芪参益气滴丸联合骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死小鼠血管新生及心功能的影响研究

目的:利用体外细胞分子生物学实验探讨芪参益气滴丸联合骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后小鼠血管生成及心功能的影响.方法:采用C57BL/6J的雄性小鼠,将60只小鼠采用数字随机法分为3组(n=20):心肌梗死组(MI+PBS组)、心肌梗死+间充质干细胞移植组(MI+MSCs组)和心肌梗死+间充质干细胞移植+芪参益气滴丸组...     

人脐带间充质干细胞对脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞对脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建的影响.方法 将3.5×10~5个脐血CD34~+细胞单独(单移植组)或与5.0×10~6个人脐带间充质干细胞共同(共移植组)输入经~(137)Cs 3.0Gy照射后的NOD/SCID小鼠体内,观察移植后6周内小鼠外周血象的变化情况.于移植后第6周处死小鼠,采用流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏及外周血人源细胞(hCD45~+)含量,并分别检测小鼠骨髓中人源淋巴系(CD3/CD19)、粒系(CD33)、单核系(CD14)、血小板(CD61)、红系(CD235a)等各系血细胞比例,比较间充质干细胞共移植对CD34~+细胞植入率的影响.结果 移植后3周,两组小鼠外周血象开始有不同程度恢复;移植后6周,共移植组外周血白细胞和血小板计数均已达高峰,明显高于单移植组(P<0.05),两组小鼠的红细胞计数差异无统计学意义(P>0.05).移植后6周,共移植组骨髓及外周血中人源细胞hCD45~+CD34~+比例分别为(42.66±2.57)%和(4.74±1.02)%,明显高于单移植组的(25.27±1.67)%和(1.19±0.54)%(P=0.006).移植后6周,共移植组小鼠骨髓内的CD19~+、CD33~+、CD14~+、CD61~+和CD235a~+细胞比例均明显高于单移植组(P<0.05),CD3~+T淋巴细胞比例明显低于单移植组(P=0.003);CD19~+B淋巴细胞得到优势扩增,明显高于其他各系血细胞比例(P<0.05).结论 脐带间充质干细胞与脐血CD34~+细胞共移植可促进造血干细胞的植入,缩短CD34~+细胞移植后造血恢复时间.     

老年和青年C57BL/6J小鼠外周血及免疫细胞分型测定分析

目的比较观察老年C57BL/6J小鼠与年轻C57BL/6J小鼠外周血及免疫系统相关指标的差异。方法 19月龄和2月龄的C57BL/6J小鼠分别取材检测外周血细胞计数、免疫脏器指数和外周血免疫细胞分型。结果与年轻小鼠比较,老年小鼠外周血中红细胞和血小板计数升高,中性粒细胞比例升高,淋巴细胞比例下降(P0.001),CD4~+细胞比例明显降低(P0.001),胸腺指数明显降低(P0.001)。结论老年小鼠血细胞发生分化偏移,辅助性T细胞数量下降,与年轻小鼠有明显差异,与人造血免疫老龄化改变类似。本项研究为免疫衰老相关问题研究提供基础数据。     

骨髓干细胞输注修复放疗免疫抑制的动物实验

目的 探讨骨髓干细胞 (bone marrowstem cell, BMSC) 对放疗所致免疫抑制小鼠的修复作用, 为干细胞用于临床修复放化疗后免疫抑制的患者提供一定的理论依据.方法 选择雌性BALB/C小鼠, 随机分为实验组、对照组和空白组, 实验组和对照组的每只小鼠经照射剂量为8 Gy的6 MV直线加速器X线照射, 随后实验组小鼠通过尾静脉输注小鼠骨髓干细胞1×107个, 0.2 m L, 对照组小鼠通过尾静脉输入0.2 m L生理盐水, 空白组小鼠不做任何处理.于移植后第15、25、35天用血细胞分析仪检测外周血血常规, 流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群 (CD3+、CD4+、CD8+) 、ELISA试剂盒检测血清免疫球蛋白Ig M变化情况, 并观察生存状态和存活率.结果经放疗所致免疫抑制的小鼠经骨髓干细胞输注后35 d存活率为80%, 未经输注的小鼠35 d存活率为10%;放疗后小鼠经骨髓干细胞输注后外周血白细胞数、淋巴细胞比例及CD3+T细胞亚群较未经输注干细胞的小鼠高 (P<0.05) ;在骨髓干细胞移植后第15天, CD4+%、CD8+%和免疫球蛋白Ig M最低, 随后逐渐升高 (P<0.05) ;骨髓干细胞移植后能降低免疫抑制小鼠外周血单核细胞比例及CD4+/CD8+比值 (P<0.05) .结论 骨髓干细胞的输注能够修复免疫抑制小鼠的免疫功能, 这为干细胞用于临床修复放化疗所致的免疫抑制的病人提供了一定的实验基础和理论依据.     

北沙参对免疫抑制C57BL/6J小鼠T淋巴细胞亚群影响的实验研究

目的研究北沙参超临界二氧化碳(SFE-CO2)萃取物对免疫抑制C57BL/6J小鼠T淋巴细胞亚群的影响。方法将实验用C57BL/6J雌性小鼠32只,随机分为空白组、模型组、北沙参SFE-CO2萃取物低、高剂量组,每组8只。第7天处死小鼠,眼静脉取血,EDTA抗凝,血球计数仪自动检测WBC、RBC、PLT;流式细胞术检测,计算T细胞亚群绝对数量。结果北沙参SFE-CO2萃取物可显著提高免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血中WBC、PLT、CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞的绝对数量。结论北沙参SFE-CO2萃取物对免疫抑制C57BL/6J小鼠外周免疫系统有较显著的恢复作用。     

间充质干细胞联合NK细胞输注抑制DC减轻aGVHD

【目的】 观察骨髓MSC联合NK细胞输注对小鼠异基因骨髓移植后aGVHD的影响,初步探讨其作用机制?【方法】 分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,体外培养MSC;取C57BL/6小鼠脾脏细胞,磁珠分选NK细胞;建立C57BL/6→BALB/c小鼠异基因骨髓移植模型,接受移植小鼠随机分为4组,每组10只小鼠,MSC和NK细胞移植组,MSC移植组,NK细胞移植组和培养基对照组?根据aGVHD分值,肝?脾?小肠aGVHD病理损害和平均存活时间,评价aGVHD的程度?ELISA法检测小鼠血清中IFNγ和IL-12的含量?流式细胞术检测受鼠脾脏细胞CD11c和CD86的表达情况?【结果】 根据GVHD分值,肝?脾?小肠aGVHD病理损害和平均存活时间综合评价,与培养基对照组比较,MSC联合NK细胞移植组,MSC移植组和NK细胞移植组,发生aGVHD的程度均减轻,以MSC联合NK细胞移植组减轻最为明显?IFNγ的含量,NK细胞组明显高于MSC联合NK细胞移植组,MSC移植组和培养基对照组?IL-12的含量,MSC联合NK细胞移植组低于NK细胞移植组和培养基对照组,MSC移植组低于培养基对照组?脾脏DC细胞的含量,MSC联合NK细胞移植组未成熟DC(CD11c+CD86-)和成熟DC(CD11c+CD86+)均低于MSC移植组,NK细胞组和培养基对照组?【结论】 MSC联合NK细胞输注降低DC细胞数量,减轻aGVHD,延长小鼠生存时间?     

-半乳糖神经鞘胺醇诱发小鼠流产机制的初探

目的 利用 -半乳糖神经鞘胺醇( -galactosylceramide, -Galcer)诱发性C57BL/6J小鼠流产模型,初步探讨NKT细胞活化与C57BL/6J小鼠流产的关系。方法 孕7d和孕10d C57BL/6J小鼠,每组8只腹腔注射 -Galcer,72h后处死鼠剖腹探察胚胎数量。于0h和24h取胎盘淋巴细胞,流式细胞术检测CD3+NK1.1+细胞百分率和CD69+CD3+NK1.1+细胞百分率,ELISA方法检测 -Galcer处理不同时间血清孕酮（P）水平,并做子宫胎盘免疫组化切片观察。结果 C57BL/6J小鼠可由 -Galcer引起流产。胎盘CD3+NK1.1+淋巴细胞在0,24h分别为（2.96±0.22）%和（4.17±0.67）%,CD69+CD3+NK1.1+细胞百分率分别为（6.54±1.13）%和（82.45±5.85）%。ELISA方法测得血清P浓度为（0.15±0.01） ng/ml与对照组(1.28±0.03)ng/ml相比差异有显著性。胎盘子宫免疫组化切片显示 -Galcer处理组孕激素受体（PR）表达明显强于对照组。结论 -Galcer可诱发C57BL/6J小鼠流产,NKT细胞的活化及其分泌的细胞因子可能是导致流产的主要原因。     

骨髓间充质干细胞移植重建极重度放射损伤小鼠造血功能

目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cell,mMSC)单独输注对重度放射损伤小鼠造血功能重建的影响.方法:将体外培养扩增的雄性C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞输注给受致死剂量全身照射(8 Gy)的雌性C57BL/6小鼠,检测移植后外周血象、骨髓有核细胞数、病理变化、粒-单核细胞系祖细胞集落(CFU-GM)计数及性染色体比例,以未输注MSCs的小鼠作对照.结果:对照组小鼠(n=6)在照射后20 d内全部死于造血功能衰竭;MSCs组移植后血象明显下降,但2周后迅速恢复,28 d时恢复到照射前的60%左右,42 d外周血象基本恢复.MSC促进骨髓有核细胞数及CFU-GM快速恢复,有利于骨髓组织学的明显恢复改善.移植后42 d,仍可在受致死量照射的受体鼠内检测到供体MSC,但不能长期植入.结论:小鼠骨髓间充质干细胞单独输注可促进重度放射损伤小鼠的造血功能恢复,其植入时间长短可能与输注的细胞量有关.     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2在T细胞发育过程中的表达及其对哮喘发病的潜在作用

目的 探讨肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)在T细胞发育过程中的表达及作用,分析其在哮喘发病中的潜在作用。方法 选择C57BL/6J雌性野生型(WT)小鼠、C57BL/6J雄性TIPE2基因敲除(Tipe2^-/-)小鼠、C57BL/6J雄性绿色荧光蛋白敲入(Tipe2^gfp/+)小鼠为研究对象。取WT和Tipe2^gfp/+小鼠结肠组织和胸腺组织,获取肠道固有层淋巴细胞(LPLs)和胸腺细胞,采用流式细胞术检测结肠组织CD45^-细胞、CD45⁺细胞及双阴性(DN)T细胞、双阳性(DP)T细胞、CD4⁺T细胞和CD8⁺ T细胞中TIPE2的表达。取WT和Tipe2^-/-小鼠外周血、脾脏和肠系膜淋巴结,采用流式细胞术检测外周血、脾脏和肠系膜淋巴结中CD4⁺和CD8⁺T细胞水平。将10只Tipe2^gfp/+小鼠随机分为对照组和哮喘组,每组5只。...     

移植前输注供体细胞的小鼠单倍体相合骨髓移植实验

目的建立小鼠非清髓性单倍体相合骨髓移植模型,探讨移植前输注供体细胞的造血干细胞植入效果。方法以CB6F1雌性小鼠为受鼠,C57BL/6雄性小鼠为供鼠,移植前3d经尾静脉输注供鼠脾细胞或骨髓细胞3×107,输注细胞后24h和48h分别通过腹腔注射阿糖胞苷0.015g/d,移植前1d予450cGy全身照射（TBI）,移植当天输注供鼠骨髓有核细胞5×107/只。监测受鼠白细胞恢复、Y染色体性别决定基因（SRY）以及外周血供鼠CD3＋细胞嵌合状态。结果单纯给予TBI小鼠均存活,且移植后30d白细胞恢复正常,TBI＋骨髓细胞移植（TBI＋BMT）组移植后14、30、60d时外周血SRY基因PCR检测结果均阳性,60d供体CD3^＋细胞嵌合率达54.4%。移植前输注供体脾细胞组嵌合率最高,移植后60d达93.5%±4.8%,优于移植前输注供体骨髓细胞组（P〈0.05）。结论 450cGy TBI的非清髓性预处理可以成功建立非清髓性单倍体相合骨髓移植模型,移植前输注供体脾细胞可促进造血干细胞植入。     

中波紫外线照射延长同种皮肤移植存活

目的 :探讨中波紫外线 ( UV- B)照射延长同种皮肤移植存活机制。方法 :雄性 BALB/c小鼠为受体 ,C57BL/6J小鼠为供体 ,建立同种皮肤移植模型 ,观察 UV- B照射同种皮肤移植存活时间 ;采用 3 H- Td R掺入法和流式细胞仪 ( FACS)来检测受体胸腺淋巴细胞增殖反应和脾脏 T细胞亚群变化。结果 :与对照组相比 ,UV- B照射组同种皮肤移植存活时间明显延长 ( P<0 .0 1 ) ;淋巴细胞增殖反应出现延迟 ,CD4+ 和 CD8+ 细胞增高也延迟。结论 :UV- B照射可能通过抑制移植皮肤内抗原递呈细胞 ( APC)的活性 ,使辅助性 T淋巴细胞 ( TH)活化受到抑制 ,从而阻断直接致敏途径 ,使皮肤移植存活时间延长。     

骨髓间充质干细胞在博莱霉素致小鼠肺损伤的疗效观察

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)对博来霉素致小鼠肺损伤动物模型的疗效。方法体外分离、培养雄性6周C57BL/6J小鼠间充质干细胞。15只雌性8周C57BL/6J小鼠随机分为3组:阴性对照组(P组),阳性对照组(B组),BMSCs治疗组(B+M组,每组5只)。P组于气管内注入PBS 50μL,B组及B+M组按5μg/g剂量气管内注入博莱霉素50μL制备肺纤维化模型,B+M组于造模后6 h经尾静脉注射BMSCs 1×107/mL,200μL。实验第28天统一处死小鼠,留取肺组织行病理HE染色、羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量测定,提取肺组织的DNA,通过聚合酶链反应(PCR)-琼脂糖电泳法检测雄鼠的性别决定基因(sry基因),以判断外源给予的BMSCs是否在雌性小鼠肺组织中存在。结果①肺组织病理:B+M组的肺泡炎及肺纤维化程度均较B组减轻。②HYP含量:B组的HYP含量明显高于P组及B+M组,B+M组的HYP含量与P组无明显差异。③B+M组有雄性小鼠的sry基因存在。结论①外源性BMSCs经尾静脉注射可以到达肺损伤部位;②外源性BMSCs可以减轻肺泡炎、肺纤维化的程度。     

骨髓间充质干细胞对肾缺血再灌注损伤后肾功能及氧化应激水平的改善作用

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）促肾缺血再灌注损伤修复的能力,为肾脏疾病治疗提供新的思路。 方法：健康3周龄C57BL/6J小鼠的骨髓细胞悬液进行BMSCs体外扩增培养。8周龄C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、平行对照组和细胞移植组,每组16只小鼠。建立肾缺血-再灌注损伤模型,将BMSCs通过尾静脉注射到细胞移植组小鼠中,平行对照组注射生理盐水。检测肾功能指标血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平变化、损伤肾组织自由基--羟自由基和超氧阴离子自由基变化和肾形态学变化。结果：①分离培养的BMSCs增殖旺盛,纯度较高,且均质性和稳定性好。②平行对照组小鼠整体状态差,肾功能指标、氧化应激指标明显升高,组织形态学出现肾小球崩解,肾小管结构消失,肾间质见大量炎性细胞浸润。而细胞移植组小鼠整体状态良好,肾功能指标和氧化应激指标得到明显改善（P<0.05）,组织形态学未出现明显病理性改变。结论：BMSCs在体外易分离培养,具有旺盛的增殖能力;移植BMSCs后,通过抑制氧自由基的生成来促进肾缺血-灌注损伤后小鼠的恢复。     

融合基因重组卡介苗对肿瘤的抑制作用

目的 研究EB病毒基因BZLF1 和LMP2 融合基因重组卡介苗(recombinant BCG, rBCG)对肿瘤的抑制作用。方法 建立EB病毒阳性肿瘤(NPRC18)荷瘤小鼠(C57BL/6J)模型,根据注射的药物不同,分为rBCG组、BCG组、转pMV261载体BCG组(pMV261+ BCG)、PBS组。采取颈背部皮下多点注射方式进行免疫,对荷瘤小鼠肿瘤重量、成瘤时间、存活情况进行分析,C57BL/6J小鼠肿瘤抑瘤实验结束后,将小鼠的肿瘤裂解后用流式检测CD4⁺T、CD8⁺T细胞增殖情况,HE染色分析小鼠肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况;使用统计学软件SPSS 19.0对rBCG抑瘤效果进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。结果 重组BCG组分别用BZLF1和LMP2一抗杂交后,出现杂交目的蛋白,其蛋白质分子量约为70 KD,与对照相比,重组卡介苗对肿瘤抑制作用明显,小鼠成瘤时间延迟,平均成瘤时间约22 d,与对照PBS注射组8 d相比,其差异均有统计学意义(P ≤0.01);PBS组肿瘤重量为6.8 g,重组BCG组肿瘤重量为1.01 g,抑瘤率约为81%。经流式分析,重组BCG组产生的CD4⁺T、CD8⁺T细胞高于对照组。与对照组相比,rBCG延长了小鼠的生存时间,延缓了肿瘤生长和形成时间。结论 重组卡介苗在小鼠体内对肿瘤细胞具有抑制作用。     

异基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞小鼠移植后嵌合体形成及免疫耐受检测

目的:探讨器官移植中脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞诱导免疫耐受的可能性.方法:20只C57BL/6小鼠经致死量射线照射后随机等分为2组,实验组移植C57BL/6小鼠骨髓细胞和BALB/c小鼠脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,对照组仅移植C57BL/6小鼠骨髓细胞,以CM-DiI荧光染料示踪脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞的体内分布情况,并以PCR方法检测Y染色体的存在以进一步鉴定.以皮肤移植实验观察脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植小鼠对供体来源组织器官移植物的反应性,以未移植Flk1 CD31-CD34-细胞小鼠为对照.结果:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞可进入并较长期(30 d)存在于异基因小鼠免疫器官内;在细胞移植组小鼠脾脏组织中可检测到供体来源T细胞占受体脾细胞的6.68%;脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植组小鼠供体来源皮肤移植物存活＞90 d,未处理组为8～9 d.结论:异基因脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞移植后可形成稳定嵌和体,并诱导特异性免疫耐受的产生.     

前房相关免疫偏离中调节性T细胞的变化

目的：探索前房相关免疫偏离（ACAID）机制中调节性T细胞的变化,为进一步研究其具体机制创造条件。方法：将C57BL／6小鼠分为ACAID实验组、阳性对照组和正常组。实验组将2μL卵白蛋白（OVA,50mg／mL）前房注射,阳性对照组和正常组以2μL PBS行前房注射,7d后实验组和阳性对照组足底皮下免疫OVA100μL（2．5mg／mLOVA与CFA等体积充分乳化）,正常对照组不予处理。14d后检测耳廓迟发型超敏反应（DTH）,流式分析脾细胞中CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞以及CD8^＋Foxp3CF细胞的数量和比例。结果：DTH结果显示,实验组的耳廓肿胀值较阳性对照组明显减小。CD4＋CD25＋Foxp3CF细胞和CD8^＋Foxp3q^＋细胞比例较阳性对照组和正常组均升高。结论：CD4^＋CD25＋Foxp3^＋T细胞和CD8^＋＋Foxp3^＋＋T细胞在ACAID机制中发挥重要作用。     

蝎毒素对小鼠多种免疫细胞活化的影响

目的:探讨东亚钳蝎毒素(BMK IA)对小鼠体内多种免疫细胞活化的影响.方法:C57BL/6小鼠48只,随机数字表法分为空白对照组和实验组,每组分为4批,每批6只,各检测一种免疫细胞.实验组小鼠一次性静脉注射0.004 mg/kg的BMK IA,对照组给予等体积的生理盐水.流式细胞术分别检测2组小鼠给药0、2、8、12...     

黄芪在同种移植排斥中对CD4+ CD25+ T细胞及Foxp3的影响

探讨黄芪(AST)在同种移植排斥中对CD4+CD25+T细胞动态变化及Foxp3表达的影响。方法：C57BL/6和BALB/c小鼠分别为供体和受体,建立皮肤移植模型。对照组：术后注射生理盐水;AST组：术后给予黄芪注射液;AST+脾细胞(SP)组：术前输注供体鼠脾细胞,术后给予黄芪注射液,CsA+SP组：术前输注供体鼠脾细胞,术后给予环孢素A（CsA）。术后逐日观察移植皮肤存活情况及小鼠一般状况;免疫荧光染色流式细胞术检测脾组织中CD4+CD25+T细胞动态变化;RT PCR检测Foxp3mRNA表达情况。结果：与对照组相比,AST组、AST+SP组、CsA+SP组移植皮片存活时间明显延长（P＜0.05）,移植后14?d,CD4+CD25+T细胞数量及Foxp3的相对表达量显著增多（P＜0.05）。结论：黄芪体内用药可延长同种移植物的存活时间,上调CD4+CD25+T细胞及Foxp3的活性。