不同干细胞来源外泌体在牙周再生领域的研究进展

牙周炎是由牙菌斑中的微生物所引起的慢性感染性疾病,可引起牙周支持组织的炎症和破坏,是成年人失牙的最主要原因。良好的菌斑控制可有效抑制炎症进展,然而目前在临床诊疗中,尚难以获得稳定的、令人满意的牙周组织再生。外泌体是真核细胞分泌的一种细胞外膜性微囊泡,可作为干细胞旁分泌活动的一种重要形式参与多种组织的再生。外泌体的应用为牙周组织再生提供了一种新策略,本文对不同干细胞来源外泌体在牙周再生领域的研究进展进行综述。     

骨髓间充质干细胞来源的外泌体促进牙周再生的体外研究

目的    研究人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMMSCs）分泌的外泌体（exosome）对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs）增殖和分化功能的影响,为进一步明确hBMMSCs促进牙周组织再生的机制提供实验基础和证据。方法    分别用酶消化法和离心法培养hPDLSCs和hBMMSCs,并用流式细胞术检测其间充质表面标志物。收集培养的第3代hBMMSCs上清液,利用试剂盒提取exosome,电镜下观察其结构,Western Bolt法检测其CD63表达水平。用hBMMSCs分泌的exosome处理hPDLSCs设为实验组,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测hPDLSCs的增殖情况,克隆形成率检测多克隆形成能力,成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色并定量,同时实时荧光定量PCR（qPCR）检测成骨相关基因表达。结果    流式细胞术检测,hPDLSCs阳性表达CD29、CD44、CD90、CD146和Stro-1,hBMMSCs阳性表达CD29、CD44、CD90和 CD106,两者均阴性表达CD14、CD34和CD45。hBMMSCs分泌的exosome电镜下呈小球状,Western Bolt法检测其强表达CD63。实验组hPDLSCs经MTT法检测其增殖速率和克隆形成能力显著高于对照组（P < 0.05）。实验组hPDLSCs成骨诱导后ALP染色、茜素红染色定量表达显著强于对照组（P < 0.05）。qPCR检测成骨基因Runx2、OCN、ALP、BSP和Col-Ⅰ的表达,实验组显著高于对照组（P < 0.05）。结论    hBMMSCs分泌的exosome可促进牙周膜干细胞的体外增殖和成骨分化能力。     

外泌体在骨髓间充质干细胞骨向分化及其在牙周再生中的研究进展

外泌体是多种细胞在生理或病理状态下分泌到细胞外的纳米级囊泡,富含蛋白质、核酸、脂质等生物活性物质,是细胞间信息交流传递和物质交换转移的重要介质。研究证实,外泌体可通过蛋白、miRNAs等调控干细胞的增殖、分化,在免疫应答、炎症反应等过程中均发挥重要的调节作用。本文就炎性环境下不同细胞来源的外泌体生物学性能及其在成骨分化中的作用作一综述,以期为牙周炎所致骨缺损的治疗方法提供参考。     

外泌体在颞下颌关节软骨再生中的应用前景

颞下颌关节(TMJ)骨性关节炎是由各种原因导致的软骨细胞死亡、软骨基质降解以及软骨下骨破坏所引起.基于间充质干细胞(MSC)的细胞疗法为TMJ软骨再生带来了新的希望,MSC外泌体介导的软骨组织再生技术可以克服MSC扩增时的去分化、植入后再生效率低下以及免疫排斥反应等缺点.本综述介绍了TMJ的结构特点、软骨退化机制、MS...     

人颌骨间充质干细胞的外泌体在巨噬细胞调控中的作用

目的:探讨颌骨骨髓间充质干细胞分泌的外泌体(OMMSCs-Exo)的特性及其在调控巨噬细胞功能中可能发挥的作用.方法:体外培养OMMSCs,检测其克隆形成及多向分化能力.提取上清液中外泌体,透射电镜观察其形态,蛋白印迹法检测其表面特异标志CD63、CD81.将外泌体与巨噬细胞作用24 h后用共聚焦显微镜观察两者的作用方式,实时定量PCR检测外泌体内免疫相关miR-223和miR-let-7c表达及与共培养后巨噬细胞中miRNA表达.结果:人OMMSCs符合间充质干细胞特性,OMMSCs-Exo分泌的外泌体近似圆形,直径在60~160 nm 之间,表达表面标志CD63、CD81:内含有与巨噬细胞调控相关的miRNA 如miR-223 和miR-let-7c 等,能被巨噬细胞吞噬,共培养后巨噬细胞中miR-223含量增加.结论:人OMMSCs-Exo及其携带的miRNA可能参与了巨噬细胞功能的调控.     

ALPL依赖外泌体途径调控BMMSCs诱导内皮细胞管腔形成

目的:探究ALPL基因在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)诱导血管内皮细胞(ECs)管腔形成的作用方式.方法:首先对正常人BMMSCs(Nor-hBMMSCs)、低碱性磷酸酯酶症(HPP)患者BMMSCs(HPP-hBMMSCs)进行多向分化鉴定.其次以Nor-hBMMSCs为对照组,HPP-hBMMSCs及通过慢病毒浸...     

骨髓间充质干细胞外泌体调控STAT3通路促进牙周膜干细胞成骨分化

目的:研究骨髓间充质干细胞(BMMSCs)外泌体调控信号转导与转录激活因子3(STAT3)通路促进牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的作用及机制.方法:原代培养BMMSCs和PDLSCs,取第3代BMMSCs细胞分离外泌体,取第3代PDLSCs细胞进行成骨诱导并分组,外泌体组加入15μg/mL重悬于磷酸盐缓冲液(PB...     

外泌体在牙周再生应用的研究进展

牙周病在中国人群中的患病率高达90%以上,现有治疗技术仅能控制疾病发展,诱导骨组织再生能力成为治疗的希望和难点。外泌体是一类来源于核内体的多囊泡结构物,近年来将其应用于牙周再生领域的研究越来越多。该文将近年来外泌体在牙周再生领域的应用进行综述,有望为牙周再生治疗提供新的思路。     

颌骨骨髓间充质干细胞生物学特性及其影响因素的研究进展

颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cell,JBMMSC)是存在于上下颌骨内的一种具有较强增殖能力和多向分化潜能的成体干细胞。病理因素、理化因素及生物因素均可影响JBMMSC的生物学特性。由于组织来源和成骨方式不同,相比来源于长骨的骨髓间充质干细胞,JBMMSC的生物学特性具有部位特异性,相同的影响因子对两种细胞的影响程度也不同。同时JBMMSC还具有取材方便、创伤小、免疫原性低等特点,在颅颌面骨缺损修复、牙周组织再生以及提高口腔种植术后成功率等方面具有广阔的应用前景,在基础和临床研究中引起广泛的关注。但关于JBMMSC增殖和分化的调节机制始终不清晰,影响了其作为种子细胞的应用。本文对JBMMSC生物学特性、影响因素以及在临床与基础研究中的应用进展进行综述,以期为相关基础及临床研究提供依据。     

自体骨髓间充质干细胞移植对小型猪下颌骨放射性骨坏死的预防作用

目的：观察和分析自体骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）静脉输注移植是否对小型猪下颌骨放射性骨坏死（ osteoradionecrosis,ORN）有预防作用。方法照射前1个月分离培养扩增BMMSCs,在照射后不同时点实验组进行自体BMMSCs静脉输注移植,对照组静脉输注同体积不含细胞的细胞培养液。照射2个月后拔除左侧下颌第一恒磨牙,通过肉眼、CT以及组织病理学观察小型猪动物模型下颌骨是否发生ORN。结果照射2个月拔牙创伤后,两组动物均出现了组织水肿、皮肤溃烂、骨质破坏等。5个月后实验组动物皮肤愈合,随后CT显示破坏骨质修复,组织病理学显示为接近正常的骨组织,而对照组动物下颌骨仍呈典型ORN表现。结论自体BMMSCs移植对下颌骨ORN有一定的预防作用,其预防机制尚有待进一步研究。     

The distinctive jaw and alveolar bone regeneration

The skeletal system is structurally and functionally unique. It can be referred to as connective tissue that lost its ability to resist mineralization as mineralization in any other connective tissues is heterotopic. In addition to providing support for muscular attachments, the skeletal system protects nerves and harbors the hematopoietic and mesenchymal stem cells within the bone marrow compartment. However, there are distinct phenotypic and functional differences between the orofacial skeleton compared to axial and appendicular skeleton. How different is the jaw bone from other non‐craniofacial bones? Interestingly, developmental, biological, and clinical outcomes point to distinctive features that make the jaw bone unique.     

脂肪间充质干细胞条件培养基及其外泌体促成骨作用的体外研究

目的研究大鼠脂肪间充质干细胞（ASC）条件培养基及其外泌体的体外促成骨作用。 方法分离培养原代大鼠ASC和骨髓间充质干细胞（BMSC）并进行鉴定;超速离心法收集/去除条件培养基中的外泌体,采用透射电镜法及粒径分析法鉴定所获取的外泌体;细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测其对细胞增殖的影响;Transwell检测其对细胞迁移的影响;碱性磷酸酶（ALP）活性实验和实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测其对成骨的影响。SPSS 20.0软件、Bonferroni检验进行统计学分析。 结果实验所获取的原代BMSC和ASC符合间充质干细胞鉴定标准。透射电镜及粒径分析结果表明所获取的外泌体具有典型的外泌体形态特征。CCK-8实验表明培养7 d后,各处理组中A₄50值存在差异（F= 157.74,P= 0.001）,BMSC增殖条件培养基组A₄₅₀值（2.71 ± 0.15）高于对照组（1.95 ± 0.11）;去外泌体组的A₄₅₀值（2.28 ± 0.34）低于条件培养基组。Transwell实验结果表明,培养24 h后各处理组中的迁移细胞数存在差异（F= 46.79,P= 0.001）,条件培养基组迁移细胞数（51.6 ± 1.3）高于对照组（28.6 ± 1.4）,去外泌体组迁移的细胞数（37.2 ± 2.2）低于条件培养基组。ALP活性实验结果表明,培养7 d后各处理组中的ALP活性存在差异（F= 78.43,P= 0.001）,条件培养基组ALP活性为（310 ± 11）,高于对照组（200 ± 24）,去外泌体组ALP活性为（240 ± 19）低于条件培养基组。实时荧光定量PCR检测成骨相关基因的表达,各处理组中的基因表达存在差异（F_ALP= 32.30,P_ALP= 0.001;F_RUNX2= 26.78,P_RUNX2= 0.001）。 结论成骨诱导后大鼠ASC条件培养基及其中的外泌体能够有效的促进BMSC增殖、迁移和成骨向分化,具有体外促成骨作用。     

Mesenchymal stem cells and their challenges for bone regeneration and osseointegration

Bone regeneration is an indispensable procedure for implant placement. Original techniques based on mesenchymal stromal cell (MSC) therapy are emerging with the goal of speeding up biology, thereby reducing the osseointegration period. Many products found their way in clinical application, yet their reliability remains uncertain because many in vitro culture-related challenges are facing these cells once they are out of their biologic environment. In this commentary, these limitations are discussed with the emphasis of their impact on the performance of MSCs. Clinicians should be aware of these issues before implementing this cell-based regenerative technique.     

Neural Regeneration/Remodeling in Engineered Coronal Pulp Tissue in the Rat Molar

IntroductionThis study aimed to examine the process of reinnervation during coronal pulp tissue regeneration in a rat model in which rat bone marrow mesenchymal stem cells were implanted in pulpotomized molars.MethodsThe maxillary first molars of Wistar rats were pulpotomized, and preformed biodegradable porous poly L-lactic acid scaffolds and hydrogel carrying rat bone marrow mesenchymal stem cells were implanted in the pulp chamber. After 3, 7, and 14 days, the implanted teeth were processed for histologic analysis; immunoperoxidase staining for protein gene product 9.5 (a general neuronal marker), calcitonin gene-related peptide (CGRP), or substance P (SP); and real-time polymerase chain reaction for nerve growth factor (NGF) and growth-associated protein 43 (GAP-43) messenger RNA (mRNA) expression.ResultsHistologic analysis of the implanted region revealed sparse cellular distribution at 3 days, pulplike tissue with a thin dentin bridge–like structure at 7 days, and dentin bridge–like mineralized tissue formation and resorption of most scaffolds at 14 days. Protein gene product 9.5 and CGRP-immunoreactive nerve fibers showed the lowest density at 3 days and significantly increased until 14 days when the CGRP-immunoreactive fibers reached normal levels. SP-immunoreactive nerve fibers showed the highest density at 7 days and decreased to normal levels at 14 days. NGF mRNA increased with time, whereas GAP-43 mRNA levels peaked at 3 days and subsequently dropped until 14 days.ConclusionsRegeneration/remodeling of SP-immunoreactive and CGRP-immunoreactive nerve fibers with increased mRNA expression of NGF and GAP-43 occurred in a rat model of coronal pulp tissue engineering with bone marrow mesenchymal stem cells.     

兔骨髓间充质干细胞修复面神经缺损的初步研究

目的:初步观察骨髓间充质干细胞(MSCs)在面神经缺损修复中的作用。方法:抽取兔骨髓液经Percoll液离心得到单个核细胞,经体外培养、纯化后获得兔骨髓MSCs。15只新西兰白兔的两侧面神经上颊支分别造成12mm的缺损,一侧硅胶管套管连接后植入MSCs,另一侧单纯硅胶管套管。于术后第4、8、16周行大体观察,测定神经传导速度,处死动物后作组织学检查。结果:第4周时双侧管内未见明显再生神经纤维;第8周和16周时,双侧管内可见再生神经纤维。神经电生理测定和有髓神经纤维计数结果显示,MSCs侧优于单纯套管侧(P<0.05)。结论:MSCs可促进面神经缺损的修复,提示MSCs可应用于修复外周神经缺损。     

脂多糖刺激人牙髓干细胞分泌的外泌体联合基质细胞衍生因子-1对牙髓再生的影响

目的探讨轻度炎症状态下人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,hDPSC)产生的外泌体与基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)联合应用对牙髓组织再生的影响。方法分离培养hDPSC,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激hDPSC,超速离心法提取hDPSC经LPS刺激后产生的外泌体(exosomes from lipopolysaccharide-stimulated hDPSC,L-EXO)和正常状态下分泌的外泌体(exosome from normal hDPSC,N-EXO),通过透射电镜和蛋白质印迹法鉴定提取物。将40只6~8周龄的SD大鼠通过随机数字表法分为S组(单独应用SDF-1)、L+S组(SDF-1与L-EXO联合应用)、N+S组(SDF-1与N-EXO联合应用)和空白对照组(根管内不植入任何物质),每组10只。以双侧下颌第一磨牙为实验牙,建立大鼠无髓根管模型,根据分组分别在根管内植入不同的内容物。植入后30 d过量麻醉处死所有大鼠,取大鼠双侧下颌骨组织,应用HE、Masson及免疫组织化学染色法进行组织学评价。结果HE染色结果显示,除空白对照组外,其他3组根管内均可见新生牙髓样组织,其中L+S组根管内新生组织的量及组织中的细胞数量最多,S组最少。Masson染色结果显示,L+S组矿化组织沿根管壁纵向排列,胶原纤维有序排列,N+S组呈无规律紊乱分布。定量分析各组新生血管面积,结果显示L+S组血管密度[(2.03±0.65)%]显著高于S组[(0.65±0.05)%]及N+S组[(1.06±0.38)%](F=5.879,P<0.05)。免疫组织化学结果显示,S组及L+S组的趋化因子受体4表达量显著低于N+S组(F=8.633,P<0.01)。结论hDPSC分泌的外泌体联合SDF-1可提高根管内新生组织的量和组织中的血管密度,L-EXO的作用较N-EXO强,并且新生组织中胶原纤维及矿化组织的排列更规律有序。