肥大肌营养不良双生子肌组织中的表达

[目的]假肥大肌营养不良是男性最常见的X-连锁隐性遗传病,而肌营养不良蛋白(dystrophin)在DMD患者肌细胞上的表达异常是导致该病发生的最根本的病理生理机制。[方法]应用兔抗Anti5-7多克隆抗血清及免疫组化技术检测dystrophin在两对DMD孪生子肌组织中的表达。[结果]显示dystrophin在无症状的孪生子肌组织中存在着阳性表达,而在DMD患儿肌组织中则表达缺失。[结论]检测肌细胞膜上dystrophin蛋白的表达对DMD患者的诊断及预后判定有着重要的应用价值。     

蛋白质摄入量对肺气肿大鼠膈肌形态及功能的影响

为观察不同水平蛋白质摄入对肺气肿膈肌形态及功能的影响 ,将 5 0只SD大鼠随机分为 5组 ,每组 10只 ,2个对照组 (C1和C2 )大鼠注入生理盐水 ,3个实验组 (E、HP和LP组 )大鼠经气管一次注入弹性蛋白酶 75 0U kgBW制造肺气肿模型。 6周后处死C1和E组 ,HP组 (高蛋白组 )和LP组 (低蛋白组 )分别再给予 2 4%和 8%酪蛋白饲料 10周 ,C2组大鼠给予第四军医大学动物中心常备饲料。结果显示 ,E组肺总容量、平均肺泡面积显著增大 (P <0 0 5 ) ,符合肺气肿改变。E组膈肌收缩力增强 ,2 0Hz刺激的收缩力与最大收缩力之比 (F2 0 Fmax)增高 (P <0 0 1)。慢颤搐纤维横截面积增大 (P <0 0 1)。LP组膈肌收缩力显著降低 (P <0 0 5 )。提示肺气肿对膈肌功能、形态有显著影响。低蛋白饲料减低肺气肿大鼠膈肌收缩力 ,高蛋白摄入有利于维持肺气肿膈肌功能     

抗肌萎蛋白缺陷型肌营养不良症25例临床和病理研究

目的探讨两种类型的抗肌萎蛋白(dystrophin)缺陷型肌营养不良症的临床表现、电生理和病理特点。方法根据dystrophin免疫组化染色,将25例肌营养不良患儿分为Duchenne型(DMD)和Becker型(BMD),各为11例和14例。对其临床、电生理和病理学特点进行对比分析。结果DMD发病年龄为(3.9±1.15)岁,磷酸肌酸激酶(CK)升高30～126倍,dystrophin完全缺失;BMD为(7.2±3.38)岁和2～35倍,dystrophin部分缺失。两型肌电图为肌源性损害,在光镜都有肌纤维变性坏死、opacqe肌纤维,结缔组织增生,吞噬和再生现象。透射电镜可观察到肌丝排列紊乱、肌浆网扩张、线粒体肿胀、肌浆膜缺损,肌原纤维溶解坏死、Z线排列紊乱等;但DMD损伤较BMD重。结论DMD和BMD都是抗肌萎蛋白缺陷所致,DMD的临床症状和病理改变都较BMD重。     

全反式视黄酸在骨髓间充质干细胞向神经元分化中的作用研究

目的:探讨全反式视黄酸(ATRA)在骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元分化中的作用及机制。方法:大鼠MSCs在体外培养5～7代后,用0.5μmol/L的ATRA预诱导24h,再换用改良的神经细胞培养基(MNM)作用18h;对照组不用ATRA预诱导,直接用MNM培养。免疫组化检测不同组别巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元特异性核心抗原(NeuN)和微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达情况;ATRA作用前后检测细胞增殖周期和视黄酸受体β(RARβ)的变化。结果:1.ATRA预诱导组巢蛋白、NSE、NeuN和MAP-2的阳性比例明显高于对照组。2.ATRA作用前后,MSCs细胞增殖周期无明显改变。3.MSCs不表达RARβ,用ATRA预诱导细胞后,RARβ表达增加,阳性比例为(20.3±4.2)%。结论:ATRA可能通过RARβ介导靶基因的转录,促进MSCs向神经元分化。     

压力性尿失禁大鼠耻尾肌及泌尿生殖道结构和神经分布的变化

目的:观察压力性尿失禁大鼠耻尾肌和泌尿生殖道结构变化,并通过探寻蛋白基因产物9.5(PGP9.5)及神经肽Y(NPY)的分布变化为压力性尿失禁盆底失神经支配学说寻找进一步证据。方法:取SUI模型大鼠及正常大鼠的耻尾肌、阴道前壁及尿道标本光镜下观察其组织学、形态学差异,并用免疫组化的方法检测标本中PGP9.5、NPY表达情况。结果:①通过模拟产伤和绝经可以获得压力性尿失禁的动物模型。对该模型进行尿动力学检查,最大膀胱容量和漏点压均小于正常对照组(P<0.05)。②HE染色显示,模型组耻尾肌、阴道前壁及尿道形态与对照组存在相似的改变,即肌肉含量减少、肌纤维萎缩变性、神经数量下降。③免疫组化染色显示,PGP9.5和NPY存在于耻尾肌及泌尿生殖道结构中,且与对照组比较,模型组中PGP9.5和NPY染色强度显著降低(P<0.05)。结论:盆底肌肉及泌尿生殖道结构改变和神经源性损伤与SUI发生有关。     

胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定

目的 探讨胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定的方法,为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础. 方法 Sprague-Dawley大鼠孕18 d时剖宫取出胎鼠,手术显微镜下取胎鼠四肢骨骼肌肌肉,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离胎鼠骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法进行纯化.原代培养的生长培养基为(DMEM/F12+ 20％ FBS+ 10％ HS+5 ng/ml bFGF).分化培养基为(DMEM/F12+ 2％ HS).CCK-8法绘制胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线图,细胞免疫组化染色鉴定纯化后细胞的肌源性标志蛋白Desmin,观察分化培养基条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性. 结果 胎鼠原代骨骼肌卫星细胞在培养的第3天进入对数生长期,5～6d达增殖平台期;纯化后的细胞90％以上表达结蛋白(Desmin).在分化培养基的诱导下细胞之间相互融合形成具有自发节律性收缩特性的多核肌管. 结论 采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞,能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞.     

补肾法诱导间充质干细胞向神经方向分化研究

目的　在干细胞具先天之精属性新理论指导下 ,探讨补肾中药龟板对间充质干细胞的体外诱导作用。方法　体外分离培养间充质干细胞 ,以龟板水煎液对其进行体外诱导 ,免疫组化鉴定NSE、Nestin、GFAP等标志。结果　龟板可体外诱导间充质干细胞转分化为神经干细胞 ,但还没有被诱导为神经元样细胞与星形胶质细胞。结论　补肾法可促进干细胞之间的相互转换 ,初步验证了干细胞具先天之精属性新理论。     

骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内定植研究

目的：观察骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内的定植情况。方法：选择健康SD大鼠34只,按随机数字表法分为MSCs干预组（A组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注MSC 1×106个/mL）,肺气肿模型组（B组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注等体积PBS）及MSC对照组（C组,10只,正常大鼠,尾静脉输注MSCs 1×106个/mL）,正常对照组（D组,4只,正常大鼠,尾静脉输注等体积PBS）,采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠来源的MSCs,经GFP标记细胞后将其经尾静脉注入肺气肿模型SD大鼠体内,24 h内处死大鼠,取肺组织迅速冰冻切片,共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。结果：成功培养具有分化潜能的骨髓间充质干细胞,MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志,仅有0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型;成功复制大鼠肺气肿模型,香烟烟雾暴露组（A、B组）平均肺泡间隔为（119.0±26.2）μm,高于对照组（C、D组）的（89.8±17.3）μm,差异有统计学意义（P〈0.05）;平均肺泡数为（173.9±68.3）个/mm2低于对照组的（280.3±104.0）个/mm2,差异有统计学意义（P〈0.05）;显微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后可见A组大鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs,而B组、C组及D组均未见转染荧光。结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入后可在肺气肿模型大鼠肺内定植,为MSCs治疗慢阻肺可能提供理论依据。     

胶原-聚羟基乙酸与骨髓间质干细胞的细胞相容性研究

目的　研究胶原 -聚羟基乙酸与骨髓间质干细胞的细胞相容性 ,为构建组织工程化肌腱提供实验基础。方法　分离、培养并鉴定骨髓间质干细胞 ,将骨髓间质干细胞置入含胶原 -聚羟基乙酸的DMEM培基中培养 ,设为实验组 ;将骨髓间质干细胞置入纯DMEM培基中培养 ,设为对照组。比较两组细胞的活性和生长情况 ,并对实验组进行超微结构观察。结果　骨髓间质干细胞接种于胶原 -聚羟基乙酸中后可适应材料生长 ,混合培养后 2周生长良好 ,始终保持 89%以上的细胞活力 ,与对照组比较无显著差别 (P >0 0 5 ) ;在 2周的培养过程中实验组细胞数未发生明显改变 ,而对照组从第 4d开始即发生增殖。透射电镜示实验组细胞培养 14d后仍保持旺盛的分泌功能。结论　骨髓间质干细胞与胶原 -聚羟基乙酸的细胞相容性好。以骨髓间质干细胞为种子细胞 ,以胶原 -聚羟基乙酸为支架可在体外预构组织工程化肌腱。     

自体骨髓基质干细胞移植联合EPO治疗脊髓损伤的研究

目的：探讨自体骨髓基质干细胞（MSCs）移植联合促红细胞生成素（EPO）对大鼠脊髓损伤（SCI）治疗的效果。方法：培养与纯化骨髓基质干细胞。80只SD大鼠制备脊髓损伤模型,随机分为4组：干细胞移植组、EPO组、联合组和对照组。采用BBB法进行运动能力评分和组织切片观察来评定修复情况。结果：三个实验组与对照组相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）,三个实验组均可明显促进大鼠运动功能和损伤后组织结构的恢复,其中联合组效果更显著。结论：骨髓基质干细胞移植联合EPO具有促进大鼠脊髓损伤后神经功能的修复。     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)对体外骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)细胞增殖与分化潜能的影响。方法:从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,透射电镜下观察诱导前后细胞形态变化;MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响;免疫细胞化学方法检测Actin(α-Sarcomeric)、Desmin、Myoglobin、NSE、GFAP的表达。结果:5-aza对MSCs有抑制作用,在透射电镜下观察可见有心肌样细胞和神经元样细胞的形态变化。免疫细胞化学检测结果表明,MSCs经5-aza诱导14dactin、desmin、myoglobin、NSE和GFAP的表达均较对照组显著增高,P0.01。结论:5-aza对MSCs细胞生长有抑制作用,MSCs被5-aza诱导分化成心肌样细胞和神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞及其功能的研究

目的体外诱导分化骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)为胰岛样细胞,鉴定诱导细胞并检测其功能。方法取周龄大鼠骨髓细胞,进行MSC培养纯化扩增,用bFGF、EGF、条件培养液、高糖培养液、B27、地塞米松、胰岛素等培养体系诱导MSC向胰岛细胞转化。双硫腙染色鉴定胰岛样细胞;免疫细胞化学鉴定胰岛素抗原表达;Western blot检测胰岛样细胞胰岛素的表达。结果体外诱导的MSCs由长梭形变成多角形并逐渐聚集成团。双硫腙染色细胞团成亮红色,初步表明为胰岛样细胞。诱导的细胞具有胰岛素抗原表达;Western blot检测诱导分化为胰岛样细胞的胰岛素表达阳性。结论骨髓间充质干细胞能够分化成胰岛样细胞,并具有分泌胰岛素的功能。     

牡蛎提取物在高温诱导皮层神经干细胞凋亡中的保护作用

目的探讨牡蛎提取液在高温所致神经干细胞凋亡中的保护作用。方法取孕13d小鼠胚胎大脑皮层细胞培养,采用免疫荧光法检测巢蛋白(nestin)的表达以鉴定神经干细胞,将培养3代的神经干细胞随机分为4组:正常对照组(对照组Ⅰ)和牡蛎保护组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(分别加入2.5、5、10mg/ml的牡蛎提取液),同时设立培养液对照组(对照组Ⅱ,其中无细胞)、培养液+牡蛎提取液对照组(对照组Ⅲ,其中无细胞),各牡蛎保护组及对照组均经过高温处理。用MTT法检测神经干细胞的增殖活性,用蛋白质印迹方法检测神经干细胞凋亡相关蛋白p53的表达。结果(1)原代和传代培养的神经球中,均有细胞表达nestin抗原。(2)牡蛎保护组Ⅱ(0.9410±0.0442)和牡蛎保护组Ⅲ(0.9914±0.0562)中细胞的MTT值明显高于对照组Ⅰ(0.8773±0.0416)。(3)与对照组Ⅰ相比,牡蛎保护组Ⅱ和牡蛎保护组Ⅲ中p53的表达明显下降。结论牡蛎提取液对高温所致神经干细胞的凋亡具有一定的保护作用。     

骨髓间充质干细胞对糖尿病大鼠疗效观察

目的 体外诱导骨髓问充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为胰岛样细胞,用于干预治疗糖尿病大鼠.方法 取周龄大鼠骨髓细胞,进行MSC培养纯化扩增,用bFGF、胰岛素等培养体系诱导MSC向胰岛细胞转化;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞.使用链脲菌素(Streptozotocin,STZ)制作糖尿病大鼠模型,将诱导分化的胰岛样细胞移植至糖尿病模型大鼠,观察干预治疗效果.结果 体外诱导MSCs由长梭形变成多角形并逐渐聚集成圆形,双硫腙染色后细胞团成亮红色,表明为胰岛样细胞.糖尿病模型大鼠移植诱导分化胰岛样细胞1周后,多饮、多尿症状减轻,10 d后,血糖值由(21.352±3.150)mmol/L降低为(14.604±3.236)mmol/L,与对照组(22.256±4.051)mmol/L比较,差异无统计学意义(P>0.05);尿糖值由(18.00±1.00)g/L降低为(8.50±0.25)g/L,与对照组(20.00±0.18)g/L比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 骨髓间充质于细胞可在体外诱导分化为胰岛样细胞;骨髓间充质干细胞诱导分化的胰岛样细胞可以降低糖尿病大鼠血糖、尿糖值水平,可能具有治疗糖尿病作用.     

骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞优化生物活性玻璃的实验研究

目的研究兔成骨细胞在生物活性玻璃复合材料支架中的生长情况,探讨优化组织工程中生物材料支架的实验方法。方法分离并培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),应用成骨诱导剂诱导MSCs向成骨细胞分化、发育;在显微镜下观察细胞形态学变化;通过细胞活性、免疫组化鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。将成骨细胞分别附着在3种不同生物活性玻璃组成的新型材料支架中,进行共培养,观察细胞的变化,从而比较不同生物活性玻璃与成骨细胞的相容性。结果MSCs经成骨诱导剂诱导后:细胞数量明显增多,细胞形态向多角形及类圆形转化。经诱导的兔成骨细胞与生物活性玻璃组成的材料支架融合后,发现兔成骨细胞在孔隙率为75.90%的支架中增殖较慢;在孔隙率为90.20%和94.50%的生物活性玻璃复合材料支架中生长良好,增殖较快,孔隙及周围有大量成骨细胞附着。结论具有适宜孔隙率的生物活性玻璃复合材料有望成为培养人工骨的种子支架,为骨组织工程的临床应用奠定了实验基础。