干燥综合征患者抗血小板生成素受体抗体与血小板减少的相关性研究

目的分析干燥综合征（primary Sj gren＇s syndrome, PSS）患者抗血小板生成素（thrombopoietin;TPO）受体（c-mpl）抗体与血小板减少的相关性和作用,探讨抗体的致病机制和临床意义。方法选取PSS伴有血小板减少患者40例（A组）、无血小板减少患者40例（B组）,以及同期住院的抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome,APS）患者40例（C组）、无血小板减少的系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者24例（D组）、正常体检的健康志愿者40例（E组）,应用酶联免疫吸附法（enzyme—linked immuno sorbent assay,ELISA）检测血清TPO水平;间接ELISA法测定抗c-mpl抗体水平,分析其与临床表现、指标之间的相关性和意义。结果①血清抗c—mpl抗体在A、B、C、D和E组中的检出率分别为62．5％、27．5％、12．5％、12．5％和0,组间比较差异有统计学意义（P〈0．001）;单独比较A组与B组血清抗c-mpl抗体及血清TPO水平差异均有统计学意义（P值分别为0．001和0．004）。②PSS患者抗c—mpl抗体与抗SSA抗体具有相关性（P〈0．05）,与ESR、IgG、IgA水平呈线性正相关（P〈0．05）,与血小板计数负相关（r=-0．32,P=0．004）,与骨髓增生分化无相关性,而与巨核细胞成熟障碍、骨髓血小板生成减少相关（P〈0．05）。结论抗c—mpl抗体可能与PSS血小板减少相关,骨髓巨核细胞成熟障碍血小板产量减少可能是抗c-mpl抗体致病作用途径。     

17-DMAG对人LX2肝星状细胞增殖及凋亡作用的研究

目的研究HSP90抑制剂17-DMAG在体外对人LX2肝星状细胞生长增殖及细胞凋亡的作用。方法 ?体外培养人LX2肝星状细胞,用细胞毒试验法(MTT)观察不同浓度和作用时间的17-DMAG对LX2细胞的生长抑制作用;流式细胞仪检测药物作用后LX2细胞凋亡的发生;Western blot检测α-SMA的表达,并与对照组进行对比。结果 17-DMAG能抑制人LX2肝星状细胞生长,且呈浓度和时间依赖性(P<0.01),随药物浓度加大和作用时间延长,存活细胞数量逐渐减少;流式细胞仪证实17-DMAG可诱导LX2细胞凋亡,与对照组比较,实验组细胞凋亡率明显增加(P<0.01);Western blot可以证实17-DMAG可使LX2细胞α-SMA表达减少,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 17-DMAG可呈浓度和时间依赖性的抑制人LX2肝星状细胞的生长,其机制为诱导细胞凋亡,并且通过这种机制来减少α-SMA的表达来抑制胶原的产生。     

血小板生成素通过PI3K/AKT通路防止CoCl_2诱导内皮细胞凋亡

目的:研究血小板生成素(TPO)对化学性缺氧模拟剂氯化钴(CoCl_2)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的作用及其机制。方法:实验分为4组,体外培养的未经处理的HUVEC为对照组,CoCl_2与HUVEC共培养的为CoCl_2组,在加入CoCl_2前用TPO预处理HUVEC为TPO+CoCl_2组,TPO单独处理HUVEC为TPO组。使用CCK-8法检测各组细胞的细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率、凋亡蛋白酶Caspase-3的表达以及线粒体膜电位的变化。Western blot检测TPO对AKT通路磷酸化水平表达的影响。结果:CoCl_2可以明显抑制HUVEC的生长,细胞存活率随着CoCl_2的浓度的升高逐渐下降(r=-0.997);与对照组相比较,CoCl_2组的细胞凋亡率明显升高(P0.001),而TPO+CoCl_2组的细胞凋亡率较前者明显下降(P0.001),提示TPO对HUVEC有保护作用。TPO还能减少细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的表达和抑制细胞线粒体膜电位的降低,以及刺激HUVEC PI3K/AKT通路的活化。结论:TPO具有防止化学性缺氧所致的细胞凋亡作用,其机制可能是通过活化PI3K/AKT通路,从而减少细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活化表达和稳定线粒体膜电位来发挥细胞保护作用。     

CAG方案清除T细胞急性淋巴细胞白血病细胞株A3细胞作用机制的研究

本研究主要探讨CAG方案清除T细胞性急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞株A3细胞的作用机制及G-CSF／G—CSFR配体受体系统在清除过程中的作用。以单克隆抗体结合流式细胞术测定A3细胞表面G—CSFR表达率；以A3细胞为体外实验模型，分组加入不同浓度的G—CSF作用48小时后收集细胞，碘化丙锭细胞核染色法分析细胞周期变化；用Cell Counting Kit（CCK-8）检测不同浓度阿糖胞苷（Ara—C）和G-CSF组合作用48小时后对细胞生长抑制率的影响；用AnnexinV试剂盒结合流式细胞术检测Ara—C、阿克拉霉素（ACR）及G-CSF联合作用48小时后细胞凋亡水平。结果表明：T—ALL细胞株A3细胞表面高表达G—CSFR（94．2％）；G—CSF作用48小时后S期A3细胞比例在一定浓度范围内随G—CSF浓度的增加而升高；CCK-8检测显示Ara—C＋G—CSF组较单药Ara—C组抑制细胞生长更明显（Ara—C浓度10^-5mmol／L和10^-6mmol／L时P〈0．05）；凋亡检测显示Ara—C＋ACR＋G-CSF组细胞早期凋亡率高达38％，显著高于Ara—C＋ACR组。结论：T—ALL细胞株A3细胞表面高表达G-CSFR；G-CSF／G—CSFR配体受体系统在CAG方案清除A3细胞的过程中与化疗药物具有协同作用，即通过动员G0期细胞进入细胞增殖周期使细胞对化疗药物的敏感性增强、导致细胞凋亡，从而清除细胞。诱导凋亡是CAG方案清除T—ALL细胞株A3细胞的机制之一。     

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液体外扩增胚胎及成体造血干/祖细胞的差异及其机制探讨

本研究比较小鼠骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)联合FL和TPO对卵黄囊和骨髓造血干／祖细胞体外生长的影响，并对其机制进行探讨。取卵黄囊和骨髓单细胞悬液，对照组中加入含10％FBS的DMEM，实验组分别加入10％mBMEC-CM，FL(5ng/ml)和TPO(2ng／ml)，10％mBMEC-CM复合FL和TPO培养24小时后进行集落培养，计数CFU-GM和HPP-CFC的集落数。应用Atlas cDNA Expression Array对卵黄囊和骨髓造血细胞表达的细胞因子受体进行检测。结果表明：mBMEC-CM能扩增卵黄囊和骨髓CFU-GM和HPP-CFC，其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强；mBMEC-CM扩增骨髓CFU-GM和HPP-CFC的能力明显强于其扩增卵黄囊CFU-GM和HPP-CFC的能力。检测到小鼠卵黄囊及骨髓造血细胞存在差异表达的细胞因子受体；卵黄囊造血细胞表达PDGF-Rβ，PDGF-Ra和促肾上腺皮质激素释放因子受体，而在骨髓造血细胞中未检测到上述受体的表达；在骨髓造血细胞中表达的IFN-γR，GM-CSFR，多巴胺D2受体和卵泡刺激素受体则未在卵黄囊造血细胞中检测到mRNA的表达。结论：mBMEC-CM能支持卵黄囊和骨髓造血祖细胞的体外扩增，其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强；mBMEC-CM对骨髓造血祖细胞表现出更强的扩增作用。检测到卵黄囊和骨髓造血细胞之问存在差异表达的细胞因子受体，提示mBMEC-CM对胚胎及成体造血细胞扩增中存在的差异可能与两种造血细胞存在差异表达的细胞因子受体有关。     

人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的：构建胰岛索样生长因子1（insulin growth faetor 1，IGF-1）的真核细胞表达质粒，转染神经胶质瘤细胞（C6细胞），建五hIGF-1稳定表达细胞株，为进一步观察胰岛索样生长因子1基因体内转染后对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响打下基础。方法：实验于2004-05／09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室进行，用聚合酶链反应方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF—1cDNA，然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中，酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的hIGF-1基因序列；使用C6细胞株，用脂质体方法转染C6细胞。经G418筛选，形成阳性细胞克隆。继续培养4周，进行Western blot检测。结果：重组的真核细胞表达质粒pcDNA3．1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。Western blot检测结果证实转染的hIGF-1基因在C6细胞内成功表达。结论：实验所构建的重组真核细胞表达载体pcDNA3．1-hIGF-1能够稳定表达有活性的hIGF-1，实验结果对进一步观察脊髓损伤后胰岛素样生长因子1抑制神经细胞凋亡的作用有一定意义。     

基质细胞抑制HL-60细胞凋亡机制初探

骨髓基质细胞在造血调控方面发挥重要作用。为探讨骨髓基质细胞对骨髓白血病细胞凋亡抑制的作用机制，我们选用小鼠骨髓基质细胞系Hess-5，研究其在髓系白血病细胞HL-60抗凋亡中的作用及其抗凋亡过程中bcl—xL和bcl-2表达水平的变化。     

新型bcl-2反义寡核苷酸F951提高白血病细胞对阿糖胞苷的敏感性

为了研究新型bcl-2反义寡核苷酸F951提高白血病细胞对化疗药物的敏感性，用不同浓度的F951及F951联合小剂量Ara—C与HL-60细胞共培养后，采用台盼蓝拒染法、MTT比色法检测HL-60细胞增殖；用流式细胞术和RT-PCR法检测Bcl-2蛋白及其mRNA表达；以DNA片段化分析和TdT酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞。结果表明，F951与Ara—C联用组细胞生长抑制率最高，药物处理96小时后，台盼蓝拒染率明显低于单纯Ara—C处理组；MTT检测A值与未处理组相比，FNS对照组、Ara—C组、F951组、F951 Ara—C组细胞抑制率分别为：2墙％、27．63％、37．66％、57．24％，F951处理后HL-60细胞Bcl-2mRNA水平下降，Bcl-2蛋白减少，凝胶电泳可见典型的梯形带，F951与Ara—C联用后，诱导DNAladder的作用更加明显，凋亡细胞多见．结论：F951可下调bcl-2基因表达，促进细胞凋亡而增强Ara—C的抗肿瘤作用。     

c-myc在大黄素抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡中的作用

目的研究中药大黄素(emodin)对人髓系白血病细胞株HL-60细胞的影响及探讨c—myc基因在其中的作用。方法应用MTT法绘制细胞生长曲线；细胞集落培养观察大黄素对HL-60细胞增殖的影响；DNA倍体分析、线粒体细胞凋亡检测法、末端缺失原位标记(TUNEL)法及DNA凝胶电泳分析细胞凋亡；RT—PCR及Western blot检测大黄素作用前后c—myc基因mRNA及蛋白表达水平的变化。结果大黄素能明显抑制HL-60细胞增殖，半数抑制浓度(IC50)约为20μmol／L；DNA片段化、亚G1峰(凋亡峰)的检出及线粒体细胞凋亡检测等证实大黄素能有效诱导HL-60细胞凋亡，细胞凋亡率与药物作用浓度呈正相关。大黄素与HL-60细胞作用后c—myc基因mRNA及蛋白的表达水平与作用时间呈负相关。结论大黄素能有效抑制HL-60细胞增殖，诱导其凋亡；c—myc基因可能参与了大黄素抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡的过程。     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨促血小板生成素（TPO）基因修饰的小鼠骨髓基质细胞（BMSCs）对TPO基因的表达的影响。方法用脂质体lipofectamine^TM2000将TPO cDNA真核表达质粒转染至骨髓基质细胞（BMSCs），RT—PCR方法检测TPO mRNA的表达，免疫组化法测定TPO的表达。结果转染TPO基因的BMSCs TPO mRNA及TPO表达量明显高于空载体组（P〈0．01）及未转染组（P〈0．01）。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs，且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO的表达显著上调。     

血小板生成素信号通路的分子机制及对多种细胞的作用

血小板生成素（TPO）是调控巨核细胞增殖、分化和血小板生成的特异性生长因子,同时对早期造血也具有重要的调节作用。研究已经证明,TPO通过与其受体c-mpl结合并激活多种信号通路从而发挥其生物学作用。这些信号通路主要有Jak／STAT,P13K／Akt,Ras／MAPK等。这些信号通路被激活后可以改变一系列下游信号分子的表达水平,例如β-链蛋白、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、骨形态发生蛋白和同源异型框蛋白等。这些信号分子与TPO的生物学效应密切相关。近年来,TPO在体内其他组织和细胞,例如心肌细胞、神经元、血管内皮细胞、成骨细胞和卵巢等组织的作用也受到了关注。本文从TPO生物学作用的分子机制及其对多种细胞的作用进行综述。     

血小板生成素及其受体在急性白血病中的改变

目的 探讨血小板生成素（Ｔｐｏ）受体Ｃ－ｍｐｌ在急性白血病中的表达主其意义以及重组人Ｔｐｏ对急性白血病细胞增殖的影响。方法 采用半定量逆转录,聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测４３例急性白血病患骨髓单个核细胞Ｃ－ｍｐｌ基因的表达,用ＭＴＴ法研究重组人Ｔｐｏ单独或联合某些造血生长因子对急性白血病细胞增殖的影响。结果 ３５例急性髓系白血病（ＡＭＬ）患中有２２例表达Ｃ－ｍｐｌ,各ＦＡＢ亚型无均有表     

RNA干扰人端粒酶hTR基因对HeLa细胞增殖的影响

目的:探讨RNA干扰抑制人端粒酶RNA组分human telomerase RNA component,hTR)的表达时宫颈癌细胞(HeLa细胞)增殖的影响.方法:hTR基因的RNA干扰表达重组体用脂质体介导方法稳定转染HeLa细胞.RTPCR法检测hTR的mRNA表达水平,TRAP-PCR法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖.结果:RT-PCR结果表明,稳定转染RNA干扰表达重组体的细胞株,其hTR基因的mRNA抑制率较无转染对照组下降了(59.7±3.3)%,较转染空载体组下降了(56.3±4.4)%;实验组细胞端粒酶活性下降,生长速度明显减慢.结论:利用RNA干扰技术抑制hTR基因在HeLa细胞的表达能抑制该细胞端粒酶活性和增殖活性.     

cmpl在真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞及血小板上的表达

本研究了解真性红细胞增多症(PV)患者血小板膜及骨髓CD34阳性细胞表面TPO受体(c-mpl)蛋白及骨髓造血细胞c-mpl mRNA表达情况。应用双色流式细胞术检测13例PV患者及15名正常对照者骨髓CD34阳性细胞表面c-mpl蛋白表达;应用单色流式细胞术检测15例PV患者及15名正常对照者血小板表面c-mpl蛋白表达;应用RT-PCR方法检查PV患者及正常对照者骨髓造血细胞c-mpl mRNA的表达情况。结果表明:CD34阳性细胞c-mpl蛋白表达在PV患者为0.99%±0.14%,与正常对照(0.92%±0.12%)相比无差别(p>0.05);血小板c-mpl蛋白表达在PV患者为20.33%±4.84%,与正常对照(23.50%±3.64%)相比无差别(p>0.05);骨髓造血细胞c-mpl mRNA与正常组相比也无明显差别(p>0.05。)结论:PV患者骨髓CD34阳性细胞、血小板膜c-mpl蛋白及骨髓造血细胞c-mpl的mRNA表达无明显异常。     

红景天苷对阿糖胞苷诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨红景天苷（salidroside）对阿糖胞苷（Ara-C）诱导的人骨髓间充质干细胞（humanbonemes-enchymalstemcells,hBMMSCs）凋亡影响及其机制。体外分离培养hBMMSC,流式细胞术鉴定免疫表型,特异性染色鉴定hBMMSC体外向成骨、成脂诱导分化能力,MTT法检测细胞增殖情况。实验分4组：对照组、Ara-C组、sali-droside组、Ara-C＋salidroside组;流式细胞术检测细胞凋亡变化;RT-PCR法检测BCL-2、BAXmRNA表达。结果表明,体外成功分离培养hBMMSC;细胞表达CIM4、CD29和HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA．DR;成骨、成脂诱导21d,茜素红染色可见钙化结节,油红0染色有质滴出现;Ara-C对红景天苷处理的hBMMSC的增殖抑制程度较未经红景天苷处理的hBMMSC明显减低（P〈0．05）;在凋亡方面,Ara-C作用48h后hBMMSC的凋亡率显著高于对照组（P〈0．05）,BCL-2基因表达下调,BAX表达上调;而中剂量红景天苷处理的细胞凋亡率较Ara-C组降低,BCL-2基因表达上调,BAX表达下调（P〈0．05）。结论：红景天苷可抑制Ara-C诱导的hBMMSC凋亡,其机制可能与BCL-2／BAX表达调控有关。     

Physiological regulation of early and late stages of megakaryocytopoiesis by thrombopoietin

Thrombopoietin (TPO) has recently been cloned and shown to regulate megakaryocyte and platelet production by activating the cytokine receptor c-mpl. To determine whether TPO is the only ligand for c-mpl and the major regulator of megakaryocytopoiesis, TPO deficient mice were generated by gene targeting. TPO-/- mice have a >80% decrease in their platelets and megakaryocytes but have normal levels of all the other hematopoietic cell types. A gene dosage effect observed in heterozygous mice suggests that the TPO gene is constitutively expressed and that the circulating TPO level is directly regulated by the platelet mass. Bone marrow from TPO-/- mice have decreased numbers of megakaryocyte-committed progenitors as well as lower ploidy in the megakaryocytes that are present. These results demonstrate that TPO alone is the major physiological regulator of both proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells into mature megakaryocytes but that TPO is not critical to the final step of platelet production.     

Vinculin表达对非小细胞肺癌A549细胞生物学特征的影响

目的通过体外实验探讨非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞系的Vinculin表达对其生物学特征的影响。方法购买人NSCLC A549细胞系,体外培养,分为对照组、空白载体组以及高表达组三组,高表达组A549细胞系转染Vinculin过表达载体,空白载体组A549细胞系转染空白载体。体外培养48 h后,应用RT-PCR检测各组A549细胞系Vinculin mRNA表达情况,应用MTT法检测细胞活性,Ki-67免疫荧光检测细胞增殖能力,Transwell培养体系Hoechst染色观察A549细胞系迁移侵袭能力。结果 RT-PCR检测结果显示,与对照组、空白载体组比较,高表达组Vinculin mRNA表达量明显增高(P<0.01);MTT法检测结果显示,与对照组、空白载体组比较,高表达组的OD值明显降低(P<0.01);Ki-67免疫荧光检测结果显示,与对照组、空白载体组比较,高表达组Ki-67⁺细胞数量明显减少(P<0.01);Transwell培养体系Hoeschst染色结果显示,与对照组、空白载体组比较,高表达组迁移和侵袭的细胞数量明显减少...     

姜黄素对喉癌Hep-2细胞增殖及Bcl-2、Bax基因表达的影响

目的探索姜黄素对喉癌细胞增殖的作用以及对细胞Bcl-2和Bax基因表达的影响。方法 Hep-2细胞暴露于含姜黄素(3-25μM)的培养基中,分别培养24h及48h,用MTT法检测对细胞增殖的影响;用RT-PCR法检测Bcl-2和Bax的mRNA表达水平。结果 MTT显示,姜黄素使Hep-2细胞增殖明显降低,并呈时间-剂量依赖性;RT-PCR结果显示,姜黄素使Bcl-2的mRNA表达水平降低,而使Bax的mRNA表达水平升高,并呈剂量和时间依赖性。结论姜黄素对人喉癌Hep-2细胞增殖具有显著的抑制作用。其作用机制可能与其下调Bcl-2基因表达水平及上调Bax基因表达水平,从而诱导细胞凋亡有关。     

转染人livinα基因对Jurkat细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究人livinα基因表达对Jurkat细胞增殖、凋亡的影响。方法基因转染获得稳定表达livinα的Jurkat细胞克隆（Jurkat/livinα）;MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪分析细胞凋亡率,通过观察细胞生长和凋亡情况,探讨livinα对Jurkat细胞增殖及凋亡的影响;RT-PCR检测细胞中livinα和caspase-3 mRNA的表达。结果Jurkat/livinα组livinαmRNA表达高于对照组（Jurkat细胞组）（P＜0.05）,转染后caspase-3 mRNA受到抑制,表达减弱,细胞生长曲线显示Jurkat/livinα组细胞生长速度增快,倍增时间缩短9-10 h（P＜0.05）,细胞凋亡率计算显示Jurkat/livinα组细胞凋亡率较Jurkat细胞组明显减少（P＜0.01）。结论 livin α基因能促进Jurkat细胞生长,可能通过抑制细胞凋亡而在急性T淋巴细胞白血病发生发展中起重要作用,有望成为白血病治疗的新分子靶点。